NGUYỄN PHI TOÀN ĐÁNH GIÁ đặc điểm lý học và SINH học của hệ VI bọt MANG GEN HSV TK và KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2 LUẬN văn THẠC sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHI TOÀN ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM LÝ HỌC VÀ SINH HỌC CỦA HỆ VI BỌT MANG GEN HSVTK VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Lập Nơi thực nghiên cứu: Trường Đại học Dược Hà Nội Đại học Quốc gia Thanh Hoa, Đài Loan HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phịng Sau đại học tồn thể thầy Bộ mơn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội, tạo điều kiện cho thực luận văn Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Nguyễn Thị Lập tận tình giúp đỡ, tin tưởng trao cho hội nghiên cứu vấn đề so với kinh nghiệm Qng thời gian làm việc với Cơ giúp học nhiều kinh nghiệm việc viết đăng báo Tiếp theo, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS Chih Kuang Yeh – Khoa Kỹ thuật Y sinh Khoa học môi trường - Trường Đại học Quốc gia Thanh Hoa (Đài Loan), người thầy hỗ trợ chun mơn để tơi hồn thành luận văn Cảm ơn anh chị lớp Cao học Khóa 25, lớp chuyên ngành Hóa sinh, DS Lê Nguyễn Anh Thư, NCS Trần Thị Anh Thơ nơi trao đổi kiến thức đề tài nơi hàn huyên sau tiết học căng thẳng Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn thân DS Nguyễn Cao Đức em Hội Sinh viên Trường Đại học Dược Hà Nội Mọi người điểm tựa tinh thần ủng hộ tơi Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn nhỏ bé đến thân tạm quên lo lắng sống giữ tinh thần lạc quan q trình học hồn thành luận văn thạc sĩ Bằng trái tim đam mê khoa học khối óc ln tị mị miền kiến thức mới, xin cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Phi Toàn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Vi bọt hệ vi bọt mang gen 1.1.1 Vi bọt 1.1.1.1 Cấu tạo vi bọt 1.1.1.2 Khả gắn chất lên bề mặt vi bọt 1.1.1.3 Một số thông số đánh giá đặc điểm lý học vi bọt 1.1.2 Hệ vi bọt mang gen 1.1.2.1 Cơ chế chuyển gen hệ vi bọt mang gen 1.1.2.2 Một số phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học hệ vi bọt mang gen 1.1.3 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ vi bọt chẩn đoán điều trị 10 1.2 Vài nét gen herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) 12 1.2.1 Khái niệm 12 1.2.2 Vai trò gen HSV-TK điều trị ung thư 12 1.2.3 Một số nghiên cứu hệ vi bọt mang gen HSV-TK 14 1.3 Vài nét thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGFR2) 16 1.3.1 Khái niệm 16 1.3.2 Con đường truyền tín hiệu chức sinh học VEGFR2 16 1.3.3 Vai trò VEGFR2 điều trị ung thư 17 1.3.4 Một số nghiên cứu hệ vi bọt hướng đích VEGFR2 18 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 21 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 25 2.3.1.1 Phương pháp tạo hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 25 2.3.1.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 28 2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học hệ vi bọt mang gen HSVTK kháng thể kháng VEGFR2 28 2.3.2.1 Phương pháp đánh giá mức độ gắn VEGFR2 lên hệ vi bọt 28 2.3.2.2 Phương pháp đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt 29 2.3.2.3 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase hệ vi bọt 30 2.3.