TỔNG QUAN
Tổng quan về paclitaxel
1.1.1 Công thức hóa học và tính chất hóa lý
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paclitaxel
- Công thức phân tử: C47H51NO14
- Tên khoa học: 5,20-Epoxy-1,7-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2,4,10,13- tetrayl 4,10-diacetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3- phenylpropanoat] [9]
- Hình thức: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng [24]
- Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, dicloromethan và dễ tan trong methyl clorid [7]
- Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực ở 20°C từ -49,0° đến -55,0° ở dạng khan [7]
Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh mạch và giảm theo mô hình 2 pha [6]
Thuốc có khả năng phân bố rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, với tỷ lệ gắn kết protein từ 89% đến 98%, không bị ảnh hưởng bởi cimetidin, ranitidin, dexamethason hoặc diphenhydramin Thể tích phân bố ở giai đoạn ổn định dao động từ 5 đến 6 lít/kg thể trọng, trong khi thể tích phân bố của người tiêm truyền trong 1 đến 6 giờ đạt 67,1 lít/m² và sau 24 giờ là từ 227 lít trở lên.
688 lít/m 2 cho thấy thuốc khuếch tán nhiều ra ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của mô [6]
Chuyển hóa: Paclitaxel được chuyển hóa tại gan thông qua cytochrom P450; isoenzym CYP2C8 và CYP3A4, và tạo ra chất chuyển hóa chủ yếu là 6α- hydroxypaclitaxel [6]
Thải trừ: Nửa đời trong huyết thanh là 6 - 13 giờ, nếu thời gian tiêm truyền từ
Thời gian nửa đời thải trừ của thuốc thay đổi tùy thuộc vào thời gian tiêm truyền: từ 1 đến 6 giờ là 6,4 giờ, trong khi từ 24 giờ trở lên là từ 15,7 đến 52 giờ Sau khi truyền tĩnh mạch, khoảng 2 - 13% thuốc được thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, cho thấy rằng ngoài thận, còn có các đường đào thải khác, với khoảng 70% được thải qua phân, trong đó 5% là dạng chưa chuyển hóa Độ thanh thải của thuốc dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (tương đương 6,0 - 15,6 lít/giờ/m²) Cụ thể, độ thanh thải khi thời gian truyền từ 1 đến 6 giờ là từ 5,8 đến 16,3 lít/giờ/m², và khi tiêm truyền trong 24 giờ là từ 14,2 đến 17,2 lít/giờ/m².
Paclitaxel, một hoạt chất chiết xuất từ vỏ cây thông đỏ Taxus brevifolia, được biết đến như một loại thuốc chống ung thư hiệu quả Hoạt chất này thúc đẩy quá trình trùng hợp dime tubulin để hình thành các ống vi thể, đồng thời ổn định các ống vi thể hiện có bằng cách ức chế quá trình giải trùng hợp.
Việc ức chế tái cấu trúc mạng ống vi thể là rất quan trọng trong quá trình phân bào và hoạt động của ty lạp thể Paclitaxel tạo ra các cấu trúc bất thường trong ống vi thể, dẫn đến sự phá vỡ nhiễm sắc thể Mặc dù chưa được nghiên cứu sâu, paclitaxel được xem là chất gây độc gen do cơ chế tác động của nó Ngoài ra, paclitaxel còn có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào và điều hòa đáp ứng miễn dịch.
1.1.4 Chỉ định Điều trị ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng các anthracyclin và platin đã thất bại hay bị chống chỉ định [24, 6]
Paclitaxel kết hợp với doxorubicin là phác đồ điều trị hàng đầu cho ung thư vú di căn, đặc biệt khi các liệu pháp thông thường với anthracyclin không còn hiệu quả hoặc khi ung thư vú tái phát.
4 trong thời gian 6 tháng sau điều trị bổ trợ [24, 6] Điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư Kaposi liên quan đến AIDS
Mức độ hiệu quả của liệu pháp điều trị bằng paclitaxel chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như tính chất và thể tích khối u, cũng như sự gia tăng khả năng chịu đựng của bệnh nhân đối với hóa trị liệu có chứa platin trước đó.
Ung thư buồng trứng: Thường phối hợp với cisplatin và doxorubicin với hai mức liều phổ biến: 175 mg/m 2 và 135 mg/m 2 truyền tĩnh mạch
Ung thư vú có thể được điều trị bằng paclitaxel với liều 175 mg/m² qua đường truyền tĩnh mạch Đối với trường hợp ung thư vú đã di căn hoặc tái phát trong vòng 6 tháng sau khi điều trị hỗ trợ, bệnh nhân có thể sử dụng paclitaxel thông thường hoặc paclitaxel phối hợp với albumin.
Ung thư phổi không tế bào nhỏ: Phối hợp với cisplatin ở mức liều 175 mg/m 2 và 135 mg/m 2 truyền tĩnh mạch
Sarcom Kaposi liên quan đến AIDS có thể được điều trị bằng paclitaxel khi bạch cầu trung tính đạt ít nhất 1.000/mm³ Hai mức liều paclitaxel thường được sử dụng là 135 mg/m² và 100 mg/m², tương ứng với liều 40 – 45 mg/m² mỗi tuần.
Dung môi được sử dụng để pha loãng thuốc paclitaxel có thể bao gồm dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch glucose 5%, hoặc hỗn hợp của chúng Nồng độ paclitaxel trong dung dịch tiêm truyền thường dao động từ 0,3 đến 1,2 mg/ml.
