PHÙNG đức ANH THEO dõi một số CHỈ số HUYẾT học TRONG QUÁ TRÌNH TRƯỚC và SAU GHÉP tế bào gốc tạo máu tự THÂN điều TRỊ BỆNH NHÂN NHƯỢC cơ tại BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN đội 108 LUẬN văn THẠC sĩ dược học

Kết quả phân tích sự thay đổi của một số chỉ số huyết học trong quá trình theo dõi ở các thời điểm trước và sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ……….... Kết quả khảo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HOÁ SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Thị Lập PGS TS Nguyễn Thị Minh Phương

HÀ NỘI 2022

để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Thị Lập

PGS TS Nguyễn Thị Minh Phương

Những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong

Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và đóng góp những ý kiến quý báu để luận văn được thành công

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, động viên, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn trong cuộc sống

để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập của mình

Hà Nội, ngày 18 tháng 4 năm 2022

Học viên

Phùng Đức Anh

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh nhược cơ……….……….3

1.1.1. Định nghĩa bệnh nhược cơ 3

1.1.2 Dịch tễ học 3

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh 3

1.1.4 Chẩn đoán bệnh nhược cơ 6

1.1.4.1 Triệu chứng lâm sàng 6

1.1.4.2 Triệu chứng cận lâm sàng 7

1.1.5 Điều trị bệnh nhược cơ 7

1.2. Các loại tế bào gốc của tủy xương và ứng dụng trong điều trị bệnh nhược cơ……….……….………….10

1.2.1 Đại cương tế bào gốc 10

1.2.2 Các loại TBG của tủy xương 11

1.2.2.1 TBG tạo máu (HSC)……….12

1.2.2.2 Vai trò của HSC trong sửa chữa, tái tạo tổ chức……….15

1.2.2.3 Tế bào gốc trung mô (MSC) 16

1.2.3 Cơ chế tác động của tế bào gốc trong hỗ trợ điều trị bệnh

nhược cơ 17

1.2.4 Điều trị bệnh nhược cơ bằng phương pháp ghép tế bào gốc

tạo máu 18

1.3. Các chỉ số huyết học trong chẩn đoán và điều trị bệnh

nhược cơ 19

1.3.1 Bạch cầu hạt 19

1.3.2 Tiểu cầu 20

1.3.3 Chỉ số số lượng tế bào gốc CD34+ 21

1.3.4 Sự thay đổi của chỉ số huyết học, miễn dịch và cơ chế của HSCT 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu……….………24

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.1.3 Địa điểm và nơi tiến hành nghiên cứu 24

2.1.4 Thời gian nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… ……… 25

2.2.1 Phương pháp chọn mẫu 25

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.3 Phương pháp đếm tế bào gốc tạo máu CD34+ bằng máy phân tích tế bào dòng chảy flow cytometer 27

2.2.4 Phương pháp định lượng Acetylcholin receptor Ab 28

2.2.5 Thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO 30

2.2.6 Phương pháp đánh giá kết quả 32

2.2.6.1 Chỉ tiêu đánh giá 32

2.2.6.2 Chỉ tiêu nghiên cứu 32

2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

2.2.8 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu……… ……… 35

3.1.1 Đặc điểm về tuổi giới và chỉ số BMI của các bệnh nhân

nhược cơ 35

3.2 Kết quả phân tích sự thay đổi của một số chỉ số huyết học trong quá trình theo dõi ở các thời điểm trước và sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ……… 36

3.2.1 Kết quả khảo sát các chỉ số xét nghiệm công thức tế bào tủy xương trước gạn tách…… ……….36

3.2.2 Kết quả khảo sát chỉ số Acetylcholin receptor Ab sau ghép của

bệnh nhân nhược cơ….………37

3.2.3 Kết quả khảo sát một số chỉ số hóa sinh của bệnh nhân

nhược cơ……… 38

3.2.4 Kết quả khảo sát một số chỉ số huyết học trước và sau

gạn tách……… … 39

3.2.5 Kết quả khảo sát chỉ số bạch cầu WBC trong các giai đoạn của quy trình ghép tế bào gốc tạo máu tự thân ở 2 bệnh nhân điều trị bệnh

nhược cơ 42

3.2.6 Kết quả khảo sát chỉ số tiểu cầu PLT trong các giai đoạn của quy trình ghép tế bào gốc tạo máu tự thân ở 2 bệnh nhân điều trị bệnh nhược cơ 44

3.3 Kết quả đánh giá sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ thông qua một số chỉ số huyết học và chất lượng cuộc sống theo thang điểm quality of life (QoL) của WHO……….…… 46

3.3.1 Kết quả khảo sát chỉ số bạch cầu hạt và chỉ số tiểu cầu ở các giai đoạn trước và sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhân nhược cơ 46

3.3.2 Kết quả khảo sát chỉ số bạch cầu hạt và chỉ số tiểu cầu ở các giai đoạn điều kiện, truyền TBG và theo dõi mọc ghép của bệnh nhân nhược cơ 47

3.3.3 Đánh giá chất lượng cuộc sống theo thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO……… ……… 49

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN……… 53

4.1 Về đánh giá kết quả của chỉ số TBG CD34+ và kết quả khảo sát sự

thay đổi của một chỉ số huyết học trong quy trình ghép TBG tạo máu tự thân

điều trị bệnh nhược cơ……….…… 53

4.1.1 Về kết quả khảo sát của chỉ số TBG CD34+ trước và sau gạn tách 53

4.1.2 Về kết quả khảo sát sự thay đổi của các chỉ số bạch cầu WBC và tiểu

cầu PLT trong quy trình ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh

nhược cơ 55

4.2 Về khảo sát kết quả thời gian theo dõi mọc ghép và đánh giá chất

lượng cuộc sống theo thang điểm quality of life (QoL)…… ……….57

4.2.1 Về khảo sát kết quả thời gian theo dõi mọc ghép từ chỉ số bạch cầu

NEUT và tiểu cầu PLT trong quy trình ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị

bệnh nhược cơ 57

4.2.2 Giá trị Acetylcholin receptor Ab sau ghép và xu hướng mọc ghép của

bệnh nhân nhược cơ 60

4.2.3 Đánh giá chất lượng cuộc sống theo thang điểm Quality of Life (QoL)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1: Thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO ………… ……30

Bảng 3.1 Đặc điểm của BN theo tuổi, giới, nghề nghiệp, chỉ số cơ thể

Bảng 3.8 Kết quả chỉ số bạch cầu WBC trong các giai đoạn của quy trình ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ………43

Bảng 3.9 Kết quả chỉ số bạch cầu PLT trong các giai đoạn của quy trình ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ………….…… 45

Bảng 3.10: Chỉ số bạch cầu NEUT và tiểu cầu PLT trước và sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhân nhược cơ………46 Bảng 3.11 Kết quả chỉ số bạch cầu hạt và chỉ số tiểu cầu ở các giai đoạn điều kiện, truyền TBG và theo dõi mọc ghép của bệnh nhân nhược cơ……….48

Bảng 3.12 Thời gian mọc mảnh ghép của bệnh nhân nhược cơ…………49 Bảng 3.13: Bảng điểm đánh giá chất lượng cuộc sống Quality of Life (QoL) của bệnh nhân nhược cơ ……….50

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Kháng thể kháng thụ cảm thể Acetylcholin ……… ………… 4

Hình 1.2 Khả năng tự làm mới của tế bào gốc……… ….…10

Hình 1.3: Quá trình hoạt động của tế bào gốc……… ….11

Hình 1.4: Một số tế bào gốc……… ….12

Hình 1.5: Khả năng biệt hóa của tế bào gốc tạo máu và tế bào đệm tủy xương……….… 13

Hình 1.6: Khả năng biệt hóa in-vitro của MSC……….… 17

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu……….…… 26

Hình 3.1 Kết quả khảo sát chỉ số Acetylcholin receptor Ab sau ghép của

bệnh nhân nhược cơ 1 (MG01) ……….……….………….37

Hình 3.2 Kết quả khảo sát chỉ số Acetylcholin receptor Ab sau ghép của

bệnh nhân nhược cơ 2 (MG02) ……….……… 37

Hình 3.3 Kết quả khảo sát chỉ số bạch cầu WBC của bệnh nhân nhược cơ 1 (MG01)……….…….………….42

Hình 3.4 Kết quả khảo sát chỉ số bạch cầu WBC của bệnh nhân nhược cơ 2 (MG02)……….………… 42

Hình 3.5: Kết quả khảo sát chỉ số tiểu cầu PLT của bệnh nhân nhược cơ 1 (MG01)……… 44

Hình 3.6: Kết quả khảo sát chỉ số tiểu cầu PLT của bệnh nhân nhược cơ 2 (MG02)……….… 44

Hình 3.7 Kết quả thay đổi của chỉ số bạch cầu NEUT và chỉ số tiểu cầu PLT ……… 47

Hình 3.8: Đánh giá chất lượng cuộc sống Quality of Life (QoL) của WHO……….…… 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AchR Acetylcholine Receptor- AchR Các thụ cảm thể Achetylcholin

AIRE Autoimmune regulator Cơ quan điều hòa miễn dịch được

mã hóa bởi gen AIRE BMT Bone Marrow Transplant Ghép tủy xương

BPI Bactericidal

permeability-increasing protein

Protein tăng tính thấm

βFGF Basic fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào

sợi cơ bản bHLH Basic helix loop helix Chuỗi xoắn cơ bản loop helix BMI Body Mass Index Chỉ số khối cơ thể

BMP Bone morphogenic protein Protein di truyền hình thái xương

CCS Cell culture supernatants Chất nổi nuôi cấy tế bào

Tế bào tiền thân nội mạc

FGF Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào

sợi GDF Growth differentiation factor Yếu tố tăng trưởng khác biệt hóa

GVHD Graft Versus Host Disease Bệnh mảnh ghép chống ký chủ

mạn tính

HLA Human Leukocyte Antigen Hệ thống kháng nguyên bạch cầu

người HSC Haemopoietic Stem Cell - HSC Tế bào gốc tạo máu

HSCT Haemopoietic Stem Cell

Transplantation

Ghép tế bào gốc tạo máu

IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine 3-isobutyl-1- methylxanthin