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc sinh học hệ vi bọt kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi điện tử truyền qua đơng lạnh (cryo-TEM) 32 2.3.3 Xử lý số liệu 32 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Kết đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 33 3.1.1 Kết kích cỡ loại vi bọt 33 3.1.2 Kết nồng độ loại vi bọt 35 3.1.3 Kết zeta loại vi bọt 36 3.2 Kết đánh giá đặc điểm sinh học hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 37 3.2.1 Kết đánh giá mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 lên hệ vi bọt 37 3.2.2 Kết đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt 38 3.2.3 Kết đánh giá khả bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase hệ vi bọt 40 3.2.4 Kết xác định cấu trúc sinh học hệ vi bọt bằng kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh 41 Chương BÀN LUẬN 44 4.1 Về kết đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 44 4.2 Về kết đánh giá đặc điểm sinh học hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 47 4.2.1 Về kết đánh giá mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 lên hệ vi bọt 47 4.2.2 Về kết đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt 47 4.2.3 Về kết đánh giá khả bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase hệ vi bọt 49 4.2.4 Về kết xác định cấu trúc sinh học hệ vi bọt kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT VẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic BSE Bystander Effect Hiệu ứng người C3F8 Octafluoropropane Octa-floropropan CMB Cationic microbubble Vi bọt mang điện tích dương Cryogenic-Transmission Kính hiển vi điện tử truyền qua electron microscope đông lạnh DNase Deoxyribonuclease Deoxyribonuclease FITC Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanat FUS Focused ultrasound Siêu âm hội tụ cường độ cao GCV Ganciclovir Ganciclovir Glial cell line-derived Yếu tố thần kinh có nguồn gốc từ neurotrophic factor dịng tế bào thần kinh đệm Herpes simplex virus - Virus Herpes simplex - thymidine thymidine kinase kinase Herpes simplex virus Gen Virus Herpes simplex thymidine kinase gene thymidine kinase cryo-TEM GDNF HSV-TK HSV-TK gene Herpes simplex virus HSV-TK/GCV thymidine kinase/Ganciclovir Liệu pháp phối hợp gen HSV-TK Ganciclovir MB Microbubble Vi bọt ORF Open Reading Frame Khung đọc mở pADN Plasmid deoxyribonucleic acid Plasmid acid deoxyribonucleic PEG Polyethylen glycol Polyethylen glycol RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic siRNA Small interfering RNA ARN can thiệp nhỏ VEGFR2 cationic Vi bọt điện tích dương mang microbubble kháng thể kháng VEGFR2 Vascular endothelial Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô growth factors mạch máu Vascular endothelial Thụ thể yếu tố tăng trưởng nội growth factors receptor mô mạch máu VCMB VEGF VEGFR2 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu tạo vi bọt tr Hình 1.2 Cơ chế chuyển gen hệ vi bọt kết hợp siêu âm tr Hình 1.3 Minh họa chế BSE tr 13 Hình 1.4 Cấu trúc VEGFR2 tr 16 Hình 1.5 Con đường truyền tín hiệu VEGFR2 tr 17 Hình 2.1 Bản đồ plasmid ADN chứa gen HSV-TK tr 21 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu tr 25 Hình 2.3 Minh họa bước chế tạo hệ vi bọt mang gen kháng tr 26 thể Hình 3.1 Phân bố đường kính – số lượng loại vi bọt gắn tr 34 pADN 10 Hình 3.2 Phân bố đường kính – thể tích loại vi bọt gắn tr 35 pADN 11 Hình 3.3 Mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 vào hệ vi bọt tr 38 VCMB-pADN thông qua hiệu gắn kết avidin-biotin 12 Hình 3.4 Hình ảnh điện di thể hiệu vi bọt tải gen tr 39 13 Hình 3.5 Hình ảnh điện di thể khả vi bọt VCMB bảo vệ tr 40 pADN khỏi thủy phân endonuclease 14 Hình 3.6 Hình ảnh hiển vi huỳnh quang phức hợp VCMB – tr 42 pADN 15 Hình 3.7 Hình ảnh cấu trúc vi bọt thể gắn kết kháng thể kháng VEGFG2 quan sát kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh (cryo-TEM) tr 43 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Hóa chất thí nghiệm tr 22 Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị tr 23 Bảng 2.3 Tỷ lệ khối