1.1.6.1 Phương pháp định tính Đo góc quay cực của paclitaxel: Dung dịch paclitaxel trong methanol có góc quay cực nằm trong khoảng -49,0 o đến -55,0 o [7] Đo phổ hồng ngoại IR: Phổ hồng ngoại của paclitaxel thử phải tương ứng với phổ hồng ngoại của paclitaxel chuẩn [7]
Phương pháp đo quang UV-Vis [18]:
- Dung môi pha mẫu: methanol – đệm phosphate pH 7,4 (30:70, tt/tt)
- Bước sóng định lượng: 230 nm
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử trong dung môi pha mẫu có nồng độ paclitaxel chớnh xỏc khoảng 10 àg/ml
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [7]:
- Dung môi pha mẫu: methanol – acid acetic (200:1)
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử trong dung môi pha mẫu có nồng độ khoảng
+ Cột sắc ký: L 43 (250 x 4,6 mmm, 5àm)
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl.
Tổng quan về phức hợp dihydroartemisinin - glucosamin
1.2.1 Công thức hóa học và tính chất hóa lý
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của phức hợp dihydroartemisinin - glucosamin
- Công thức phân tử: C44H64NO19
- Tính chất vật lý: Phức hợp DHA-GLU là chất bột màu trắng, tan tốt trong nước
(5,2 mg/ml) Nhiệt độ nóng chảy được xác định là 128 – 134 o C
Cầu nối peroxid có tính oxy hóa mạnh mẽ và khả năng tạo gốc tự do trong các phản ứng hóa học Phức hợp DHA-GLU dễ bị thủy phân và mất hoạt tính do sự hiện diện của nhóm chức lacton, với tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và mức độ kiềm Ngoài ra, nhóm –OH có khả năng tham gia vào phản ứng acyl hóa, tạo ra các dẫn chất có độ tan cao hơn.
1.2.2 Phức hợp dihydroartemisinin - glucosamin trong ức chế tế bào ung thư
Phức hợp DHA-GLU được tạo ra từ phản ứng amid giữa artesunate và glucosamine Với cấu trúc đặc biệt này, phức hợp DHA-GLU có khả năng mang lại tác dụng dược lý tương tự như các thành phần cấu thành của nó.
Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp phức hợp dihydroartemisinin - glucosamin
DHA là một hoạt chất hiệu quả trong việc tiêu diệt ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt là Plasmodium falciparum Các hợp chất artemisinin hoạt động bằng cách liên kết với HEM, tạo ra các gốc tự do trung tâm carbon, giúp tiêu diệt ký sinh trùng một cách nhanh chóng DHA có thể được sử dụng độc lập hoặc kết hợp với piperaquin để tăng cường hiệu quả điều trị.
DHA đã được chứng minh có khả năng ức chế tế bào ung thư thông qua hai cơ chế chính Đầu tiên, DHA tạo ra các gốc tự do bằng cách phân cắt cầu endoperoxid Thứ hai, sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và nước dẫn đến hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl qua phản ứng Fenton Những gốc tự do này có khả năng oxy hóa lipid, gây tổn thương cho màng tế bào, protein và ADN, từ đó kích thích quá trình tự chết của tế bào ung thư.
DHA có tác dụng hiệp đồng trong việc ức chế tế bào ung thư khi kết hợp với một số thuốc hóa trị liệu truyền thống như PTX.
Năm 2017, Trần Ngọc Bảo và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giữa Paclitaxel (PTX) và Docosahexaenoic Acid (DHA) trong hệ tiểu phân nano PTX-artersunat/PLGA, cho thấy hệ tiểu phân này có khả năng ức chế ba dòng tế bào ung thư vú hiệu quả hơn so với mẫu nguyên liệu Đặc biệt, chỉ số kết hợp giữa PTX và DHA nhỏ hơn 1, chứng tỏ sự hiệp đồng của hai chất này trong việc điều trị ung thư vú.
Năm 2019, Lê Thiện Giáp đã nghiên cứu và bào chế hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA và PEG, cho thấy khả năng ức chế mạnh dòng tế bào HT-29 Chỉ số kết hợp giữa PTX và DHA đều nhỏ hơn 1, chứng tỏ tác dụng hiệp đồng của chúng, với tỷ lệ phối hợp DHA:PTX tối ưu là 2:1 Việc kết hợp PTX và DHA trong điều trị ung thư không chỉ giúp giảm liều mà còn tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính cho cơ thể Trong nghiên cứu này, phức hợp DHA-GLU và PTX được phối theo tỷ lệ DHA:PTX là 2:1 (khối lượng/khối lượng).
1.2.2.2 Glucosamin và khả năng hướng đích trong điều trị ung thư
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của glucosamin
- Công thức phân tử: C6H13NO5 [15]
- Tên khoa học: 2-Amino-2-Deoxy-D-Glucopyranose [15]
Glucosamin là một amino monosaccharid nổi bật với khả năng kích thích tế bào sụn khớp tăng cường tổng hợp và trùng hợp proteoglycan, tạo thành muco-polysaccharid, thành phần cơ bản của đầu sụn khớp Ngoài ra, glucosamin còn ức chế các enzym phá hủy sụn như collagenase và phospholipase A2, đồng thời kích thích sản xuất dịch nhầy khớp, góp phần trong điều trị các bệnh xương khớp Gần đây, glucosamin và các dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng hướng đích trong một số dòng tế bào ung thư.