LPR Low density lipoprotein receptor

related peptide

Peptit liên quan đến thụ thể lipoprotein mật độ thấp

MAPK Mitogen activated protein kinase Enzym kinase hoạt hóa mitogen

MS Multiple sclerosis Bệnh lý tự miễn của hệ thần kinh

như đa xơ cứng MSC Mesenchymal Stem Cell Tế bào gốc trung mô

NMO Neuromyelitis optica Viêm tủy – thị thần kinh

PDGF Platelet derived growth factor Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc

từ tiểu cầu PMN Polymorphonuclear neutrophils Bạch cầu trung tính

PTR Platelet Transfusion Refraction Khúc xạ truyền tiểu cầu

QoL Quality of life Chất lượng cuộc sống (CLCS)

SFM Serum free media Môi trường không chứa huyết

thanh

TGF-β Transforming growth factor beta Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng

beta Treg Regulatory T cell Tế bào T điều hòa

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

WISP Wnt-1 inducible protein Protein cảm ứng Wnt-1

Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu tìm ra những phương pháp điều trị mới thích hợp cũng như áp dụng những phương pháp mới, hiện đại mà trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả là một yêu cầu cấp thiết và mang tính khoa học cao Phương pháp sử dụng tế bào gốc để điều trị tổn thương các cơ quan, tổ chức nói chung và tổn thương hệ miễn dịch ở bệnh nhân nhược cơ nói riêng là một trong những hướng điều trị mới, hiện đại nhờ sự phát triển nhanh chóng của các ngành khoa học và công nghệ có liên quan, đặc biệt là lĩnh vực y sinh học về

tế bào gốc

Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa biệt hóa, không có chức năng chuyên biệt nhưng có tiềm năng biệt hóa cao Tùy theo nguồn gốc mà chúng có khả năng biệt hóa thành bất kỳ dòng tế bào mong muốn nào phụ thuộc vào điều kiện của môi trường nuôi cấy Do có những đặc tính quan trọng này mà tế bào gốc trở thành một lĩnh vực đầy hứa hẹn trong việc cung cấp nguồn tế bào cho điều trị các bệnh khiếm khuyết về mô, tế bào Kể cả khiếm khuyết về chức năng cũng như hình thái [4]

TBG có nhiều loại và có thể tìm thấy ở nhiều cơ quan, tổ chức khác nhau của người trưởng thành, kể cả trong phôi, bào thai Tùy theo mục đích sử dụng điều trị, TBG được thu gom chiết tách từ những nguồn đã được lựa chọn một cách thích hợp

Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu sử dụng TBG trong sửa chữa tái tạo các cơ quan tổ chức đang được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu Đã

có một số đề tài nghiên cứu khoa học thử nghiệm tiền lâm sàng và ứng dụng trên lâm sàng Trong đó, sử dụng các nguồn tế bào gốc trưởng thành đang được tập trung nghiên cứu, đó là các tế bào gốc về tủy xương, tế bào gốc máu cuống rốn,

tế bào gốc màng dây rốn và TBG trung mô từ mô mỡ đã đạt được một số kết quả Tuy nhiên cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về sử dụng tế bào gốc tạo máu tự thân trong điều trị bệnh nhược cơ được công bố Nhóm nghiên cứu TBG của bệnh viện TƯQĐ 108 (gồm các chuyên ngành huyết học- truyền máu, sinh học phân tử) đã chủ trì hoặc cùng tham gia nghiên cứu thực hiện nhiều đề tài theo hướng này Trong thực tế đã có một tỷ lệ nhất định BN nhược cơ, được điều trị

bằng TBG tạo máu tự thân, do số lượng còn quá ít chưa đủ đánh giá được hiệu quả của phương pháp này một cách xác thực nhưng cũng đã cho thấy đó là một phương pháp hoàn toàn có triển vọng, khả thi, thúc đẩy hồi phục và an toàn cho bệnh nhân

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài

“Theo dõi một số chỉ số huyết học trong quá trình trước và sau ghép

tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhân nhược cơ tại bệnh viện trung ương quân đội 108”

Đề tài gồm 2 mục tiêu:

➢ Mục tiêu 1: Phân tích sự thay đổi của một số chỉ số huyết học trong

quá trình theo dõi ở các thời điểm trước và sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân điều trị bệnh nhược cơ

➢ Mục tiêu 2: Đánh giá kết quả sau ghép tế bào gốc tạo máu tự thân

điều trị bệnh nhược cơ thông qua một số chỉ số huyết học, hóa sinh và chất lượng cuộc sống theo thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 BỆNH NHƯỢC CƠ

1.1.1 Định nghĩa bệnh nhược cơ

- Nhược cơ (MG): là một bệnh về rối loạn thần kinh cơ, được đặc trưng bởi

tình trạng yếu và mỏi cơ Bản chất của bệnh là tình trạng giảm số lượng các thụ thể acetylcholin (acetylcholin receptor – AchR) tại bản vận động cơ do sự tấn công của các kháng thể tự miễn vào các thụ thể này [30]

- Tình trạng yếu cơ thay đổi và xảy ra với một số cơ chủ động, nhất là các

cơ chi phối bởi các tế bào thần kinh vận động ví dụ như các cơ vận nhân, cơ nhai,

cơ mặt cơ nuốt và cơ nói

- Yếu cơ xảy ra khi cơ hoạt động liên tục và phục hồi khi nghỉ ngơi Sử dụng các thuốc kháng cholinesterase giúp phục hồi cơ lực nhanh

1.1.2 Dịch tễ học

Hà Lan (2004) tỷ lệ mắc bệnh là 22/218054242 người Na Uy (2001) là

453/64714284 người Anh (1998) tỷ lệ là 3171/176166666 người Ở Hy Lạp (2006) là 33/107286179 người Và ở Nagano Nhật Bản (2000) tỷ lệ là 178/41400000 [93]

Tỷ lệ mắc bệnh ở Việt Nam từ khoảng 0,5-5/100.000 người Bệnh có thể gặp

ở mọi lứa tuổi và cả 2 giới, nữ mắc bệnh nhiều hơn nam[11]

Bệnh thường gặp ở những người trong độ tuổi lao động nên việc chẩn đoán sớm và điều trị tích cực có ý nghĩa xã hội rất to lớn

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh

Nhược cơ là một bệnh tự miễn, bệnh thuộc thần kinh ngoại vi với tổn thương

cơ bản là tổn thương ở màng sau xi náp các khớp thần kinh cơ Các thụ cảm thể Achetylcholin (Acetylcholin Receptor- AchR) ở màng sau xi náp giảm cả về số lượng và chất lượng Acetylcholin (Ach) giải phóng ở màng trước xi náp không được tiếp nhận để tạo ra được điện thế hoạt động ở màng sau kích hoạt sự co cơ Các AchR ở màng sau xi náp bị tổn thương do tác động của các tự kháng thể kháng AchR theo cơ chế tự miễn dịch [30]

Hình 1.1 Kháng thể kháng thụ cảm thể Acetylcholin [30]

Các cơ sở sau để kết luận:

+ Có sự xuất hiện của kháng thể kháng lại AchR trong huyết thanh BN nhược

cơ Có tới 80% – 90% bệnh nhân nhược cơ có kháng thể này

+ Có sự lắng đọng IgG ở xi náp thần kinh- cơ cạnh các AchR Bằng các kỹ thuật miễn dịch, các nghiên cứu đã chứng minh các tự kháng thể có kháng nguyên đích chính là các AchR ở màng sau xi náp các khớp thần kinh cơ

+ Truyền huyết thanh BN nhược cơ cho động vật thí nghiệm gây ra các biểu hiện nhược cơ trên lâm sàng cũng như trên điện cơ đồ

+ Khi tiêm kháng nguyên AchR cho động vật thí nghiệm, đáp ứng miễn dịch

sẽ gây ra tình trạng nhược cơ

+ Khi dùng các thuốc ức chế miễn dịch hoặc lọc huyết thanh BN để loại bỏ các tự kháng thể kháng lại AchR, tình trạng bệnh giảm rõ rệt

Mặc dù tự kháng thể tham gia trực tiếp vào cơ chế bệnh sinh của bệnh nhược

cơ, song quá trình hình thành tự kháng thể trong bệnh nhược cơ là một quá trình phụ thuộc tế bào lympho T [32],[34]

Sự phá vỡ trạng thái tự dung nạp của tế bào lympho TCD4 với protein tự thân

là rối loạn đầu tiên trong bệnh sinh nhược cơ Các tế bào TCD4 đặc hiệu với AchR đóng vai trò quyết định trong hoạt hóa tế bào lympho B sản xuất và chế tiết kháng

thể kháng AchR ái lực cao

Tuyến ức là cơ quan lympho trung ương, nơi biệt hóa của tế bào lympho T Tuyến ức đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tự dung nạp của các tế bào lympho

T với các protein bản thân (tự kháng nguyên), cũng như trong đáp ứng của tế bào lympho với kháng nguyên lạ Mô tuyến ức ở bệnh nhân nhược cơ có nhiều các tế bào T trưởng thành hơn so với mô tuyến ức bình thường [31]

Hầu hết mô tuyến ức ở BN nhược cơ có mặt các tế bào lympho B có khả năng chế tiết kháng thể kháng AchR Cả hai loại tế bào lympho B và lympho T của tuyến ức đều đáp ứng với AchR hơn là các tế bào lympho của máu ngoại vi Các nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng tự kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhược cơ có u hoặc tăng sản tuyến ức cao hơn hẳn những BN tuyến ức bình thường hoặc thoái triển [33]