lượng/khối lượng thành phần lipid tạo màng tr 27 loại vi bọt Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm điện di đánh giá khả tải gen tr 30 hệ vi bọt Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm điện di đánh giá khả bảo vệ ADN tr 31 khỏi DNase hệ vi bọt Bảng 3.1 Đường kính trung bình loại vi bọt tr 33 Bảng 3.2 Nồng độ tổng thể tích loại vi bọt tr 36 Bảng 3.3 Thế zeta loại vi bọt tr 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Gen trị liệu cách tiếp cận đầy hứa hẹn điều trị ung thư Hiện nay, vector có nguồn gốc virus hệ vận chuyển gen chủ yếu Tuy nhiên, vấn đề tính an tồn, khả kích hoạt hệ thống miễn dịch bệnh nhân chống lại virus, khả kích thích khối u phát triển virus, hạn chế việc ứng dụng gen trị liệu thực tế lâm sàng [27] Do vậy, phát triển hệ vận chuyển gen trị liệu virus tất yếu cần nghiên cứu Thực tế cho thấy vector khơng có nguồn gốc virus giúp cải thiện hiệu chuyển gen tính an tồn sinh học, điển hình hệ vi bọt mang gen [24], [58] Vi bọt (microbubble) tiểu phân chứa khí, bao bọc lớp màng mang điện tích có khả liên kết với phân tử acid nucleic Cấu trúc vi bọt cho phép gắn thêm nhiều loại phối tử nhằm chế tạo hệ chuyển gen vi bọt có tác dụng trúng đích [24] Gen Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gọi “gen tự sát” (suicide gene), mã hóa cho thymidine kinase có tác dụng chuyển hóa tiền chất ganciclovir (GCV) thành chất có khả xen vào sợi ADN nhân đôi, ức chế tổng hợp ADN, ngăn chặn chu kỳ tế bào, dẫn đến trình apoptosis Một số nghiên cứu chứng minh, liệu pháp gen sử dụng HSV-TK kết hợp GCV có tác dụng ức chế nhiều loại ung thư có ung thư não [7], [13], [40], [55] Thụ thể vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR2) thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) Thụ thể có tăng biểu màng tế bào nội mô xung quanh hệ mạch máu nuôi dưỡng khối u màng tế bào ung thư ung thư vú, ung thư phổi, u nguyên bào thần kinh đệm [28], [39], [54] Hiện nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu tạo hệ chuyển gen vi bọt đăng tải tạp chí khoa học Với mục đích tạo hệ vận chuyển gen điều trị ung thư trúng đích, chúng tơi tiến hành đề tài “Đánh giá đặc điểm lý học sinh xuất gel agarose (làn 1) Điều giải thích ánh sáng UV phát pADN sau nhuộm, lipid lớp vỏ VCMB (khơng trộn pADN) khơng thể bắt màu nhuộm khơng vạch nhìn thấy Làn đến trộn 1,3 – 5,0×107 VCMB hình ảnh băng điện di tương đồng với 2, tức số lượng vi bọt bổ sung – chưa đủ khả để gắn triệt để lượng pADN trộn vào mẫu, quan sát thấy vệt màu pADN giữ lại vị trí giếng gel Kết điện di từ đến (Hình 3.4) cho thấy VCMB liên kết với pADN phụ thuộc nồng độ vi bọt Lượng VCMB cao tạo phức hợp với pADN khơng cịn pADN tự chạy phía điện cực dương (làn – 8), khơng cịn thấy vạch pADN tương đồng với Kết gợi ý hiệu tải pADN VCMB phù hợp μg pADN/10×107 VCMB (làn 6), nồng độ nhỏ – Kết gần với nghiên cứu tác giả Carson A.R cộng tìm nồng độ phù hợp cho tải gen 100 μg plasmid/109 vi bọt [6] Hơn nữa, không cần thiết phải sử dụng lượng vi bọt nhiều (làn 7: 20×107 VCMB; 8: 40×107 VCMB) để gắn kết lượng pADN, gây lãng phí nguyên liệu xuất vi bọt dư không gắn pADN Tuy nhiên, vệt màu pADN vị trí giếng đến đậm dần, điều cho thấy rõ ràng hiệu suất "bắt giữ" pADN nồng độ vi bọt lớn cao Chính vậy, nghiên cứu khảo sát nhiều nồng độ vùng từ 10 – 40 ×107 VCMB phối hợp thêm phương pháp định lượng pADN dư để cân nhắc lựa chọn nồng độ tối ưu vi bọt để tải gen Cụ thể, phương pháp định lượng pADN dư triển khai ngắn gọn sau: trộn lượng xác định pADN với nồng độ vi bọt biết, sau ly tâm định lượng pADN dư dung dịch rửa giải, từ tính lượng pADN gắn vào vi bọt, tính hiệu suất tải gen Tuy vậy, lựa