Năm 2012, Jing Chen và cộng sự đã nghiên cứu khả năng hướng đích của glucosamin (GLU) trong phân tử nano lipid Trong thí nghiệm in vitro, GLU và chất phát quang được nạp vào tiểu phân nano và ủ với tế bào MCF-7, cho thấy sự phát quang mạnh mẽ hơn so với phức hợp chỉ chứa chất phát quang Khi tiêm tĩnh mạch phức hợp nano vào chuột bị ung thư vú do dòng tế bào MCF-7, kết quả cho thấy GLU giúp phức hợp nano đạt nồng độ cao nhất tại khối u sau 4 giờ và duy trì trong 108 giờ, trong khi không có GLU, thời gian này lần lượt là 24 giờ và 108 giờ Đặc biệt, nồng độ thuốc tại khối u với sự có mặt của GLU cao hơn đáng kể so với các mẫu đối chứng Những phát hiện này cho thấy GLU có khả năng hướng đích trong điều trị ung thư vú.
Vào năm 2012, phức hợp NAG-PEG-DOX, bao gồm N-acetylglucosamine, polyethylenglycol và doxorubicin, đã được chứng minh là có khả năng ức chế dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 hiệu quả hơn nhiều so với PEG-DOX và doxorubicin nguyên liệu.
IC50 của NAG-PEG-DOX trên các dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 lần lượt là 9 và 10 àM, cho thấy hiệu quả ức chế tế bào mạnh mẽ Trong khi đó, IC50 của các mẫu so sánh đều lớn hơn 10 àM, cho thấy chúng kém hiệu quả hơn Hình ảnh phát quang được thu được từ phương pháp MTT cho thấy nồng độ thuốc trong tế bào sau khi ủ với phức hợp này.
9 hợp NAG-PEG-DOX cao nhất tương ứng với mức độ huỳnh quang cao nhất sau các thời điểm qua sát [23]
Nghiên cứu cho thấy, tế bào ung thư có sự gia tăng đáng kể trong việc tổng hợp chuỗi glycan và gắn chúng vào lipid, protein hoặc saccharide khác Các tác nhân như glycosylation và nguyên liệu tổng hợp glycan, chẳng hạn như GLU và acid hyaluronic, thường tập trung nhiều hơn ở tế bào ung thư Điều này có thể chỉ ra cơ chế hướng đích của phân tử GLU trong quá trình này.
Hệ nano sử dụng phức hợp DHA – GLU làm tác nhân hướng đích giúp tập trung dược chất tại khối u, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể.
Tiểu phân nano polyme - lipid
Hệ nano polyme-lipid là một hệ thống bao gồm polyme, lipid và dược chất với kích thước nano, được chia thành ba loại chính: nano lai lipid-polyme, nano lai polyme-lipid và phân tán đồng thời.
Phương pháp bào chế: Có hai phương pháp bào chế nano polyme – lipid:
- Phương pháp bào chế hai bước [21, 36]:
+ Bước 1: Bào chế hệ polyme hoặc hệ lipid
+ Bước 2: Phối hợp nano polyme và lipid hoặc ngược lại
Phương pháp nano lai lipid-polyme và nano lai polyme-lipid thường yêu cầu kết hợp với chất diện hoạt ion hóa để cải thiện điện tích bề mặt, từ đó tạo ra các tương tác tĩnh điện giúp hình thành và ổn định hệ thống Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là tốn thời gian và năng lượng, đồng thời dược chất dễ bị rò rỉ.
- Phương pháp bào chế một bước [21, 36]:
Phương pháp này chỉ gồm một bước đồng nhất hóa polyme và lipid Có thể tiến hành theo hai phương pháp sau:
Dung dịch dược chất, polyme và lipid được nhỏ từ từ vào dung dịch chất diện hoạt trong nước, khuấy liên tục để tạo thành nhũ tương Sau đó, dung môi hữu cơ sẽ được loại bỏ dần dần từ nhũ tương, hình thành nên hỗn dịch nano.
Dung dịch dược chất, polyme và lipid trong dung môi đồng tan với nước được nhỏ từ từ vào pha nước Sự khuếch tán của dung môi đồng tan vào nước dẫn đến việc polyme bị tủa lại, trong khi lipid tự động kết tập với các tiểu phân nano polyme.
Trong phương pháp này, nên sử dụng lipid lưỡng tính như phospholipid hoặc lipid-PEG, với phần thân dầu hướng vào trong cấu trúc và phần thân nước hướng ra môi trường bên ngoài.
1.3.2 Vài nét về acid poly (lactic – co – glycolic)
1.3.2.1 Cấu trúc, tính chất của acid poly (lactic – co – glycolic)
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid poly (lactic – co – glycolic)
PLGA, một copolyme được polyme hóa từ hai monome là acid glycolic và acid lactic, được sử dụng phổ biến nhất trong bào chế hệ nano polyme [25]
PLGA là một polymer tan trong một số dung môi như aceton, dicloromethan và ethylacetat, nhưng không bền trong nước do liên kết ester dễ bị thủy phân, tạo ra hai monome Trong cơ thể, D-lactat được đào thải trực tiếp, trong khi L-lactat chuyển hóa thành pyruvate và tham gia vào chu trình Krebs, tạo ra CO2 và nước Tương tự, glycolat có thể được thải qua thận hoặc chuyển hóa thành glycin, serin hay pyruvate, sau đó cũng tham gia vào chu trình Krebs để tạo ra CO2 và nước.
Quá trình phân hủy polyme trong cơ thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó thành phần và tỉ lệ các monome đóng vai trò quan trọng trong việc xác định mức độ thân nước của PLGA Cụ thể, loại PLGA có tỷ lệ acid lactic cao hơn thường có thời gian phân hủy dài hơn.