Tăng sản tuyến ức ở BN nhược cơ thường gặp là tăng sản thể nang Khoảng 90% BN nhược cơ có các tổn thương ở tuyến ức bao gồm tăng sản (70%) và u (20%) Thể tăng sản này có đặc trưng là sự xuất hiện các trung tâm mầm chứa nhiều tế bào lympho B Các tế bào lympho B tại đây, được các tế bào dạng cơ biểu lộ AchR bao quanh, trải qua nhiều quá trình siêu đột biến gợi ý sự tham gia của các trung tâm mầm này trong bệnh sinh của bệnh Nhiều yếu tố khác nhau cũng dẫn đến hiện tượng tự mẫn cảm với AchR tại tuyến ức ở các bệnh nhân nhược cơ Các trường hợp tuyến ức tăng sản ở BN nhược cơ được đặc trưng bởi

sự tăng biểu lộ các cytokine viêm, IFN, gen liên quan đến IFN, gen mã hóa MHC lớp II, các chemokine hấp dẫn tế bào lympho

Trong u tuyến ức, tế bào tuyến ức giảm biểu lộ yếu tố điều hòa đáp ứng tự miễn (autoimmune regulator – AIRE) Thiếu vắng các tế bào dạng cơ và không hoạt hóa thành công tế bào Treg (regulatory T cell) là những yếu tố gây phá vỡ trạng thái tự dung nạp Kết quả là các tế bào lympho T tự miễn đặc hiệu với AchR

có cơ hội hoạt hóa, kích hoạt đáp ứng tạo kháng thể kháng AchR trong bệnh tự miễn [11],[59],[12]

1.1.4 Chẩn đoán bệnh nhược cơ

Chẩn đoán bệnh nhược cơ cần sự phối hợp giữa lâm sàng và cận lâm sàng phù hợp, trong đó các phương tiện cận lâm sàng đóng vai trò quan trọng giúp chẩn đoán chính xác bệnh

Dựa vào các yếu tố sau, trong đó yếu tố 1 và 2 bắt buộc phải có

1 Biểu hiện nhược các nhóm cơ vân khác nhau: mức độ nhược cơ thay đổi trong ngày, tăng lên khi vận động và giảm đi khi nghỉ ngơi

2 Test prostigmin hoặc Tensilon dương tính

- Ghi điện cơ: điện thế hoạt động cơ đáp ứng giảm dần khi kích thích dây thần kinh lặp đi lặp lại

- Xét nghiệm tìm thấy các tự kháng thể kháng acetylcholin trong máu [12]

1.1.4.1 Triệu chứng lâm sàng

- Một đặc điểm nổi bật về triệu chứng lâm sàng của bệnh nhược cơ là: triệu chứng nhược cơ thay đổi trong ngày (chiều nặng hơn sáng, đỡ khi nghỉ ngơi và nặng lên khi vận động nhiều)

- Sụp mi: do bị nhược các cơ nâng mi, là triệu chứng khởi đầu ở khoảng 65% bệnh nhân, đôi khi có thể là triệu chứng duy nhất của bệnh Thường sụp mi ở cả hai mắt nhưng không đều nhau Các nếp nhăn ở trán xuất hiện sớm vì bệnh nhân thường

cố mở mắt và nhìn lên bằng các cơ trán Sụp mi thường kèm theo triệu chứng nhìn đôi, lác do các cơ vận nhãn cũng bị tổn thương Dấu hiệu sụp mi và nhìn đôi càng

- Các cơn khó thở: do nhược các cơ hô hấp, có thể diễn biến rất nhanh làm bệnh nhân bị suy hô hấp và dẫn đến tử vong

- Test prostigmin hoặc Tensilon (edrophonium): cho tiêm tĩnh mạch 2mg Tensilon, theo dõi 45 giây, nếu không có đáp ứng thì tiêm thêm 3mg, lại theo dõi 45 giây, nếu không đáp ứng thì tiêm nốt 5mg (tổng liều 10mg cho người lớn hoặc 0,2mg/kg

cân nặng ở trẻ em) Test dương tính khi thấy các triệu chứng nhược cơ giảm rõ rệt (thường xuất hiện trong vòng 30- 60 giây) và kéo dài khoảng 2-20 phút [12] Nếu không có Tensilon, thì có thể dùng neostigmin (prostigmin), tiêm bắp với liều 0,04mg/kg cân nặng, tác dụng xuất hiện sau 5-15 phút và đạt tối đa trong 1-2 giờ

Do Tensilon và prostigmin là các thuốc kháng cholinesterase nên có tác dụng ức chế hoạt động của các enzym này, làm cho các phân tử acetylcholin ở màng sau sinap thần kinh cơ bị chậm phá hủy, tạo điều kiện cho acetylcholin tác động được với các acetylcholin để gây khử cực ở màng sau sinap thần kinh cơ và gây co cơ

- Chụp CT scan, chụp MRI: xác định được các biến đổi về hình thái của tuyến ức

- Xét nghiệm tìm các tự kháng thể kháng acetylcholin trong máu: rất có giá trị trong chẩn đoán cũng như theo dõi và tiên lượng bệnh

1.1.5 Điều trị bệnh nhược cơ:

Các biện pháp điều trị bệnh nhược cơ hiện nay bao gồm:

- Cải thiện dẫn truyền thần kinh tại khớp thần kinh- cơ

- Ức chế hoạt động của hệ thống miễn dịch

- Làm giảm các kháng thể lưu hành trong máu

- Loại bỏ cơ quan mang kháng nguyên và sản xuất tự kháng thể

Bốn phương pháp trên thường được kết hợp với nhau trong quá trình điều trị Các biện pháp điều trị phối hợp thường sử dụng trong thực hành lâm sàng là: sử dụng các thuốc kháng cholinesteraza, sử dụng corticoid và các thuốc ức chế miễn dịch khác, tách loại huyết tương (plasmapheresis), điều trị bằng globulin miễn dịch, tia xạ và phẫu thuật cắt bỏ tuyến ức [11],[12]

❖ Ðiều trị triệu chứng

Nếu đang dùng các thuốc kháng cholinesterase mà nhược cơ nặng lên thì có thể ngừng tạm thời thuốc đó và cho thở máy, sau đó điều chỉnh liều

Chưa điều trị thì dùng thuốc kháng cholinesterase Các thuốc này làm giảm

sự phân hủy acetylcholin và gây tích lũy ở tấm vận động Các thuốc này có tác dụng kiểu muscarin và nicotin nên giảm liều khi đã có hô hấp nhân tạo để tránh làm suy hô hấp nặng thêm do thuốc Chủ yếu dùng prostigmin 1 mg tiêm bắp hay

tĩnh mạch lặp lại sau vài phút theo nhu cầu đồng thời tiêm bắp 0,25 mg atropin để giảm bớt tăng tiết nước bọt và dịch phế quản

Nếu hết suy hô hấp cấp thì thay bằng thuốc sau: Prostigmin (neostigmin), Mestinon (pyridostigmin), Mytelase (ambenonium), Tensilon (Edrophonium)

Ðiều chỉnh nước và điện giải: Bệnh nhược cơ nặng dễ bị mất nước vì tăng tiết nên phải bù dịch và năng lượng Chú ý tình trạng hạ kali làm nặng thêm bệnh nhược cơ (lưu ý điện giải đồ) Nếu cần thì cho thêm kali clorua 100-200mmol/ 24giờ, tốc độ truyền 4-8 mmol/giờ Trong mỗi lít có thể pha 50 -75 mmol (1g KCl

Dùng kháng sinh chống bội nhiễm lưu ý loại kháng sinh gây bloc thần kinh cơ

Có thể dùng thuốc chống thụ thai ở bệnh nhân lên cơn nhược cơ nặng lúc

<3000/mm3 thì ngưng điều trị) Lưu ý khi dùng corticoid đôi khi có suy hô hấp cấp đột ngột trong 3 ngày đầu (cảnh giác hạ K+) Sau khi hết suy hô hấp hay hết rối loạn nuốt thì duy trì liều tác dụng trong 1-3 tháng rồi chuyển sang điều trị cách

nhật trong 1-2 tháng Khi kết quả tốt thì giảm liều từ từ Có thể sử dụng ACTH 100

mg hoặc synacthen 1 mg tiêm bắp hoặc tĩnh mạch, 10 ngày sau có thể tiêm đợt 2 Sau đó củng cố bằng một liều ACTH hoặc synacthen chậm 3 tuần 1 lần Cyclosporin A (Cic A) ngăn cản sự sao chép RNAs thông tin cho các cytokin chìa khóa Liều 5mg/kg, nhưng do nó độc cho gan và thận, làm tăng huyết áp, run, rậm lông, giá lại cao nên là thuốc lựa chọn thứ hai

Các thuốc ức chế miễn dịch khác như cyclophosphamid và methotrexat thường dùng trong nhược cơ nặng khi điều trị corticoid không hiệu quả Thuốc được sử dụng là mycophenolat mofeti (CellCept) tác động lên chuyển hóa DNA Hiệu quả của nó chậm sau 3-12 tháng hoặc hơn Có hiệu quả 50%

Phẫu thuật cắt bỏ tuyến ức: Phẫu thuật cắt bỏ tuyến ức biện pháp tích cực khi có u hay loạn sản ở các bệnh nhân nhược cơ Thực hiện phẫu thuật sau gây tê tại chỗ Cắt bỏ tuyến ức toàn bộ mang lại hiệu quả lâu dài Nếu có sự xâm lấn của tuyến ức thì sau phẫu thuật tốt nhất phải chạy tia xạ hay hóa trị liệu Không phải là chỉ định tốt về phẫu thuật khi đối tượng là người già từ 70 tuổi trở lên, thể mắt đơn thuần, khi mà nhược cơ lâu năm đã gây tổn thương tấm vận động cơ vân không hồi phục Nhiều trường hợp sau phẫu thuật không cần dùng thuốc hoặc dùng liều thấp như vậy tránh được cơn nhược cơ nặng về sau Chú ý sau khi phẫu thuật một tuần mới sử dụng corticoid để tránh nhiễm trùng do giảm miễn dịch và để chóng lành sẹo