chọn phương pháp điện di cho thí nghiệm 48 nhằm hạn chế thêm bước ly tâm (so với phương pháp định lượng pADN dư) tăng khả làm vỡ vi bọt Các MB đối chứng tạo phức hợp với pADN tất mức nồng độ vi bọt, mức cao (160×107 MB), gấp 16 lần so với mức phù hợp để tạo phức hợp VCMB-pADN (10×107 – 6), thấy rõ vết pADN tồn tự hình ảnh điện di (làn – 11), tương đồng với băng điện di (pADN tự do) (Hình 3.4) Kết hoàn toàn phù hợp với kết zeta VCMB dương nhiều so với MB (Bảng 3.3), nên VCMB có khả gắn kết với pADN mang điện âm Dữ liệu chứng tỏ lớp lipid dương (DPTAP) quan trọng để tạo lớp vỏ vi bọt có khả gắn với pADN nhờ tương tác tĩnh điện MB khơng có thành phần DPTAP lớp vỏ nên khơng có khả gắn với pADN tốt VCMB 4.2.3 Về kết đánh giá khả bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase hệ vi bọt Khi lưu thơng tuần hồn, acid mucleic dễ bị thủy phân enzym, ví dụ endonuclease Nếu gen trị liệu tải lên vi bọt bị thủy phân trước vi bọt vận chuyển đến đích khơng xảy chuyển gen liệu pháp gen coi thất bại Cấu trúc vi bọt bao bọc cho gen tải, che chắn hạn chế tiếp cận không gian enzym thủy phân vào chất (gen trị liệu), qua ngăn q trình thủy phân gen trị liệu Để chứng minh khả bảo vệ gen HSV-TK (dưới dạng pADN) phức hợp VCMB-pADN khỏi thủy phân endonuclease, tiến hành thí nghiệm sử dụng phương pháp điện di gel agarose bổ sung DNase I (một loại endonuclease) vào mẫu điện di Kết điện di Hình 3.5 cho thấy, với pADN tự (khơng tiếp xúc với DNase I) xuất băng điện di pADN (làn 1) Làn cho thấy phân hủy hồn tồn pADN có xuất DNase I 10 phút Lần ủ đồng thời pADN với DNase I EDTA dẫn đến không làm giảm chất lượng bảo toàn tất 49 dải Để so sánh khả bảo vệ gen khỏi endonulease loại vi bọt, pADN ủ với VCMB (làn 4) MB đối chứng (làn 6) trước tiếp xúc với DNase I Hình ảnh điện di pADN ủ với MB đối chứng hầu hết dẫn đến dải (làn 6), cho thấy pADN bị giáng hóa nhiều Trong đó, hình ảnh điện di pADN liên kết với VCMB cho thấy bảo toàn hầu hết dải (làn 4), tương đồng với 3, điều chứng minh phức hợp VCMB bảo vệ pADN khỏi thủy phân DNase I Làn xuất thêm vạch sáng pADN gần miệng giếng tra mẫu, chứa VCMB có khả "bắt giữ" pADN có lớp màng lipid DPTAP tích điện dương ức chế di động cực dương pADN (phù hợp với kết điện di thí nghiệm trước (Hình 3.4)) Làn xuất vạch pADN giếng tra mẫu mảnh vỡ VCMB khả tương tự Làn ủ pADN với mảnh vi bọt VCMB MB đối chứng Làn cho thấy khả bảo vệ phần nhỏ pADN khỏi phân hủy DNase I, chứng tỏ vi bọt VCMB bị phá vỡ thành mảnh khả bảo vệ so với VCMB hoàn chỉnh (Làn 4) Ngược lại, bị giáng hóa tồn Từ đây, VCMB có khả bảo vệ pADN khỏi DNase I tốt so với mảnh VCMB MB đối chứng, nhận định tương đồng với nghiên cứu trước [6] 4.2.4 Về kết xác định cấu trúc sinh học hệ vi bọt kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi điện tử truyền qua đơng lạnh Thí nghiệm xác định hình dạng hệ vi bọt cách chụp hình ảnh thơng qua hai dụng cụ kính hiển vi huỳnh quang kính hiển vi điện tử truyền qua đơng lạnh (cryo-TEM) điều kiện đủ để nghiên cứu xác nhận có tải gen liên hợp kháng thể lên bề mặt lớp vỏ vi bọt Cụ thể, kết Hình 3.6 cho thấy, hình ảnh vi bọt chụp với trường ánh sáng trắng (Hình 3.6A), hình ảnh màu huỳnh quang xanh FITC-avidin (Hình 3.6B) 50 hình ảnh màu đỏ pADN bắt màu nhuộm PI (Hình 3.6C) đồng vị trí với Kết chứng tỏ, kháng thể pADN xuất vị trí vi bọt, bám vào vi bọt Như vậy, kết hình ảnh huỳnh quang chứng minh kháng thể kháng VEGFR2 gắn thành công (qua cầu nối biotin-avidin) gen HSV-TK (dưới dạng pADN) gắn lên bề mặt lớp vỏ lipid mang điện tích dương vi bọt Để khẳng định thêm vị trí kháng thể thực gắn đâu vi bọt, cryo-TEM sử dụng để chụp hình ảnh thực tế VCMB Hình 3.7A