PLGA 50:50, PLGA 65:35 và PLGA 75:25 là những loại PLGA phổ biến trong bào chế Trong số đó, PLGA 50:50 thường được sử dụng làm chất mang thuốc nhờ khả năng giải phóng thuốc kéo dài và thời gian phân hủy hợp lý, giúp giảm độc tính do tích lũy tá dược Ngoài ra, các yếu tố như sự hiện diện của hợp chất phân tử lượng thấp, kích thước, hình thái bề mặt và hàm lượng dược chất cũng ảnh hưởng đến quá trình phân hủy của PLGA.
Ba cơ chế vận chuyển hệ nano PLGA vào tế bào bao gồm nhập bào, vận chuyển thụ động và vận chuyển tích cực qua các kênh trên màng tế bào Sau khi vào bên trong, tiểu phân nano PLGA được chuyển đến lysosome, nơi chúng có khả năng phá hủy màng lysosome, gây ra hiện tượng chết theo chu trình của tế bào.
1.3.2.2 Nhược điểm của acid poly (lactic – co – glycolic) khi sử dụng làm chất mang thuốc
Mặc dù PLGA là một chất mang thuốc phổ biến, nhưng nó vẫn tồn tại một số nhược điểm đáng kể, gây cản trở cho việc sử dụng hệ tiểu phân nano PLGA.
- Khả năng nano hóa dược chất thấp, đặc biệt là các dược chất ít thân dầu
Các tế bào dễ bị hệ thống miễn dịch nhận diện và tiêu diệt, dẫn đến việc hệ thống lưới nội mô loại bỏ chúng khỏi máu và chuyển đến gan cùng lách.
- PLGA thường liên kết với các protein opsonin, phức hợp này dễ bị bắt bởi các đại thực bào
- Sự tương tác không đặc hiệu của PLGA với các mô sinh học dẫn đến sự tích lũy tá dược và dược chất tại các mô lành
Động học giải phóng của tiểu phân nano PLGA diễn ra qua hai pha: pha đầu với sự giải phóng ồ ạt và pha hai kéo dài Sự giải phóng ồ ạt trong pha đầu có thể làm giảm khả năng tiếp cận của dược chất đến mô đích và gây độc cho các mô lành Để khắc phục những nhược điểm này, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc cải thiện đặc tính lý hóa bề mặt của tiểu phân PLGA thông qua việc sử dụng các phức hợp với polyethylene glycol, polyvinyl alcohol và d-α.
12 tocopheryl PEG 1000 succinate nhằm kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu của hệ tiểu phân [25]
Lecithin là một hỗn hợp các phosphatid không tan trong aceton, bao gồm nhiều thành phần như phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin, phosphatidylinositol, triglycerid, acid béo và carbohydrate Thành phần của lecithin có sự biến đổi lớn tùy thuộc vào nguồn gốc và mức độ tinh chế Cụ thể, lecithin từ đậu nành chứa 19-21% phosphatidylcholin, 8-20% phosphatidylethanolamin và 20-21% inositol phosphatid, trong khi lecithin từ lòng đỏ trứng có tới 80,5% phosphatidylcholin và 11,7% phosphatidylethanolamin.
Lecithin là một chất không tan trong dung môi phân cực và ít tan trong benzen, nhưng tan tốt trong các dung môi không phân cực như hexan, cloroform và acid béo Chất này được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm với vai trò là chất nhũ hóa và chất ổn định Ngoài ra, lecithin còn đóng vai trò quan trọng trong việc bào chế các hệ mang thuốc như liposom, nano lipid rắn và nano polyme Với tỷ lệ lớn phospholipid có cấu trúc tương đồng sinh học với tế bào sống, lecithin không chỉ an toàn mà còn tăng cường khả năng vận chuyển thuốc và dễ dàng xâm nhập vào các tổ chức đích.
1.3.4 Độ ổn định của hệ tiểu phân nano
Hệ phân tán nano thường có độ ổn định kém và dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố lý hóa Để đánh giá độ ổn định của hệ, các tiêu chí như kích thước hạt, phân tán kích thước hạt, thế zeta, hàm lượng hoạt chất và cảm quan được chú trọng.
1.3.4.1 Độ ổn định vật lý
Kĩ thuật đông khô
Đông khô là một phương pháp làm khô sản phẩm thông qua quá trình đông lạnh, trong đó dung môi sẽ thăng hoa trực tiếp và giải hấp phụ, giúp ngăn chặn các phản ứng hóa học và sự phát triển của vi sinh vật Phương pháp này mang lại nhiều ưu điểm vượt trội.
- Giảm tốc độ phản ứng phân hủy dược chất
- Chế phẩm thu được có tốc độ hòa tan rất nhanh
- Giảm thiểu các phản ứng oxi hóa khử tác động lên dược chất
- Tốn kém thời gian và chi phí, thiết bị phức tạp dẫn đến giá thành sản phẩm cao
- Dược chất có bản chất protein bị mất hoạt tính hoặc bị phá hủy do quá trình đông lạnh
- Sự hình thành chất rắn vô định hình
Quá trình đông khô có thể được chia thành 3 giai đoạn [22, 1]:
Giai đoạn đông lạnh là bước quan trọng nhất trong quy trình đông khô, khi dược chất được làm đông ở nhiệt độ thấp đủ để đông cứng hoàn toàn thuốc Nhiệt độ trong giai đoạn này được duy trì trong khoảng từ -70°C đến -40°C.