Nên giáo dục cho bệnh nhân biết những nguyên nhân gây nhược cơ nặng nhằm tránh xảy ra các biến chứng đáng tiếc

Mặc dù có sự phối hợp chặt chẽ giữa điều trị nội khoa và ngoại khoa một cách có hệ thống sử dụng các phác đồ ức chế miễn dịch kéo dài, nhưng vẫn có một tỷ lệ bệnh nhân không ít (20-40%), đáp ứng kém; không đáp ứng; thậm chí vẫn có xu hướng tiến triển nặng lên và tử vong Vì vậy việc nghiên cứu để tìm ra một giải pháp điều trị mới, ngoài những biện pháp nêu trên với số những bệnh nhân nhược cơ này là thực sự cần thiết có ý nghĩa khoa học và thực tiễn [11]

1.2 CÁC LOẠI TẾ BÀO GỐC CỦA TỦY XƯƠNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH NHƯỢC CƠ

1.2.1 Đại cương tế bào gốc

TGB là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hoá trong mô sống, chúng

có khả năng trở thành các tế bào chuyên hoá với các chức phận sinh lí Trong điều

kiện in vivo hay in vitro, mỗi tế bào gốc có thể tự làm mới với các tính năng riêng

biệt mới Chẳng hạn, các tế bào gốc tuỷ xương hoàn toàn chưa được chuyên hoá, chúng có thể biệt hoá thành các tế bào máu chuyên hoá (chẳng hạn tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu), và những kiểu tế bào mới này có các chức năng chuyên biệt, như khả năng sản xuất kháng thể, vận chuyển các chất khí mà trước đó tế bào gốc không hề có Do đó, một kiểu tế bào xuất thân có nguồn gốc từ một tế bào khác, thì tế bào khác đó cũng có thể được gọi là “tế bào gốc”

Tế bào gốc có hai đặc tính đáng chú ý nhất là:

- Tính tự làm mới (self - renewal): tế bào đó có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kì phân bào nguyên nhiễm, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hoá

Hình 1.2 Khả năng tự làm mới của tế bào gốc [23]

- Tính tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): tế bào đó có khả năng biệt hoá thành bất kì kiểu tế bào trưởng thành nào.Trên thực tế, đặc tính này chỉ đúng với các tế bào gốc toàn năng, hoặc vạn năng, tuy nhiên một tế bào gốc đa năng (hay tế bào tiền thân) cũng nhiều khi được gọi là tế bào gốc

Chu kỳ sống của TBG hoặc tế bào tiền thân là một quá trình được điều hoà bởi

5 hoạt động cơ bản: hoạt hoá, sinh sản, di chuyển, biệt hoá và tồn tại (hoặc chết theo chương trình) (Hình 1.2) [23]

Hình 1.3: Quá trình hoạt động của tế bào gốc [23]

Vào năm 2008, sau khi kết quả các công trình của Shinya Yamanaka (Đại học Kyoto của Nhật) và James Thompson (Đại học Wisconsin của Mĩ) được công

bố chính thức, cũng như thuyết tế bào gốc ung thư được nhiều nghiên cứu thẩm định, tế bào gốc được chia thành năm nhóm chính:

- Tế bào gốc phôi (thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ – Blastocyst)

- Tế bào gốc nhũ nhi (thu nhận từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, màng lót dây rốn

- Tế bào gốc trưởng thành (thu nhận từ cơ thể trưởng thành)

- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem cell iPS), có thể tạm hiểu là tế bào gốc phôi nhân tạo hay tế bào gốc nhân tạo, chúng có tiềm năng như

là các tế bào gốc phôi (loại tế bào gốc đã được tạo ra do có sự thao tác in vitro trên

chính bộ gene đã biệt hoá chức năng của chúng)

- Tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cell_CSC), được coi là nguồn gốc của khối u

và chúng chỉ có trong các khối u [4]

1.2.2 Các loại TBG của tủy xương:

Tủy xương là nơi cư trú của một hỗn hợp các TBG có khả năng tái tạo và biệt hóa khác nhau Các tế bào gốc của tủy xương chủ yếu thuộc loại tế bào gốc trưởng thành dòng soma [4],[25]

- TBG tạo máu (Haemopoietic Stem Cell - HSC)

- TBG trung mô (MSC)

- Tế bào tiền thân nội mạc (Endothelial stem/progenitor cells - EPC)

TBG tạo máu và TBG trung mô đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Ngoài

ra còn một số loại TBG khác hiếm gặp hơn và sự tồn tại của chúng vẫn còn đang

gây tranh cãi như: quần thể tế bào phụ (Side population – SP)

Khả năng biệt hóa, tính mềm dẻo của chúng là cơ sở cho những liệu pháp điều trị bằng TBG của tủy xương, chúng có thể được sử dụng để tái tạo nhiều cơ quan, tổ chức khác nhau: cơ, xương, sụn, cơ tim, thay thế tế bào tụy tạng

Các TBG của tủy xương trước hết đều mang đặc tính chung của TBG đồng thời có những đặc tính riêng, chuyên biệt cho từng loại TBG [4]

Hình 1.4: Một số tế bào gốc [4]

1.2.2.1 TBG tạo máu (HSC)

HSC là những TBG sinh ra các dòng tế bào máu và các tế bào miễn dịch, thay thế các tế bào máu già chết đi sau khi đã thực hiện hết chức năng, đảm bảo

duy trì sự hằng định của hệ thống huyết học miễn dịch của cơ thể HSC của người

có nhiều trong tủy xương, máu cuống rốn và máu ngoại vi Trong tuỷ xương khoảng 10.000 - 15.000 tế bào có nhân mới có 1 HSC thực thụ còn ở máu ngoại

vi khoảng 100.000 bạch cầu mới có 1 HSC [16]

Hình 1.5: Khả năng biệt hóa của tế bào gốc tạo máu và tế bào đệm tủy xương [80]

Hệ thống tạo máu từ lâu đã được coi là một hệ thống có tổ chức, có trật tự với những TBG tự tạo mới, đa năng ở giai đoạn đầu sau đó chuyển thành những

tế bào tiền thân (progenitor) ở giai đoạn trung gian và những tế bào đầu dòng (precursor) ở giai đoạn cuối Những tế bào đầu dòng này có thể phát triển và biệt hóa đến tận cùng tạo nên những tế bào máu trưởng thành với những chức năng chuyên biệt

HSC giống bạch cầu lympho cả về hình dáng và một số tính chất khi được nuôi cấy vì thế rất khó phân biệt và nhận ra chúng bằng hình thái học Một số protein bề mặt đặc trưng cho HSC của chuột và người gần tương tự nhau và đã lần lượt được phát hiện vào những năm 1980 - 1990

Những marker chủ yếu của HSC ở người gồm: CD34+, CD59+, CD 90, CD38+(), C-kit+() Những marker của HSC có bản chất là các protein bề mặt

có thể gắn với những kháng thể monoclonal đặc hiệu Hiện nay phân tử CD34 là

1 marker chủ yếu để xác định HSC [16]

TBG tạo máu có những đặc tính chủ yếu như sau:

- Có khả năng tự tái tạo: Trong tủy xương người bình thường, HSC phân chia và tạo ra những tế bào thay thế chúng, những tế bào mới sinh ra vẫn giữ nguyên đặc tính của nó Do đặc tính này nên chỉ một HSC cũng có khả năng thiết lập và duy trì tạo máu trong một thời gian dài Những kỹ thuật nuôi cấy làm tăng

số lượng và duy trì HSC không biệt hoá luôn luôn là mục tiêu quan trọng cho những nghiên cứu để có thể thu được một lượng HSC vô hạn cần thiết cho những ứng dụng của nó

- Có khả năng biệt hoá: HSC có thể biệt hóa thành các dòng tế bào máu khác nhau dưới tác dụng của những yếu tố phát triển (growth factor) và các cytokin Những yếu tố này tương tác với nhau hết sức phức tạp tạo nên một hệ thống kiểm soát về di truyền và điều phối tạo máu hoàn hảo, tinh tế Một HSC có thể sản xuất ra tất cả các dòng tế bào trong vòng 7 tuần và khoảng 30 HSC có thể

đủ để cứu con chuột đã bị chiếu tia liều chết, tái lập toàn bộ các quần thể tế bào của tuỷ xương Về khả năng biệt hóa của HSC, tính “mềm dẻo” (plasticity) là một khái niệm mới và HSC đang được nghiên cứu chứng minh HSC tủy xương có thể biệt hóa không những thành các tế bào máu mà trong những hoàn cảnh, điều kiện thích hợp nó còn có thể biệt hóa thành những loại TB khác Khả năng biệt hóa của HSC tủy xương bao gồm: Các tế bào cơ (gồm cả tế bào cơ xương và tế bào cơ tim), tế bào não, tế bào gan, tế bào da, tế bào phổi, tế bào thận, tế bào ruột và tế bào tụy HSC có thể thay đổi số phận để đáp ứng với những tín hiệu tái tạo từ tổ chức nếu cần thiết hiện tượng đó được cho là chuyển biệt hóa (transdifferentiation)

- Có thể di chuyển ra khỏi tuỷ xương đi vào máu tuần hoàn và ngược lại:

Ở người HSC có trong tủy xương nhưng chúng cũng có thể có cả ở tuần hoàn ngoại vi, ở lách và những tổ chức khác Vai trò vi môi của tủy xương, tổ chức đệm

và những phân tử kết dính của HSC chắc chắn hết sức quan trọng tuy nhiên cơ chế di chuyển của HSC và những yếu tố tác động tới quá trình này còn nhiều điểm chưa được biết rõ

- Có thể trải qua quá trình chết theo chương trình (apoptosis): trong tủy xương những tế bào máu được điều hoà bằng cơ chế di truyền, phân tử Những tín hiệu đặc biệt gây nên apoptosis của những HSC còn chưa được khám phá hết Thiếu tín hiệu duy trì sự sống từ tổ chức đệm của tuỷ xương có khả năng là một tín hiệu cho apoptosis Giả định này đã được chứng minh bằng một số thí nghiệm khi dùng các kháng thể phá những vị trí gắn kết của HSC vào tổ chức đệm đã làm cho apoptosis xảy ra sớm [15],[16]