cho thấy hình dạng vi bọt VCMB chụp có dạng gần cầu; Hình 3.7B khẳng định có xuất lớp kháng thể (mũi tên đen) gắn bên lớp màng lipid hệ vi bọt Kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh phương pháp đại ứng dụng nhiều để giải cấu trúc vật thể phân tử sinh học Giải Nobel Hóa học 2017 trao cho Jacques Dubochet, Joachim Frank Richard Henderson Họ nhà khoa học phát triển phương pháp kính hiển vi điện tử đơng lạnh (cryo-TEM) để xác định cấu trúc có độ phân giải cao phân tử sinh học dung dịch mang tính cách mạng khoa học [43] Mặt khác số nghiên cứu trước đó, cryo-TEM sử dụng để chụp ảnh vi bọt khẳng định gắn kết phối tử lên bề mặt vỏ vi bọt [8], [23] Chính vậy, kết hình ảnh chụp hệ vi bọt (Hình 3.7) cryo-TEM có độ tin cậy khẳng định chắn hệ vi bọt tạo có gắn kháng thể kháng VEGFR2 bên bề mặt lớp vỏ vi bọt 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau tiến hành nghiên cứu tạo hệ vi bọt mang gen HSV-TK gắn kháng thể kháng VEGFR2, luận văn thu kết sau đây: Về đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2: - Hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 có đường kính 1,05 ± 0,01 (µm) theo số lượng, 3,57 ± 0,31 (µm) theo thể tích; nồng độ 10,75 ± 1,14 (109 vi bọt/ml) zeta -3,79 ± 1,91 (mV) Về đánh giá đặc điểm sinh học hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2: - Hệ vi bọt có khả liên hợp với kháng thể kháng VEGFR2 đánh giá gián tiếp qua cường độ huỳnh quang FITC-avidin VCMB-pADN 85,38 ± 4,84% tổng số avidin bổ sung - Hiệu tải pADN hệ vi bọt với tỉ lệ phù hợp μg pADN/10×107 VCMB - Phức hợp vi bọt VCMB với pADN bảo vệ pADN khỏi phân hủy endonuclease (DNase I) - Hình ảnh huỳnh quang cryo-TEM khẳng định pADN kháng thể kháng VEGFR2 gắn thành công bề mặt lớp vỏ vi bọt KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài nguồn kinh phí có hạn, luận văn nhận thấy kết bước đầu sơ khai cơng trình nghiên cứu, xin đưa kiến nghị: - Khảo sát thêm phương pháp định lượng pADN dư để đánh giá hiệu suất tải gen lên vi bọt 52 - Đánh giá thêm độ ổn định hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 - Triển khai đánh giá khả chuyển gen biểu gen HSV-TK mơ hình in vitro để từ làm tiền đề đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư hệ vi bọt mang gen HSV-TK kháng thể kháng VEGFR2 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Ahn Y H., Yi H., et al (2012), "STAT3 silencing enhances the efficacy of the HSV.tk suicide gene in gastrointestinal cancer therapy", Clin Exp Metastasis, 29(4), pp 359-69 Beltinger C., Fulda S., et al (1999), "Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-induced apoptosis involves ligand-independent death receptor aggregation and activation of caspases", Proc Natl Acad Sci U S A, 96(15), pp 8699-704 Bondanza A., Hambach L., et al (2011), "IL-7 receptor expression identifies suicide gene-modified allospecific CD8+ T cells capable of self-renewal and differentiation into antileukemia effectors", Blood, 117(24), pp 6469-78 Borden M A., Kruse D E., et al (2005), "Influence of lipid shell physicochemical properties on ultrasound-induced microbubble destruction", IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control, 52(11), pp 1992-2002 Burgess A., Huang Y., et al (2012), "Focused ultrasound for targeted delivery of siRNA and efficient knockdown of Htt expression", J Control Release, 163(2), pp 125-9 Carson A R., McTiernan C F., et al (2011), "Gene therapy of carcinoma using ultrasound-targeted microbubble destruction", Ultrasound Med Biol, 37(3), pp 393-402 Caruso M., Panis Y., et al (1993), "Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduction of a suicide gene", Proc