Trong giai đoạn sấy khô sơ cấp, nước đá được thăng hoa trực tiếp từ pha rắn sang pha hơi bằng cách giảm áp suất trong buồng đông khô xuống thấp hơn áp suất hơi bão hòa Áp suất càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung môi càng nhanh, nhưng khả năng lẫn tạp cũng tăng lên Nhiệt độ sấy cao giúp tăng hiệu suất quá trình, nhưng nếu vượt quá nhiệt độ chuyển kính hoặc nhiệt độ eutecti, có thể gây phá vỡ cấu trúc hệ Thời gian sấy không đủ để loại bỏ dung môi không liên kết cũng có thể dẫn đến sự phá hủy hệ khi chuyển sang giai đoạn sấy thứ cấp Ngoài ra, thể tích thuốc đem đông khô và thành phần công thức cũng ảnh hưởng đáng kể đến quá trình đông khô.
Giai đoạn sấy khô thứ cấp là quá trình loại bỏ nước không đóng băng trong khối bột bằng cách tăng nhiệt độ của buồng đông khô dưới áp suất thấp, nhằm giảm độ ẩm đến mức tối ưu Giai đoạn này thường mất thời gian tương đối dài để đạt được hiệu quả tối ưu.
1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến bột đông khô Đông khô là một trong những biện pháp có thể ứng dụng để bào chế hệ nano ở trạng thái khô, cho phép bảo quản lâu dài, dễ vận chuyển, loại bỏ nước để cải thiện sự ổn định của các dược chất dễ bị biến tính và ngăn ngừa giải phóng dược chất Tuy nhiên, quá trình đông khô hệ nano có thể gây ra sự kết tụ (nghiêm trọng) và làm tăng kích thước tiểu phân Một số yếu tố cụ thể ảnh hưởng đến đặc tính của bột đông khô:
- Yếu tố liên quan đến công thức bào chế [38, 30, 2]:
Tá dược tạo khung là thành phần quan trọng trong việc tạo khuôn cho chế phẩm và nâng cao độ bền cơ học Manitol là tá dược phổ biến nhất nhờ vào khả năng cải thiện độ ổn định của nhiều hoạt chất thông qua quá trình kết tinh khi đông khô Việc kết hợp manitol với PVP ở nồng độ thấp giúp gia tăng độ ổn định lý hóa cho bột đông khô Đối với các tá dược độn vô định hình như sorbitol và saccarose, cần áp dụng nhiệt độ làm khô thấp và thời gian kéo dài để đạt hiệu quả tối ưu.
- Yếu tố thuộc về kỹ thuật [30, 20]:
+ Trong quá trình làm khô sơ cấp, nhiệt độ sản phẩm phải được điều chỉnh xuống dưới nhiệt độ phá vỡ cấu trúc của hệ
+ Thời gian và nhiệt độ là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng bột đông khô.
Một số nghiên cứu liên quan
1.5.1 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano polyme – lipid chứa dihydroartemisinin và paclitaxel
Năm 2016, Lu Wang và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân PLGA chứa dihydroartemisinin (DHA) nhằm cải thiện hiệu suất nano hóa và tăng cường hiệu quả ức chế tế bào ung thư Nhóm nghiên cứu sử dụng PLGA kết hợp với phospholipid, tạo ra các tiểu phân có kích thước 265,3 ± 7,9 nm và hiệu suất nano hóa đạt 74,2 ± 6,5% Hệ nano polyme này cho thấy khả năng giải phóng DHA từ từ và ức chế sự tăng sinh tế bào mạnh mẽ hơn so với DHA đơn thuần Nghiên cứu chỉ ra rằng phospholipid có khả năng cải thiện tính ưa dầu của thuốc và lõi kỵ nước của PLGA, từ đó nâng cao khả năng nano hóa các dược chất ít thân dầu PLGA và LEC được phối hợp làm hệ vận chuyển thuốc, với hy vọng tăng cường khả năng vận chuyển DHA-GLU, hỗ trợ phát huy tác dụng của dược chất.
Năm 2020, Nguyễn Tuấn Linh đã khảo sát ảnh hưởng của công thức và quy trình đến sự hình thành và đặc tính của tiểu phân nano polyme – lipid chứa PTX và DHA Kết quả cho thấy, khi năng lượng siêu âm tăng, kích thước tiểu phân (KTTP) và chỉ số phân tán (PDI) giảm, nhưng thời gian siêu âm quá dài (trên 5 phút) lại làm KTTP tăng, mặc dù PDI giảm Tăng tỷ lệ LEC/PLGA trong một khoảng nhất định sẽ làm KTTP giảm, nhưng vượt qua ngưỡng này, KTTP lại tăng do LEC thừa tạo thành liposome Khi tăng PLGA với cùng mức năng lượng và thời gian siêu âm, KTTP cũng tăng, do độ nhớt của hệ tăng lên gây khó khăn cho việc phân cắt các giọt dầu Những yếu tố kỹ thuật và công thức này cần được tối ưu trong quá trình bào chế tiểu phân nano PLGA/LEC.
1.5.2 Một số nghiên cứu về kỹ thuật đông khô hệ tiểu phân nano
Nghiên cứu của Hồ Hoàng Nhân về bào chế thuốc tiêm đông khô nano artesunat – poly (acid lactic – co – glycolic) đã chỉ ra rằng lactose không bảo vệ được tiểu phân nano, dẫn đến sự vỡ cấu trúc và tăng kích thước tiểu phân Trong khi đó, saccarose có tác dụng bảo vệ hiệu quả nhưng cần sử dụng với hàm lượng 10%, nhờ vào khả năng hình thành cấu trúc thủy tinh ổn định, giữ cho nano không bị tụ lại trong quá trình đông lạnh Manitol 5% có thể làm tăng kích thước tiểu phân nhẹ sau khi tái phân tán, trong khi manitol 10% lại cản trở sự thăng hoa của hơi nước, khiến cho bánh thuốc không khô trong quá trình đông khô.