1.2.2.2 Vai trò của HSC trong sửa chữa, tái tạo tổ chức:

Tổn thương tổ chức gây nên những biến đổi trong vi môi có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự tuyển mộ TBG và kích thích cho những TBG tuần hoàn chuyển biệt hóa Ở mức độ phân tử, điều hòa sao chép của những TBG tạo máu

có thể bị thay đổi trong đáp ứng với những tín hiệu từ vi môi tại chỗ, đặc biệt những yếu tố hướng tế bào về nơi cư trú, phát triển và biệt hóa được coi là những yếu tố tham gia vào chuyển số phận tế bào

Tế bào tiền thân nội mạc (EPC) của tủy xương có thể có nguồn gốc từ HSC, chúng cũng có tiềm năng biệt hóa tham gia vào tái tạo mạch máu, có vai trò trong hàn gắn, tái tạo tổ chức bị tổn thương [16]

❖ Ứng dụng của HSC

Với nhiều bệnh lý ác tính và không ác tính, bẩm sinh hoặc mắc phải của cơ quan tạo máu cũng như của các cơ quan tổ chức khác HSC đã được sử dụng rất hiệu quả như một nguồn tế bào cung cấp cho ghép để điều trị Nguồn HSC đã sử dụng bao gồm cả HSC của máu ngoại vi, tuỷ xương và máu cuống rốn kể cả trong ghép đồng loại và ghép tự thân phù hợp cho từng trường hợp có chỉ định Danh từ ghép tế bào gốc tạo máu đã được sử dụng chung rộng rãi và chính xác hơn cho tất

cả những trường hợp ghép sử dụng HSC Các ứng dụng chủ yếu gồm 4 nhóm bệnh

lý chính:

- Ghép HSC để điều trị những bệnh lý của cơ quan tạo máu

- Ghép HSC tự thân như một biện pháp giải cứu, điều trị hỗ trợ cho những bệnh nhân ung thư để có thể dùng hoá trị liệu hoặc xạ trị liều cao

- Ghép HSC đồng loài trong điều trị nhiều bệnh khối u của các tổ chức rắn như ung thư buồng trứng, phổi, vú, tiền liệt tuyến, đại tràng, ung thư đường mũi họng Trong trường hợp ghép đồng loài không những có tác dụng thay thế các HSC đã bị tổn thương mà còn có tác dụng diệt các tế bào ác tính của hội chứng mảnh ghép chống chủ (nhờ sự khác biệt về phức hệ hòa hợp tổ chức giữa người cho và người nhận)

- Sử dụng HSC trong điều trị những bệnh lý khác

+ Trong bệnh tự miễn: tế bào gốc được sử dụng với hy vọng thiết lập và chương trình hoá lại hệ thống miễn dịch

+ Có vai trò như một phương tiện chuyển gen

+ Được sử dụng trong điều trị hàn gắn, sửa chữa những tổn thương của tế bào, cơ quan, tổ chức dựa vào tính linh hoạt mềm dẻo của HSC

1.2.2.3 Tế bào gốc trung mô (MSC)

Bề mặt của MSC có các kháng nguyên CD105, CD73, CD90 và không

có các kháng nguyên CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79 hoặc CD19,

HLA-DR MSC bộc lộ nhiều marker nhưng không có một marker riêng biệt nào là đặc hiệu cho MSC Nhìn chung MSC người không có các marker của tế bào máu và tạo máu như CD45, CD34, CD14, CD11 và cũng không có phân tử kết dính CD31 (phân tử bám dính của tiểu cầu/tế bào nội mạc [PECAM-1]), CD18 (leukocyte function associated antigen-1 [LFA-1]), hoặc CD56 (neuronal cell adhesion molecule-1) nhưng có bộc lộ CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71, Stro-1, phân tử bám dính CD106 (vascular cell adhesion molecule [VCAM]-1), CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule [ALCAM]), phân tử bám dính giữa các tế bào [ICAM -1] và CD29 Kiểu hình miễn dịch của MSC (được công nhận là MHC I+, MHC II-, CD40- , CD80- , CD86-) được coi là không gây miễn dịch và vì thế có thể cấy ghép vào vật chủ dị gen mà không cần

ức chế miễn dịch [25]

❖ Đặc tính của MSC

Theo ủy ban tế bào gốc mô và trung mô của hiệp hội trị liệu tế bào (the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy - ISCT) thì 3 tiêu chuẩn tối thiểu xác định MSC của người là: 1) Khả năng bám dính vào bề mặt nhựa khi nuôi cấy

2) Biểu hiện những kháng nguyên bề mặt đặc hiệu

3) Khả năng biệt hóa in vitro thành osteoblasts, adipocytes và chondroblasts

Hình 1.6: Khả năng biệt hóa in-vitro của MSC [25]

1.2.3 Cơ chế tác động của tế bào gốc trong hỗ trợ điều trị bệnh nhược cơ

Cơ chế tác dụng của HSCT tự thân đối với các bệnh lý tự miễn dịch nói

chung và đối với bệnh nhược cơ nói riêng được thể hiện ở trên các mặt sau:

- Thứ nhất: ghép HCT tự thân thường đi liền với điều trị ức chế miễn dịch

Cơ chế điều hòa miễn dịch bằng điều trị ức chế miễn dịch: điều trị ức chế miễn

dịch mạnh như chiếu xạ toàn thân (TBI), cyclophosphamid (CY), kháng thể kháng

CD52 (anti-CD52, kháng thể kháng CD2 (kháng CD2)), fludarabin và kháng

globulin thymocyt (ATG) có thể loại bỏ phần lớn các tế bào T và B

- Thứ hai: tiêu hủy tế bào tự hoạt hóa Các tế bào T được ghép nhận biết kháng

nguyên dị loại và phá hủy các tế bào T và B còn lại

- Thứ ba: phá hủy tế bào T tự hoạt hóa và T hoạt hóa lập thể trong tuyến ức

Sự tác động này ảnh hưởng tới nhóm tế bào trình bày kháng nguyên, chính vì vậy

những tế bào mới được tạo ra sẽ có sự thay đổi so với những tế bào bệnh lý ban đầu

- Thứ tư: cảm ứng dị ứng và phá hủy các tế bào T tự hoạt hóa và hoạt hóa lập

thể ở ngoại vi Sự phong tỏa chi phối của CD40-CD154 và CD28-CD80-CD86 có

thể vượt qua rào cản tế bào T do đó nhanh chóng tạo ra sự dung nạp các tế bào lympho tự hoạt hóa phản ứng chéo

- Thứ năm: dung nạp các tế bào T tự hoạt hóa/ hoạt hóa lập thể ngoại vi bằng các tế bào T điều hòa Các tế bào T điều chỉnh CD4 + CD25 + liên quan đến việc duy trì khả năng chịu đựng đối với các kháng nguyên đặc hiệu của cơ quan cũng như các kháng nguyên dị lập thể Việc tiết IL-10 và TGF-β bằng các tế bào T điều hòa đã đóng vai trò trung gian cho quá trình này

- Thứ sáu: dung nạp các tế bào B tự sinh và tự hoạt hóa lập thể [32]

1.2.4 Điều trị bệnh nhược cơ bằng phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu

Thời gian đầu, người ta tin rằng những khiếm khuyết của bệnh tự miễn nằm trong HSC Những năm 1990, các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm chỉ ra các con chuột bị viêm khớp chỉ đáp ứng tốt với ghép tủy xương tự thân hoặc đồng loại Sau đó, các nghiên cứu về ảnh hưởng của HSCT tự thân hoặc tổng hợp đối với viêm não tủy tự miễn được chứng minh trên thực nghiệm Những nghiên cứu này chỉ ra rằng ghép HSC sau khi điều trị ức chế miễn dịch bằng TBI hoặc cyclophosphamid liều cao có tác dụng kiểm soát sự tiến triển của liệt trên chuột SJL hoặc chuột Lewis Sau ghép, động vật có khả năng kháng lại sự tái phát bệnh, điều này được chứng minh bằng các xét nghiệm mô học [98],[99]

Ghép TBG tạo máu (HSCT) được ứng dụng điều trị bệnh lý ác tính từ những năm 1950 Vào hai thập kỷ cuối của thế kỷ 20, HSCT được áp dụng điều trị bệnh

lý tự miễn của hệ thần kinh như đa xơ cứng (MS), bệnh đa dây thần kinh thị viêm mạn tính (CIDP), viêm tủy – thị thần kinh (NMO) nhược cơ (MG)

Có khoảng 10% BNMG kháng trị với các biện pháp điều trị thông thường Ứng dụng của HSCT trên BN MG đầu tiên trên thế giới được báo cáo là của Burt

và cộng sự vào năm 2004 BN nữ, 30 tuổi, kháng trị với các thuốc kháng men (Osserman giai đoạn IIB/III) được điều trị bằng ghép tế bào gốc dòng máu tự thân Sau 2 tháng ghép TBG, BN ổn định không có triệu chứng (Osserman giai đoạn 0) Theo dõi 6 tháng, không có các dấu hiệu bất thường liên quan đến HSCT Bryan và cộng sự tiến hành ghép TBG cho 7 bệnh nhân MG nặng, trong đó

có 1 BN nang lympho có triệu chứng nhược cơ Tuổi trung bình là ở thời điểm chẩn đoán nhược cơ và thời điểm được ghép TBG lần lượt là 37±11tuổi và 44±10 tuổi Năm BN có kháng thể kháng thụ cảm thể acetylcholin và 2 bệnh nhân có kết quả âm tính trong huyết thanh Bốn BN đã được cắt tuyến ức, không BN nào có u tuyến ức Thời gian theo dõi trung bình 40 tháng (29 – 149 tháng), các BN đều ổn định về triệu chứng