Natl Acad Sci U S A, 90(15), pp 7024-8 Chang E L., Ting C Y., et al (2017), "Angiogenesis-targeting microbubbles combined with ultrasound-mediated gene therapy in brain tumors", J Control Release, 255, pp 164-175 Chen X., Zheng Z., et al (2017), "MAPK, NFkappaB, and VEGF signaling pathways regulate breast cancer liver metastasis", Oncotarget, 8(60), pp 101452-101460 10 Chen Y., Liu Y., et al (2017), "Quantification of STAT3 and VEGF expression for molecular diagnosis of lymph node metastasis in breast cancer", Medicine (Baltimore), 96(45), pp e8488 11 Cochran Michael, Wheatley Margaret A (2013), "In vitro gene delivery with ultrasound-triggered polymer microbubbles", Ultrasound in medicine & biology, 39(6), pp 1102-1119 12 Cui Wenjin, Bei Jianzhong, et al (2005), "Preparation and evaluation of poly(L-lactide-co-glycolide) (PLGA) microbubbles as a contrast agent for myocardial contrast echocardiography", Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 73B(1), pp 171-178 13 Culver K W., Ram Z., et al (1992), "In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors", Science, 256(5063), pp 1550-2 14 Endo-Takahashi Y., Negishi Y., et al (2012), "Efficient siRNA delivery using novel siRNA-loaded Bubble liposomes and ultrasound", Int J Pharm, 422(12), pp 504-9 15 Endo-Takahashi Y., Negishi Y., et al (2013), "pDNA-loaded Bubble liposomes as potential ultrasound imaging and gene delivery agents", Biomaterials, 34(11), pp 2807-13 16 Eschbach R S., Clevert D A., et al (2017), "Contrast-Enhanced Ultrasound with VEGFR2-Targeted Microbubbles for Monitoring Regorafenib Therapy Effects in Experimental Colorectal Adenocarcinomas in Rats with DCE-MRI and Immunohistochemical Validation", PLoS One, 12(1), pp e0169323 17 Escoffre J M., Novell A., et al (2013), "Irinotecan delivery by microbubbleassisted ultrasound: in vitro validation and a pilot preclinical study", Mol Pharm, 10(7), pp 2667-75 18 Fan C H., Chang E L., et al (2016), "Folate-conjugated gene-carrying microbubbles with focused ultrasound for concurrent blood-brain barrier opening and local gene delivery", Biomaterials, 106, pp 46-57 19 Fan C H., Ting C Y., et al (2013), "SPIO-conjugated, doxorubicin-loaded microbubbles for concurrent MRI and focused-ultrasound enhanced braintumor drug delivery", Biomaterials, 34(14), pp 3706-15 20 Fan Ching-Hsiang, Ting Chien-Yu, et al (2016), "Noninvasive, Targeted and Non-Viral Ultrasound-Mediated GDNF-Plasmid Delivery for Treatment of Parkinson’s Disease", Scientific Reports, 6(1), pp 19579 21 Ferrara K W., Borden M A., et al (2009), "Lipid-shelled vehicles: engineering for ultrasound molecular imaging and drug delivery", Acc Chem Res, 42(7), pp 881-92 22 Fulci G., Chiocca E A (2007), "The status of gene therapy for brain tumors", Expert Opin Biol Ther, 7(2), pp 197-208 23 Hernandez Christopher, Gulati Sahil, et al (2017), "Cryo-EM Visualization of Lipid and Polymer-Stabilized Perfluorocarbon Gas Nanobubbles - A Step Towards Nanobubble Mediated Drug Delivery", Scientific Reports, 7(1), pp 13517 24 Ibsen S., Schutt C E., et al (2013), "Microbubble-mediated ultrasound therapy: a review of its potential in cancer treatment", Drug Des Devel Ther, 7, pp 375-88 25 Kakinoki K., Nakamoto Y., et al (2010), "Prevention of intrahepatic metastasis of liver cancer by suicide gene therapy and chemokine ligand 2/monocyte chemoattractant protein-1 delivery in mice", J Gene Med, 12(12), pp 1002-13 26 Korpanty G., Grayburn P A., et al (2005), "Targeting vascular endothelium with avidin microbubbles", Ultrasound Med Biol, 31(9), pp 1279-83 27 Kotterman M A., Chalberg T W., et al (2015), "Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook", Annu Rev Biomed Eng, 17, pp 63-89 28 Lu-Emerson C., Duda D G., et al (2015), "Lessons from anti-vascular endothelial growth factor and anti-vascular endothelial growth factor receptor trials in patients with glioblastoma", J Clin Oncol, 33(10), pp 1197-213 29 Marukawa Y., Nakamoto Y., et al (2012), "Membrane-bound form of monocyte chemoattractant protein-1 enhances antitumor effects of suicide gene therapy in a model of hepatocellular carcinoma", Cancer Gene Ther, 19(5), pp 312-9 30 Matsumoto T., Bohman S., et al (2005), "VEGF receptor-2 Y951 signaling and a role for the adapter molecule TSAd in tumor angiogenesis", EMBO J, 24(13), pp 2342-53 31 McGeoch Duncan J., Rixon Frazer J., et al (2006), "Topics in herpesvirus genomics and evolution", Virus Research, 117(1), pp 90-104 32 Mulvana H., Browning R J., et al (2017), "Characterization of Contrast Agent Microbubbles for Ultrasound Imaging and Therapy Research", IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control, 64(1), pp 232-251 33 Musumeci F., Radi M., et al (2012), "Vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors: drugs and new inhibitors", J Med Chem, 55(24), pp 10797822 34 Omata D., Negishi Y., et al (2011), "Bubble liposomes and ultrasound promoted endosomal escape of TAT-PEG liposomes as gene delivery carriers", Mol Pharm, 8(6), pp 2416-23 35 Park S A., Jeong M S., et al (2018), "Structure and function of vascular endothelial growth factor and its receptor system", BMB Rep, 51(2), pp 7378 36 Pillai R., Marinelli E R., et al (2010), "A phospholipid-PEG2000 conjugate of a vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR2)-targeting heterodimer peptide for contrast-enhanced ultrasound imaging of angiogenesis", Bioconjug Chem, 21(3), pp 556-62 37 Podell S., Burrascano C., et al (1999), "Physical and biochemical stability of Optison, an injectable ultrasound contrast agent", Biotechnol Appl Biochem, 30(3), pp 213-23 38 Pysz Marybeth A., Machtaler Steven B., et al (2014), "Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Type 2–targeted Contrast-enhanced US of Pancreatic Cancer Neovasculature in a Genetically Engineered Mouse Model: Potential for Earlier Detection", Radiology, 274(3), pp 790-799 39 Riquelme E., Suraokar M., et al (2014), "VEGF/VEGFR-2 upregulates EZH2 expression in lung adenocarcinoma cells and EZH2 depletion enhances the response to platinum-based and VEGFR-2-targeted therapy", Clin Cancer Res, 20(14), pp 3849-61 40 Robe P A., Princen F., et al (2000), "Pharmacological modulation of the bystander effect in the herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir gene therapy system: effects of dibutyryl adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, alpha-glycyrrhetinic acid, and cytosine arabinoside", Biochem Pharmacol, 60(2), pp 241-9 41 Schirosi L., De Summa S., et al (2017), "VEGF and TWIST1 in a 16biomarker immunoprofile useful for prognosis of breast cancer patients", Int J Cancer, 141(9), pp 1901-1911 42 Schneider M (1999), "Characteristics of SonoVuetrade mark", Echocardiography, 16(7, Pt 2), pp 743-746 43 Shen P S (2018), "The 2017 Nobel Prize in Chemistry: cryo-EM comes of age", Anal Bioanal Chem, 410(8), pp 2053-2057 44 Sirsi S., Borden M (2009), "Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications", Bubble Sci Eng Technol, 1(1-2), pp 3-17 45 Takahashi M (2005), "Zeta potential of microbubbles in aqueous solutions: electrical properties of the gas-water interface", J Phys Chem B, 109(46), pp 21858-64 46 Tomicic M T., Thust R., et al (2002), "Ganciclovir-induced apoptosis