Theo nghiên cứu của Melisande Holzer và cộng sự vào năm 2008, phương pháp đông khô được chứng minh là hiệu quả trong việc bảo tồn tính toàn vẹn của tiểu phân nano PLGA trong quá trình theo dõi độ ổn định dưới các điều kiện bảo quản khác nhau.
Hệ tiểu phân nano PLGA được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi ở áp suất cao và được đông khô với sự có mặt của các tá dược tạo khung, bao gồm 1% sucrose và 2%.
Nghiên cứu sử dụng 3% trehalose và 3% manitol, áp dụng các phương pháp tán xạ ánh sáng động, ly tâm và kính hiển vi điện tử truyền qua để đánh giá đặc tính của tiểu phân trước và sau khi đông khô và hoàn nguyên Kết quả cho thấy, phương pháp đông khô với tá dược tạo khung 1% sucrose là phù hợp để duy trì tính toàn vẹn của các hạt nano PLGA.
Năm 2000, A Saez và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình đông khô đến sự ổn định của các hạt tiểu phân nano PLGA và polycarprolacton Họ sử dụng phương pháp quét nhiệt vi sai và đông lạnh – rã đông để tối ưu hóa quá trình đông khô, với nhiệt độ duy trì là -45 o C và tá dược tạo khung bao gồm sucrose, glucose, trehalose và gelatin Kết quả cho thấy, ở bột đông khô sử dụng 20% sucrose và 20% glucose, kích thước tiểu phân tăng nhẹ từ 100 nm lên 160 nm (tăng 1,6 lần) và có sự thay đổi trong phân bố thuốc khi nghiên cứu dược động học đường uống trên chuột.
Sử dụng saccarose, manitol và sucrose có thể là lựa chọn phù hợp trong bào chế bột đông khô chứa nano PTX và phức hợp DHA-GLU Tuy nhiên, các tá dược này ảnh hưởng đến đặc tính lý hóa của hệ ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào hàm lượng sử dụng và điều kiện bào chế.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu nghiên cứu
Bảng 2.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Phức hợp DHA - GLU Viện Công nghệ
3 Paclitaxel Sigma - Aldrich Độ tinh khiết >
6 Polyoxyl 40 Hydrogenated castor oil Ấn Độ NSX
7 Polyoxyl 35-hydrogenated castor oil Ấn Độ NSX
11 Polyvinyl alcol (PVA) Trung Quốc NSX
17 Acetonitril dùng cho HPLC Merck – Đức Dùng cho HPLC
18 Methanol dùng cho HPLC Merch – Đức Dùng cho HPLC
19 Một số nguyên vật liệu khác
Thiết bị nghiên cứu
- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer NanoZS90 Malvern (Anh)
- Máy khuấy từ WiseStir (Hàn Quốc)
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (Hoa Kỳ)
- Máy ly tâm lạnh Hermle Labortechnik GmbH (Đức)
- Máy siêu âm Sonics & Materials, Inc.(Mỹ)
- Máy đo pH Eutech instrument pH 510
- Cột lọc tiếp tuyến 50 kDalton
- Máy đông khô Bench Top Pro (Mỹ)
- Ống ly tâm chứa màng siêu lọc (MWCO 10000Dalton, Millipore, Merck, Mỹ)
- Tủ lạnh sâu Unicryo (Mỹ)
- Máy lắc Vortex Mixter (Đức)
- Một số thiết bị, dụng cụ khác.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano polyme – lipid có chứa PTX và DHA-GLU
+ Tiến hành xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ nano chứa PTX, DHA- GLU với chất mang là PLGA và lecithin
+ Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano polyme – lipid chứa PTX và DHA – GLU
- Nghiên cứu bào chế và đánh giá một số đặc tính của bột đông khô chứa nano PTX và DHA-GLU
+ Tiến hành xây dựng công thức và quy trình bào chế bột đông khô chứa nano PTX và DHA - GLU, khảo sát điều kiện cho quá trình đông khô
+ Đánh giá một số đặc tính và bước đầu đánh giá độ ổn định của bột đông khô chứa nano PTX và GLU-DHA
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp bào chế và đánh giá đặc tính hệ tiểu phân nano polyme - lipid chứa paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
2.4.1.1 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano polyme - lipid chứa paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
+ Hoạt chất: PTX, DHA-GLU
Hệ tiểu phân nano chứa PTX và DHA – GLU là một phức hợp dược chất được chế tạo thông qua phương pháp nhũ hóa bốc dung môi Quy trình này đảm bảo tính hiệu quả và độ ổn định của sản phẩm.
Chuẩn bị pha dầu: Hòa tan PTX, DHA-GLU, PLGA và LEC trong dicloromethan
Chuẩn bị pha nước: Dung dịch chất diện hoạt ở nồng độ thích hợp
Trong giai đoạn nhũ hóa, cần nhỏ từ từ pha dầu vào pha nước và sử dụng thiết bị siêu âm đầu dò để đồng nhất hóa nhũ tương Trong suốt quá trình siêu âm, nhiệt độ phải được duy trì ở mức 0 – 5 o C để đảm bảo hiệu quả của quá trình.
Bốc hơi dung môi: Tiếp tục khuấy nhẹ nhàng nhũ tương dưới thiết bị khuấy từ trong 3h ở nhiệt độ phòng để loại dung môi hữu cơ
Tinh chế và thu sản phẩm bằng cách sử dụng cột lọc tiếp tuyến có kích thước 50 kDalton Hỗn dịch nano, sau khi bốc hơi dung môi, sẽ được đưa qua cột lọc tiếp tuyến với màng lọc tương ứng.