Harkansson và cộng sự nghiên cứu bệnh nhân được chẩn đoán nhược cơ nặng

từ năm 26 tuổi, kháng trị với corticosteroid, đã điều trị ức chế miễn dịch đường

uống, cyclophosphamid, rituximab và bortezomib Bệnh nhân được ghép TBG kết

hợp BEAM năm 63 tuổi Theo dõi sau 2 năm, mức độ bệnh giảm đáng kể với

thang điểm phức hợp MG giảm từ 64 xuống 6 điểm Triệu chứng nhược cơ duy

nhất còn tồn tại là song thị và BN không phải điều trị bất cứ thuốc nhược cơ nào

mặc dù kháng thể kháng acetylcholin trong huyết thanh vẫn tồn tại Không có tác

dụng phụ nào sau điều trị ghép TBG

Cho đến nay mới có 1 báo cáo về 1 trường hợp ghép tế bào gốc dị loại cho

bệnh nhân MG kháng trị nặng Sau ghép 40 tháng, BN chỉ còn ít triệu chứng nhược

cơ Tuy nhiên ghép TBG dị loại điều trị nhược cơ còn nhiều hạn chế do nguy cơ

tử vong và tái phát cao [32],[34],[45]

1.3 CÁC CHỈ SỐ HUYẾT HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ

BỆNH NHƯỢC CƠ

1.3.1 Bạch cầu hạt

Dòng bạch cầu hạt trung tính được sinh ra từ tiền thân là CFU - G Tế bào

đầu dòng có thể nhận dạng được bằng hình thái học là nguyên tủy bào (Myeloblast) Bạch cầu đoạn trung tính là tế bào trưởng thành thực hiện chức năng

Thời gian biệt hoá và trưởng thành từ một tế bào tiền thân (CFU - G) đến bạch cầu

đoạn trung tính mất khoảng 1-2 tuần Bạch cầu đoạn trung tính lưu hành trong máu

ngoại vi chỉ khoảng 1 ngày Sau đó, chúng xuyên mạch vào mô và sống thêm

khoảng 1-2 ngày Ở máu ngoại vi, số lượng bạch cầu đoạn trung tính đếm được

khoảng 4,0 - 11,0 x 109/l Số lượng chính xác của bạch cầu đoạn trung tính ở máu

ngoại vi khoảng gấp đôi số đếm vì một nửa bạch cầu đoạn trung tính nằm sát thành

mạch, không tham gia vào thành phần máu lưu hành Đường kính của tế bào

khoảng 10-12 μm Bạch cầu hạt ưa acid và bạch cầu hạt ưa base chiếm một tỷ lệ

nhỏ trong quần thể bạch cầu hạt Bạch cầu hạt ưa acid trưởng thành dễ nhận biết

bởi các hạt màu da cam trong bào tương và nhân thường chia hai múi Số lượng

bạch cầu hạt ưa acid trong máu khoảng 0,1-0,4 x 109/l và tồn tại khoảng 12 giờ

Đường kính tế bào 10-15μm Bạch cầu hạt ưa base thường ít gặp ở máu ngoại vi

hoặc với một tỷ lệ rất thấp trong một số trường hợp, nhất là bệnh lý tăng sinh tủy

ác tính Nhân thường chia hai đoạn, bào tương có vài hạt lớn bắt màu xanh tím trên

tiêu bản nhuộm Giemsa Đường kính tế bào khoảng 9-11 μm [8]

HSCT là một liệu pháp cứu cánh cho nhiều loại bệnh lý ác tính và không ác

tính Dấu hiệu đầu tiên của một HSCT thành công thường được coi là khi số lượng

bạch cầu trung tính tuyệt đối (ANC) duy trì> 500 Cả việc nuôi dưỡng và phòng ngừa bệnh mảnh ghép chống ký chủ mạn tính (GVHD) yêu cầu một chế độ điều hòa chuẩn bị, dẫn đến một giai đoạn ức chế miễn dịch đáng kể

Nhiễm trùng cơ hội dẫn đến tăng tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ở những người nhận ghép tủy xương BMT Điều quan trọng để tránh nhiễm trùng là phục hồi hệ thống miễn dịch chức năng với khả năng miễn dịch tế bào lympho T và B, bao gồm

cả chức năng qua trung gian tế bào và chức năng dịch thể Bạch cầu trung tính là những tế bào đầu tiên quay trở lại, là dấu hiệu của quá trình kết hợp và đại diện

cho sự trở lại ban đầu của khả năng bảo vệ in vivo Khi đạt đến số lượng bạch cầu

trung tính tuyệt đối (ANC) 500 ổn định, thường ngừng điều trị bằng kháng sinh; tuy nhiên, việc ngừng điều trị dự phòng bằng thuốc kháng sinh có thể không nhất thiết

là hợp lý, vì chức năng của các bạch cầu trung tính PMN mới được mọc ghép này vẫn chưa được biết

Nhiều nghiên cứu trên bệnh nhân HSCT ở người lớn đã chứng minh rằng những bạch cầu trung tính PMN sớm này không hoạt động đầy đủ và có thể vẫn bị rối loạn chức năng trong > 6 tháng Mặc dù rối loạn chức năng bạch cầu trung tính PMN ở người lớn đã được đặc trưng rõ ràng, nhưng nó vẫn chưa được đánh giá đầy đủ ở trẻ em Hơn nữa, sự khác biệt tiềm ẩn giữa HSCT ở trẻ em so với người lớn có thể liên quan đến sự khác biệt về cường độ của các chế độ điều trị, thường xảy ra hiện tượng tăng sinh tủy ở bệnh nhân nhi Nghiên cứu sau HSCT duy nhất

về chức năng PMN trên trẻ em chỉ tập trung vào hai protein dạng hạt azurophilic:

(i) Protein tăng tính thấm BPI và (ii) defensins Do đó, giả thuyết đã được đặt ra

rằng trẻ em có biểu hiện rối loạn chức năng bạch cầu trung tính PMN tối thiểu tại thời điểm tham gia và hơn thế nữa, điều này bị ảnh hưởng bởi nguồn tế bào gốc và chế độ điều hòa [101]

1.3.2 Tiểu cầu

Mỗi tiểu cầu không phải là một tế bào mà chỉ là một khối bào tương nhỏ hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 2-5 micromet Tiểu cầu hình thành do sự thắt lại rồi đứt rời ra từng mảnh bào tương của tế bào nhân khổng lồ (megacaryocyt) của tuỷ xương Tiểu cầu có thể tồn tại trong máu khoảng 5-9 ngày

Tiểu cầu có xu hướng kết đám lại với nhau Trên những phiến đồ máu thường thấy những đám tiểu cầu Vì thế sự xác định số lượng tiểu cầu tương đối khó khăn Ở người trưởng thành, trong 1 mm3 máu có khoảng 200.000-400.000 tiểu cầu Khi mạch máu bị tổn thương, gây chảy máu, các tiểu cầu giải phóng serotonin gây co rút tế bào cơ trơn thành mạch, làm cho máu thoát mạch chậm hoặc ngừng chảy máu Trong một số bệnh về máu, khi số lượng tiểu cầu giảm, dễ gây tình trạng xuất huyết

Truyền tiểu cầu là nền tảng của liệu pháp điều trị cho những bệnh nhân bị giảm tiểu cầu trong khi thực hiện ghép tế bào gốc tạo máu (HSCT) Nhiều bệnh nhân mắc chứng khúc xạ truyền tiểu cầu (PTR) yêu cầu tiểu cầu phù hợp với HLA Việc xác định sớm những bệnh nhân này có thể dẫn đến việc sử dụng tiểu cầu tốt hơn cũng như tăng số lượng tiểu cầu Một số công cụ trực quan đã được sử dụng để hỗ trợ nhóm ung thư học, ngân hàng máu và trung tâm hiến máu xác định những bệnh nhân này bằng cách hiển thị xu hướng giảm tiểu cầu cùng với mức kháng thể phản ứng (cPRA) được tính toán bằng bảng điều khiển

Theo nghiên cứu của William J Gordon (2017), Hơn 50.000 bệnh nhân được ghép tế bào gốc tạo máu (HSCT) trên toàn thế giới hàng năm, với gần 20.000 bệnh nhân được thực hiện chỉ riêng ở Hoa Kỳ Giảm tiểu cầu, có thể dẫn đến chảy máu

đe dọa tính mạng, là một biến chứng thường gặp của HSCT, và nhiều trong số 2 triệu đơn vị tiểu cầu được truyền hàng năm ở Hoa Kỳ được sử dụng cho những bệnh nhân bị giảm tiểu cầu khi đang điều trị HSCT Không giống như các sản phẩm máu khác, tiểu cầu có thời hạn sử dụng là 5 ngày, với ước tính khoảng 10–20% đơn vị tiểu cầu trở nên lỗi thời thay vì được truyền, tạo ra những thách thức

về hàng tồn kho Ngoài ra, truyền tiểu cầu có thể dẫn đến nhiều tác dụng phụ, bao gồm sốt phản ứng truyền máu không tan máu, phản ứng dị ứng phản vệ, tổn thương phổi cấp tính liên quan đến truyền máu, nhiễm trùng huyết và tan máu