in HSV-1 thymidine kinase expressing cells: critical role of DNA breaks, Bcl-2 decline and caspase-9 activation", Oncogene, 21(14), pp 2141-53 47 Touraine R L., Ishii-Morita H., et al (1998), "The bystander effect in the HSVtk/ganciclovir system and its relationship communication", Gene Therapy, 5(12), pp 1705-1711 to gap junctional 48 Wang D S., Panje C., et al (2012), "Cationic versus neutral microbubbles for ultrasound-mediated gene delivery in cancer", Radiology, 264(3), pp 721-32 49 Wang F., Cheng Y., et al (2009), "Focused ultrasound microbubble destruction-mediated changes in blood-brain barrier permeability assessed by contrast-enhanced magnetic resonance imaging", J Ultrasound Med, 28(11), pp 1501-9 50 Weller S K., Coen D M (2012), "Herpes simplex viruses: mechanisms of DNA replication", Cold Spring Harb Perspect Biol, 4(9), pp a013011 51 Yamamoto Kouji, Shiraki Katsuya, et al (2005), "1.5 Harmonic Imaging Sonography with microbubble contrast agent improves characterization of hepatocellular carcinoma", World journal of gastroenterology, 11(36), pp 5607-5613 52 Yan J D., Liu Y., et al (2015), "Expression and prognostic significance of VEGFR-2 in breast cancer", Pathol Res Pract, 211(7), pp 539-43 53 Yin X., Yu B., et al (2013), "Bifidobacterium infantis-mediated HSVTK/GCV suicide gene therapy induces both extrinsic and intrinsic apoptosis in a rat model of bladder cancer", Cancer Gene Ther, 20(2), pp 77-81 54 Zhang S., Gao X., et al (2017), "Immunoglobulin-like domain 4-mediated ligand-independent dimerization triggers VEGFR-2 activation in HUVECs and VEGFR2-positive breast cancer cells", Breast Cancer Res Treat, 163(3), pp 423-434 55 Zhou S., Li S., et al (2010), "Ultrasound-targeted microbubble destruction mediated herpes simplex virus-thymidine kinase gene treats hepatoma in mice", J Exp Clin Cancer Res, 29, pp 170 56 Zhou X L., Shi Y L., et al (2014), "Inhibitory effects of the ultrasoundtargeted microbubble destruction-mediated herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir system on ovarian cancer in mice", Exp Ther Med, 8(4), pp 1159-1163 57 Zhou Yu, Gu Haitao, et al (2015), "Targeted Antiangiogenesis Gene Therapy Using Targeted Cationic Microbubbles Conjugated with CD105 Antibody Compared with Untargeted Cationic and Neutral Microbubbles", Theranostics, 5(4), pp 399-417 58 Zhou Z., Liu X., et al (2017), "Nonviral cancer gene therapy: Delivery cascade and vector nanoproperty integration", Adv Drug Deliv Rev, 115, pp 115-154 Tài liệu website 59 https://genome.ucsc.edu/cgibin/hgTracks?db=hg38&lastVirtModeType=default&lastVirtModeExtraStat e=&virtModeType=default&virtMode=0&nonVirtPosition=&position=chr4 %3A55078480%2D55125594&hgsid=1150940379_LmEziuAYv3TFrotDkY jBOLtkjOjD 60 https://www.uniprot.org/uniprot/O55259 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHI TOÀN ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM LÝ HỌC VÀ SINH HỌC CỦA HỆ VI BỌT MANG GEN HSVTK VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2022 ... đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV- TK kháng thể kháng VEGFR2 28 2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học hệ vi bọt mang gen HSVTK kháng thể kháng VEGFR2. .. lý học sinh học hệ vi bọt mang gen HSV- TK kháng thể kháng VEGFR2? ?? với hai mục tiêu sau: Đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ zeta) hệ vi bọt mang gen HSV- TK kháng thể kháng VEGFR2 Đánh giá. .. HSV- TK khỏi DNase hệ vi bọt + Xác định cấu trúc sinh học hệ vi bọt kính hiển vi huỳnh quang cryo-TEM 24 Đánh giá đặc điểm lý học sinh học hệ vi bọt mang gen HSV- TK kháng thể kháng VEGFR2 Đánh giá