Dịch không qua màng được hiểu là dịch đã được loại bỏ một phần nước, với các phân tử có kích thước nhỏ hơn 50 kDalton Để đạt được điều này, quá trình lọc cần được lặp lại 10 lần, và cuối cùng thu được hỗn dịch sau khi tinh chế.
2.4.1.2 Phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano chứa paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin a Đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân
Phương pháp: Tán xạ ánh sáng động
Khi chiếu chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân sẽ được thu nhận trên một màn chắn Phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ cho phép đánh giá chuyển động Brown và xác định kích thước hạt thông qua phương trình Stokes-Einstein.
Để tiến hành đo kích thước tiểu phân và đánh giá thế zeta, pha loãng hỗn dịch nano với nước cất đã lọc (0,22 µm) để đạt chỉ số đếm (count rate) trong khoảng 200 – 400 kcps Sử dụng thiết bị Zetasize ở nhiệt độ 25 oC để thực hiện đo đạc Đọc kết quả kích thước tiểu phân và hệ số phân bố kích thước tiểu phân ba lần liên tiếp và lấy kết quả trung bình.
Phương pháp: Tán xạ ánh sáng
Khi áp dụng một điện trường lên hệ thống, các tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỷ lệ thuận với thế zeta Tốc độ di chuyển của tiểu phân được xác định thông qua việc phân tích chuyển động của chúng qua ánh sáng tán xạ Thế zeta được xác định dựa vào định luật Smoluchowski – Huckel.
Để tiến hành đánh giá hiệu suất nano hóa, cần pha loãng hỗn dịch nano bằng nước cất đến nồng độ phù hợp, đảm bảo chỉ số đếm nằm trong khoảng 200 – 400 kcps Tiếp theo, đo thế zeta trên thiết bị Zetasize ở nhiệt độ 25 oC, sử dụng cuvet PE Đọc kết quả ba lần liên tiếp và lấy giá trị trung bình để có được thông tin chính xác về tỷ lệ dược chất được nano hóa.
Phương pháp xác định hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất nano hóa được thực hiện gián tiếp bằng cách đo lường lượng dược chất phân tử tự do cùng với tổng lượng dược chất có trong hệ thống.
Để xác định lượng dược chất phân tử tự do, cần hút chính xác một thể tích hỗn dịch nano vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10.000 Da Tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 rpm/phút, nhiệt độ 25 độ C trong 30 phút Sau đó, xác định hàm lượng dược chất trong dịch phía dưới màng lọc bằng phương pháp HPLC để tính toán lượng dược chất phân tử tự do có trong hệ thống.
Để xác định lượng dược chất toàn phần, đầu tiên cần hút một thể tích chính xác của hỗn dịch nano vào bình định mức Tiếp theo, thêm một lượng ACN vừa đủ, đậy kín và siêu âm trong khoảng 30 phút Sau khi để bình nguội về nhiệt độ phòng, tiến hành định mức bằng ACN và lắc đều Cuối cùng, xác định hàm lượng dược chất trong phần dịch để tính toán lượng dược chất toàn phần có trong hệ thống.
- Lượng dược chất phân tử tự do có trong hệ:
Trong đó: mtd: là lượng dược chất phõn tử tự do cú trong hệ (àg)
Ctd: là nồng độ dược chất xác định được từ dịch ly tâm phía dưới màng lọc (àg/ml)
Vtd: là thể tích của hỗn dịch nano (ml)
- Lượng dược chất toàn phần có trong hệ:
Trong đó: mtp: là lượng dược chất toàn phần cú trong hệ (àg)
Ctp: là nồng độ dược chất xỏc định được từ dịch chiết (àg/ml)
Vtp: là thể tích của hỗn dịch nano (ml)
- Công thức tính hiệu suất mang dược chất nano (EE):
- Công thức tính tỷ lệ dược chất nano (LC)
Trong đó: mtd: là lượng dược chất tự do cú trong hệ (àg)
23 mtp: là lượng dược chất toàn phần cú trong hệ (àg)
Khối lượng tiểu phân nano (àg) được xác định dựa trên tổng khối lượng dược chất và tá dược theo lý thuyết Để đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano, phương pháp in vitro được áp dụng cho PTX và DHA bằng cách sử dụng màng thẩm tích (14.000 Da) Cụ thể, 3 ml hỗn dịch nano được đưa vào túi thẩm tích, sau đó kẹp chặt và đặt vào môi trường giải phóng với điều kiện ngập trong dung dịch Quá trình được duy trì với tốc độ lắc 100 vòng/phút và nhiệt độ 37°C Môi trường giải phóng là 30 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,4 Mẫu được lấy tại các thời điểm 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 và 84 giờ, mỗi lần 1 ml, và bổ sung thể tích sau mỗi lần lấy mẫu.
Để xác định nồng độ dược chất tại thời điểm ban đầu và các thời điểm t, ta cần tính lượng dược chất đã giải phóng ra môi trường tại thời điểm t theo công thức cụ thể.
Trong đó: mt: Lượng dược chất đó giải phúng tại thời điểm t (àg)
Ct: Nồng độ dược chất trong mụi trường thử tại thời điểm thứ t (àg/ml)
Vmt: Thể tích môi trường giải phóng (ml)
Vt: Thể tích lấy mẫu tại các thời điểm lấy mẫu (ml)
Ci: Nồng độ dược chất trong mụi trường thử tại thời điểm thứ i (àg/ml)
Phần trăm giải phóng tích lũy tại thời điểm t được xác định bằng công thức:
%GP: Phần trăm giải phóng tích lũy tại thời điểm t (%)
Lượng dược chất giải phóng tại thời điểm t (mt) được xác định là 24 àg, trong khi lượng dược chất ban đầu được đưa vào màng thẩm tách (mo) là một giá trị cần được xem xét Phương pháp định lượng paclitaxel và dihydroartemisinin - glucosamin là những kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu này.