Bệnh nhân nhạy cảm với kháng nguyên HLA có thể nhận được các tiểu cầu phù hợp với HLA, làm tăng cơ hội đáp ứng thích hợp với truyền máu Tuy nhiên, thực hành lâm sàng hiện nay là truyền các đơn vị tiểu cầu của người hiến ngẫu nhiên và đợi bệnh nhân nhạy cảm để chứng minh lâm sàng PTR dựa trên sự gia tăng số lượng tiểu cầu không đủ, có thể mất vài ngày và dẫn đến lãng phí các đơn

vị tiểu cầu Do đó, các chiến lược để xác định bệnh nhân nào có thể được hưởng lợi từ các tiểu cầu phù hợp với HLA không chỉ có thể cải thiện việc sử dụng tiểu cầu mà còn giảm thiểu tình trạng giảm tiểu cầu nguy hiểm, giảm các biến cố xuất huyết đáng kể Bệnh nhân HSCT thường bị mẫn cảm do kết quả của những lần truyền máu trước đó và sẽ có xu hướng giảm số lượng tiểu cầu về 0 trong vài tuần sau khi cấy ghép Vì vậy, Để cải thiện việc xem xét lâm sàng việc truyền tiểu cầu cho bệnh nhân đang điều trị HSCT, một số công cụ trực quan cho phép ngân hàng máu và trung tâm hiến máu xem xu hướng số lượng tiểu cầu của bệnh nhân cùng với ngày hóa trị liệu cảm ứng và truyền cấy ghép tế bào gốc đã được thiết kế Ngoài

ra, các công cụ sẽ tính toán cPRA dựa trên kháng thể HLA của bệnh nhân và hiển thị giá trị đó cho nhóm Mục tiêu rõ ràng của thiết kế là cải thiện được việc sử dụng các đơn vị tiểu cầu và tăng thời gian dành cho số lượng tiểu cầu 10 × 10 9 tế bào/L [103]

1.3.3 Chỉ số số lượng tế bào gốc CD34+

Tủy xương là nơi cư trú của một hỗn hợp các TBG có khả năng tái tạo và biệt hóa khác nhau: TBG tạo máu (Haemopoietic Stem Cell - HSC), TBG trung

mô (MSC), tế bào tiền thân nội mạc (Endothelial stem/progenitor cells - EPC), ngoài ra còn một số loại TBG khác hiếm gặp hơn và sự tồn tại của chúng vẫn còn đang gây tranh cãi như: quần thể tế bào phụ (Side population - SP) Trong số đó, TBG tạo máu và TBG trung mô đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi

Tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic stem cells) là những tế bào toàn năng,

có khả năng biệt hóa thành những tế bào đa năng để biệt hóa thành từng dòng tế bào máu riêng biệt Ghép tế bào gốc tạo máu là phương thức điều trị ngày càng được sử dụng nhiều để điều trị các bất thường gen, các rối loạn và bệnh lý ác tính của hệ tạo máu

HSC của người có nhiều trong tủy xương, máu cuống rốn và máu ngoại vi Trong tuỷ xương khoảng 10.000 - 15.000 tế bào có nhân mới có 1 HSC thực thụ còn ở máu ngoại vi khoảng 100.000 bạch cầu mới có 1 HSC

Những marker chủ yếu của HSC ở người gồm: CD34+, CD59+, CD 90, CD38+ (), C-kit+ () Những marker của HSC có bản chất là các protein bề mặt

có thể gắn với những kháng thể monoclonal đặc hiệu Hiện nay phân tử CD34 là

1 marker chủ yếu để xác định HSC

Các tế bào gốc tạo máu mang kháng nguyên CD34 trên bề mặt tế bào, do đó dấu ấn CD34 được xem là dấu ấn đặc hiệu cho tế bào gốc tạo máu và được sử dụng trong xét nghiệm đếm số lượng tế bào gốc tạo máu Đếm số lượng chính xác các

tế bào CD34 là cần thiết cho việc tính liều tế bào gốc phù hợp cho quy trình ghép

tế bào gốc [14]

1.3.4 Sự thay đổi của chỉ số huyết học, miễn dịch và cơ chế của HSCT

Cấy ghép tế bào gốc tạo máu tự thân (HSCT) đã được sử dụng như một phương pháp điều trị các bệnh tự miễn dịch nặng và khó trị liệu trong hơn 13 năm Về vấn đề này, tỷ lệ sống sót sau 5 năm tổng thể được báo cáo là 85% và tỷ

lệ sống sót không tiến triển là 43% là khả quan đáng ngạc nhiên Tỷ lệ tử vong liên quan đến điều trị không vượt quá 5% và thậm chí còn thấp hơn ở các trung tâm cấy ghép có kinh nghiệm Đây rõ ràng là những kết quả đáng khích lệ hỗ trợ các nghiên cứu sâu hơn về HSCT trên một số bệnh nhân mắc bệnh tự miễn được chọn lọc Kết quả tốt nhất đã được báo cáo cho bệnh nhân bị xơ cứng hệ thống, đa xơ cứng và lupus ban đỏ hệ thống, trong khi HSCT đối với bệnh viêm khớp dạng thấp

có tỷ lệ tái phát cao hơn Cần lưu ý rằng dữ liệu về HSCT đối với bệnh viêm khớp dạng thấp được thu thập chủ yếu trước thời đại của phương pháp điều trị sinh học

và kể từ khi ra đời thuốc đối kháng yếu tố α hoại tử khối u, HSCT đã bị loại bỏ rộng rãi trong bệnh này Hạn chế đáng kể nhất của cuộc khảo sát được trình bày là tính chất hồi cứu của nó, xử lý dữ liệu hồi cứu không đầy đủ trong một quần thể nghiên cứu không đồng nhất; sau đó được phản ánh bởi các chỉ định khác nhau

cho HSCT và sự đa dạng của các giao thức điều hòa được sử dụng Hạn chế này một lần nữa làm nổi bật nhu cầu cấp thiết về các thử nghiệm tiến cứu, có đối chứng, những thử nghiệm thực sự đang được tiến hành đối với một số bệnh tự miễn dịch [95],[96]

Mặc dù trước và sau HSCT có thể thấy các chỉ số về bạch cầu và tiểu cầu có

sự biến đổi tương đối rõ rệt Tuy nhiên sự thay đổi của các chỉ số miễn dịch, huyết học nói chung và tiểu cầu, bạch cầu nói riêng mới chỉ được theo dõi trên thực tế lâm sàng Sự biến đổi dựa trên cơ chế về sinh học phân tử vẫn chưa hoàn toàn được làm rõ Tuy đã ghi nhận thành công lâm sàng của HSCT trong các bệnh tự miễn,

cơ chế cơ bản chính xác của phương pháp điều trị này vẫn còn khó nắm bắt Rõ ràng, trong HSCT tự thân, gánh nặng đáng kể của tác nhân phản ứng tự động và các tế bào viêm được loại bỏ bằng cách điều hòa Hy vọng là thế hệ tế

bào lympho T tiếp theo của bệnh nhân sẽ được thiết lập lại đồng hồ miễn dịch, dẫn đến phục hồi khả năng dung nạp Việc truyền lại tế bào gốc tạo máu CD34 + chủ yếu được coi là để rút ngắn thời gian bệnh hơn là điều trị Điều này được hỗ trợ bởi các nghiên cứu cho thấy liệu pháp cyclophosphamid liều cao mà không cần truyền lại tế bào gốc vẫn có thể là một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh xơ cứng toàn thân

Có một số yếu tố có thể góp phần làm thuyên giảm bệnh trên lâm sàng bền vững hoặc thậm chí chữa khỏi ở một số lượng đáng kể bệnh nhân Sự kết hợp của hóa trị liệu gây độc tế bào lympho, chẳng hạn như cyclophosphamid và globulin kháng tế bào bạch cầu, dẫn đến giảm bạch cầu lympho sâu, kéo dài và làm giảm

liên tục mức độ tự kháng thể gây bệnh giả định Ngoài cơ chế ức chế miễn dịch không đặc hiệu này, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy HSCT tự thân cũng

có thể thiết lập lại khả năng dung nạp miễn dịch: (i) HSCT tự thân dẫn đến tăng số lượng tế bào T điều hòa, dương tính với FoxP3; (ii) sự kích hoạt lại chức năng của tuyến ức sau khi HSCT tự thân có khả năng dẫn đến một hệ thống miễn dịch mới non trẻ nhưng có khả năng chịu đựng Điều này được minh họa bởi các tế bào di

cư tuyến ức, được đặc trưng bởi các vòng tròn cắt bỏ thụ thể tế bào T (TREC) và biểu hiện CD31, thiết lập lại sự đa dạng của thụ thể tế bào T Trong những năm sau ghép HSCT, có thể có nhiều tiềm năng bệnh tự miễn sẽ không bị tái phát (iii) globulin kháng tế bào bạch cầu trực tiếp nhắm vào các tế bào huyết tương sống lâu, tự sản xuất kháng thể bằng cách ly giải qua trung gian bổ thể và quá trình chết theo chương trình

Tuy nhiên, tái phát hoàn toàn có thể xảy ra, có thể là do sự tồn tại của các tế bào tự phục hồi như tế bào huyết tương tồn tại lâu dài hoặc do không xuất hiện bệnh tự miễn ở một vật chủ dễ mắc bệnh Tái phát cũng có thể được tạo điều kiện thuận lợi bởi sự đa hình di truyền của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, hệ miễn dịch ngày càng được công nhận là đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tự miễn dịch và không phải là mục tiêu chính của HSCT [35], [45], [97]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bệnh án lưu trữ và BN nhược cơ mới chẩn đoán, được điều trị và theo dõi tại khoa Huyết học lâm sàng – Bệnh viện Trung ương quân đội 108 từ tháng 06/2021 đến tháng 05/2022

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

BN được chẩn đoán nhược cơ và thỏa mãn các tiêu chí sau:

- Đã phẫu thuật cắt tuyến ức

- Đã điều trị bằng các thuốc kháng men, corticoid và tách huyết tương theo phác

đồ không hiệu quả (điều trị đúng phác đồ tối thiểu 3 tháng nhưng không kiểm soát được triệu chứng nhược cơ)

- Thời gian điều trị sau phẫu thuật > 12 tháng

- Có đủ khám lâm sàng và xét nghiệm theo protocol nghiên cứu

- Có hồ sơ bệnh án lưu trữ với đầy đủ thông tin trong điều trị và theo dõi sau điều trị theo protocol nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- BN thuộc nhóm chống chỉ định ghép TBG tạo máu tự thân đối với nhược cơ

✓ Suy tạng: trước ghép TBG tạo máu tự thân cần đánh giá chức năng tim, phổi,

thận và đường tiêu hóa

+ Chống chỉ định với bệnh tim tiến triển (chức năng tâm thu thất trái < 40%; loạn nhịp thất không kiểm soát, dịch màng tim > 1cm)

+ Với bệnh thận: độ thanh thải creatinin < 30 mL/phút/m2

+ Với hô hấp: khả năng khuếch tán CO < 40% so với dự đoán, áp lực động mạch phổi trung bình > 50 mmHg hoặc lâm sàng, cận lâm sàng biểu hiện suy

hô hấp

+ Chảy máu tiêu hóa đang hoạt động

✓ Nhiễm khuẩn khó kiểm soát: Nhiễm khuẩn cấp hoặc mạn tính: HIV, nhiễm virus giảm lympho T type 1, 2; viêm gan virus B với kháng nguyên bề mặt dương tính hoặc viêm gan virus C PCR dương tính

- BN không đến khám theo lịch hẹn (quá 15 ngày)

- BN không có khả năng giao tiếp hoặc đối thoại trực tiếp

- BN từ chối phỏng vấn

2.1.3 Địa điểm và nơi tiến hành nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện tại Khoa Huyết học lâm sàng -Bệnh viện TƯQĐ 108

2.1.4 Thời gian nghiên cứu

-Thời gian thực hiện từ tháng 06/2021 đến tháng 05/2022

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu tiến cứu kết hợp với hồi cứu, mô tả cắt ngang, phân tích mối tương quan giữa trước và sau điều trị

2.2.1 Phương pháp chọn mẫu

Chọn mẫu thuận tiện, không xác suất, thu thập toàn bộ các bệnh nhân thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ tại Khoa huyết học lâm sàng- Bệnh viện TƯQĐ 108 được điều trị ngoại trú, thời gian từ 06/2021 đến tháng 05/2022 thõa mãn tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ Sau đó lấy vào nghiên cứu các bệnh án đủ tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ ở trên

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu

Điền các thông tin cần thiết của mỗi BN vào mẫu bệnh án nghiên cứu bao gồm tuổi, giới, triệu chứng lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng cần thiết để chẩn đoán xác định bệnh nhược cơ (MG) Nhập các số liệu về tuổi, giới, các chỉ số huyết học của BN trong các lần khám T0, T1, T4, T12, T24 và đánh giá sau điều trị vào phần mềm thống kê SPSS 22.0 để xử lý các số liệu và đưa ra các kết quả nghiên cứu

Quy ước:

- Lần khám thứ nhất gọi là T0 (lúc bắt đầu nghiên cứu)

- Lần khám thứ hai gọi là T1 (sau 1 tuần)

- Lần khám thứ ba gọi là T4 (sau 4 tuần)

- Lần khám thứ tư gọi là T12 (sau 12 tuần)

- Lần khám thứ năm gọi là T24 (sau 24 tuần.)

2.2.3 Phương pháp đếm tế bào gốc tạo máu CD34+ bằng máy phân tích tế bào dòng chảy flow cytometer

- Nguyên lý

Tế bào gốc tạo máu có kháng nguyên CD34 trên bề mặt Nếu ủ kháng thể anti CD34 với mẫu bệnh phẩm có tế bào gốc tạo máu, kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu lên bề mặt các tế bào gốc tạo máu mang CD34 Dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometer) có thể đếm chính xác số lượng và tỷ lệ % tế bào gốc tạo máu CD34 trong mẫu bệnh phẩm

- Phương tiện - Hóa chất

✓ Phương tiện

Máy phân tích tế bào dòng chảy (có thể phân tích các kênh màu huỳnh quang 7ADD, FITC và PE)

Máy ly tâm ống máu

Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl

- Các bước tiến hành

Lấy bệnh phẩm

Lấy tối thiểu 0,5 ml mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm được chống đông bằng EDTA (Ethylen-diamin-tetra-acetic acid) Mẫu bệnh phẩm đảm bảo chất lượng là mẫu bệnh phẩm không đông vón và không lâu quá 1 giờ sau khi lấy khỏi tĩnh mạch hoặc sau khi rã đông

Tiến hành kỹ thuật

Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu thử, pha loãng mẫu thử về nồng độ 10×109 tế bào/L, ghi lại hệ số pha loãng (số lần pha loãng)

Lấy 100 ul mẫu thử đã pha loãng cho vào các ống 1, 2 và 3

Thêm 20 µl 7AAD vào cả 3 ống 1, 2, 3

Thêm 20 µl CD45 - FITC/CD34 - PE vào ống 1 và ống 2

Thêm 20 µl Control (CD45 - FITC/Isotype PE) vào ống số 3

Votex đều các ống và ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng

Thêm 2000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút

Ngay lập tức thêm 100 ul huyền dịch hạt tham chiếu vào các ống 1, 2, 3

ý thực hiện thật tốt kỹ thuật hút mẫu và hút hóa chất bằng pipet [94]

2.2.4 Phương pháp định lượng Acetylcholin receptor Ab

và dẫn đến việc mở kênh dẫn ion qua màng sinh chất Các khiếm khuyết trong gen này là nguyên nhân của hội chứng mộng thịt loại gây chết người, hội chứng nhược

cơ bẩm sinh loại kênh chậm và hội chứng nhược cơ bẩm sinh loại kênh nhanh Một

số biến thể phiên mã, một số mã hóa protein và một số không mã hóa, đã được tìm thấy cho gen này

- Chuẩn bị và Bảo quản

Bảo quản tất cả thuốc thử ở 2-8 độ C

- Chuẩn bị mẫu

Với các mẫu chuẩn (không pha loãng), độ pha loãng 1:2 hoặc 1:4 Tránh pha loãng mẫu quá 1:10 vì nó sẽ vượt quá giới hạn pha loãng đã đặt cho bộ dụng cụ

- AChR ELISA kit

MBS729942 là Bộ công cụ ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym) sẵn sàng sử dụng để phân tích sự hiện diện của bộ phân tích ELISA Kit kháng thể thụ thể Acetylcholin (AChR) trong các mẫu sinh học Các gradient nồng

độ của các tiêu chuẩn kit hoặc các đối chứng dương tính hiển thị một phạm vi phát hiện kit lý thuyết trong các mẫu nghiên cứu sinh học có chứa AChR Kỹ thuật sinh hóa phân tích ELISA của bộ MBS729942 dựa trên tương tác kháng thể AChR-

kháng nguyên AChR (khả năng hấp thụ miễn dịch) và hệ thống phát hiện so màu HRP để phát hiện mục tiêu kháng nguyên AChR trong mẫu Bộ ELISA được thiết

kế để phát hiện AChR nguyên bản, không tái tổ hợp Các loại mẫu thích hợp có thể bao gồm dịch cơ thể chưa pha loãng và/hoặc chất đồng nhất của mô, dịch tiết Các xét nghiệm kiểm soát chất lượng đánh giá độ tái lập đã xác định CV (%) trong xét nghiệm và CV (%) giữa các xét nghiệm

Mục đích sử dụng: Bộ AchRAb ELISA là một ELISA pha rắn 1,5 giờ được thiết

kế để xác định định lượng AchRAb ở người Bộ ELISA chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không dùng cho các ứng dụng điều trị hoặc thử nghiệm

Nguyên tắc của thử nghiệm: Bộ kit ELISA AchRAb áp dụng kỹ thuật xét nghiệm

miễn dịch enzym cạnh tranh sử dụng kháng nguyên thụ thể Acetylcholin và liên hợp AchRAb-HRP Mẫu xét nghiệm và đệm được ủ cùng với liên hợp AchRAb-HRP trong đĩa tráng trước trong một giờ Sau thời gian ủ, giếng được gạn và rửa năm lần Các giếng sau đó được ủ với cơ chất cho enzyme HRP Sản phẩm của phản ứng enzym-cơ chất tạo thành phức chất có màu xanh lam Cuối cùng, một dung dịch được thêm vào để dừng phản ứng, sau đó dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng Cường độ màu được đo bằng quang phổ ở bước sóng 450nm trong đầu đọc microplat Cường độ của màu tỷ lệ nghịch với nồng độ AchRAb vì AchRAb từ mẫu và liên hợp AchRAb-HRP cạnh tranh vị trí liên kết với kháng nguyên Acetylcholin Receptor Vì số lượng vị trí bị hạn chế, do có nhiều vị trí bị chiếm

bởi AchRAb từ mẫu, nên sẽ có ít vị trí hơn để gắn kết liên hợp AchRAb-HRP Một đường cong chuẩn được vẽ biểu đồ liên quan đến cường độ của màu (OD) với nồng

độ của các chất chuẩn Nồng độ AchRAb trong mỗi mẫu được nội suy từ đường chuẩn này [104]

2.2.5 Thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO

Khái niệm về chất lượng cuộc sống không chỉ trong lĩnh vực y học mà còn trong nhiều chuyên ngành khác như xã hội học, kinh tế học Tổ chức y tế thế giới

đề cập đến khái niệm “chất lượng cuộc sống liên quan đến sức khỏe” related quality of life) với lý do sức khỏe là một trong các yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp và quan trọng đến CLCS Nó bao gồm tất cả các khía cạnh về sức khỏe của mỗi cá nhân (sức khỏe thể chất và sức khỏe tâm thần) có liên quan và ảnh hưởng trực tiếp đến CLCS của cá nhân đó [76],[77]

(health-Theo tổ chức y tế thế giới từ năm 1948 đến nay, “chất lượng cuộc sống” có thể được cụ thể hóa như là những ảnh hưởng do một bệnh, tật hoặc một rối loạn sức khỏe của một cá nhân đến sự thoải mái và khả năng hưởng thụ cuộc sống của

cá nhân đó Một trong những thước đo mức độ hài lòng của BN đối với tình trạng sức khỏe hiện tại trong sự so sánh với những kỳ vọng về sức khỏe của cá nhân họ chính là “chất lượng cuộc sống” [77],[79]

Bảng 2.1: Thang điểm Quality of Life (QoL) của WHO [76],[77]

Tồi tệ (1) Kém

(2)

Bình thường