Qua việc tham khảo tài liệu, chúng tôi đã tiến hành định lượng đồng thời DHA-GLU và PTX trong các mẫu bằng phương pháp HPLC, với các điều kiện cụ thể được thiết lập.
Cột sắc ký: C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 àm)
Pha động: ACN – nước, gradient: acetonitril thay đổi từ 15 % đến 53 %, nước thay đổi từ 85 % đến 47 % trong 0 - 10 phút Duy trì tỉ lệ acetonitril – nước (53:47) trong 15 phút tiếp theo
Detector: detector UV, bước sóng phát hiện 210 nm
Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl
Dung môi pha mẫu: ACN
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn DHA-GLU: Cân chính xác khoảng 10,0 mg DHA-
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng phương pháp định lượng
3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích phức hợp dihydroartemisinin - glucosamin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tiến hành phõn tớch dung dịch phức hợp DHA – GLU nồng độ khoảng 50 àg/ml trong ACN bằng phương pháp HPLC với điều kiện phân tích như sau:
- Detector: DAD bước sóng 210 nm
- Pha động: ACN – H2O, gradient: acetonitril thay đổi từ 20 % đến 80 %, nước thay đổi từ 80 % đến 20 % trong 0 – 60 phút
Kết quả phân tích cho thấy trên SKĐ có một pic lớn, chiếm 90% tổng diện tích các pic, với phổ hấp thụ UV-Vis rõ ràng Vì vậy, pic này được chọn làm đại diện cho phức hợp DHA-GLU trong các thí nghiệm tiếp theo.
Tỷ lệ diện tích pic
Hình 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện phân tích phức hợp dihydroartemisinin - glucosamin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Dataf ile Name:ART-GLU GRADIENT 2.lcd
Sample Name:ART-GLU GRADIENT 2
Sample ID:ART-GLU GRADIENT 2
3.1.2 Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời paclitaxel, dihydroartemisinin
- glucosamin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Detector: DAD bước sóng 210 nm
- Pha động: ACN – H2O, gradient: acetonitril thay đổi từ 15 % đến 53 %, nước thay đổi từ 85 % đến 47 % trong 0 - 10 phút Duy trì tỉ lệ acetonitril – nước (53:47) trong 15 phút tiếp theo
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Chuẩn bị mẫu dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 5,00 mg mỗi chất chuẩn
DHA-GLU và PTX vào bình định mức 5 ml, thêm khoảng 3 ml methanol, siêu âm đến tan hoàn toàn, bổ sung dung môi đến vạch
Để chuẩn bị mẫu dung dịch thử, hút chính xác khoảng 2 ml hỗn dịch nano và cho vào bình định mức 5 ml Tiếp theo, thêm 2 ml ACN, lắc kỹ, đậy kín và siêu âm trong khoảng 15 phút Sau đó, để nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung ACN đến vạch và lắc đều Cuối cùng, lọc qua màng lọc.
0,45 àm thu được dung dịch thử
3.1.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng Độ đặc hiệu
Chú thích: 1-Mẫu thử, 2- Hỗn hợp chuẩn, 3-Mẫu placebo, 4-Mẫu trắng
Hình 3.2 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp phân tích paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
Phân tích cho thấy mẫu dung dịch thử có pic tương ứng với mẫu dung dịch chuẩn, trong khi mẫu trắng và mẫu placebo không xuất hiện pic tại vị trí tương ứng Điều này chứng tỏ rằng phương pháp phân tích này có tính chọn lọc cao đối với DHA-GLU và PTX, đảm bảo độ thích hợp trong quá trình kiểm tra.
Tiến hành tiêm lặp lại 05 lần mẫu dung dịch chuẩn DHA – GLU với nồng độ 127,5 µg/ml và dung dịch chuẩn PTX với nồng độ 140 µg/ml Kết quả đánh giá RSD % của thời gian lưu và diện tích pic được thu nhận như sau:
Bảng 3.1 Kết quả thẩm định độ thích hợp của phương pháp phân tích đồng thời paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
RSD % của thời gian lưu và diện tích pic của hai mẫu dung dịch chuẩn nhỏ hơn 2% cho thấy rằng các điều kiện sắc ký và hệ thống HPLC được lựa chọn là phù hợp, đảm bảo độ ổn định cho phép phân tích định lượng đồng thời DHA-GLU và PTX.
Chúng tôi đã tiến hành phân tích dãy dung dịch chuẩn DHA – GLU với nồng độ từ 2,0 đến 255 àg/ml và dung dịch chuẩn PTX với nồng độ từ 2,2 đến 280 àg/ml Kết quả thu được cho thấy sự tương quan rõ rệt giữa nồng độ và các chỉ số phân tích.
Bảng 3.2 Kết quả xây dựng phương trình đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ hoạt chất
Diện tích pic (mAu.S) Độ chệch (%)
Diện tích pic (mAu.S) Độ chệch (%)
Hình 3.3 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dihydroartemisinin - glucosamin y = 2847.5x + 573.23 R² = 0.9999
Hình 3.4 Đường biểu diễn mỗi tương quan giữa diện tic pic và nồng độ paclitaxel
Kết quả đánh giá đường chuẩn trong Bảng 3.2 cho thấy độ chệch (∆) ở các nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép (
