Xây dựng phương pháp LCMSMS phân tích lisinopril trong huyết tương người và ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THÙY DUNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THÙY DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THÙY DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

LỜI CÁM ƠN

Luận văn được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Trần Nguyên Hà – Trường

Đại học Dược Hà Nội và TS Tạ Mạnh Hùng – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Để

hoàn thành luận văn này:

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy cô

hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận

văn

Tôi xin gửi cám ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo, các Thầy Cô Bộ

môn Hóa Phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời

gian học tập tại trường

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo, các Thầy

Cô cùng đồng nghiệp Khoa Dược – Đại học Y Dược Hải Phòng đã tạo điều kiện cho tôi

trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thị Dung, DS Phạm Thanh Huyền và toàn

thể cán bộ của Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã

giúp đỡ và động viện và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận

MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Lisinopril 3

1.1.1 Tính chất 3

1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học 3

1.1.3 Chỉ định và chống chỉ định 5

1.1.4 Một số phương pháp định lượng lisinopril trong chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học 5

1.2 Sắc lý lỏng – khối phổ (LC-MS) 8

1.3 Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học 10

1.3.1 Kỹ thuật xử lý mẫu 10

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 11

1.4 Tổng quan về sinh khả dụng và tương đương sinh học 14

1.4.1 Khái niệm chung 14

1.4.2 Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học 14

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 19

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 19

2.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.1 Mẫu huyết tương 20

2.2.2 Mẫu thuốc 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích trên hệ thống LC-MS/MS 21

2.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích 22

2.5 Xác định nồng độ thuốc trong huyết tương của người tình nguyện 27

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 27

2.5.2 Cho uống thuốc, lấy mẫu máu 27

2.5.3 Định lượng lisinopril trong huyết tương 27

2.5.4 Phân tích dược động học và đánh giá kết quả 28

2.5.5 Thông qua hội đồng đạo đức 29

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp phân tích 30

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ phân tích lisinopril 30

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 32

3.1.3 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương 34

3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 36

3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 38

3.2.1 Độ đặc hiệu- chọn lọc 38

3.2.2 Ảnh hưởng của nền mẫu 40

3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 41

3.2.4 Xác định giới hạn định lượng dưới 42

3.2.5 Độ đúng - độ chính xác trong ngày 44

3.2.6 Tỷ lệ thu hồi của phương pháp 49

3.2.7 Khảo sát độ ổn định 50

3.3 Kết quả đánh giá TĐSH viên nén Lizectric 10 mg 57

3.3.1 Tuyển chọn NTN 57

3.3.2 Uống thuốc và lấy máu 57

3.3.3 Định lượng lisinopril trong máu NTN sau khi uống thuốc thử và chứng 58

3.3.4 Phân tích dược động học và đánh giá tương đương sinh học 63

Chương 4: BÀN LUẬN 67

4.1 Phương pháp phân tích định lượng lisinopril trong huyết tương người 67

4.1.1 Phương pháp định lượng lisinopril 67

4.1.2 Kỹ thuật xử lý mẫu 67

4.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 68

4.2 Kết quả phân tích mẫu huyết tương NTN 69

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AN Chất phân tích (Analyte)

ASEAN Liên hiệp các quốc gia Đông Nam Á

AUC Diện tích dưới đường cong

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao

LLOQ Giới hạn định lượng dưới

LQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp

QC Mẫu kiểm tra

SQC Mẫu kiểm tra bổ sung

TĐSH Tương đương sinh học

Tmax Thời gian đạt nồng độ cực đại

TFA Trifluoroacetic

ULOQ Giới hạn định lượng trên

US-FDA Hiệp hội thực dược phẩm Mỹ

UV-VIS Tử ngoại - khả kiến

VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

v/v Thể tích/thể tích

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của lisinopril 3

Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khổi phổ 8

Hình 1.3: Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập 3 9

Hình 3.1: Khối phổ MS dung dịch chuẩn LISI… 30

Hình 3.2: Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 406 Da 31

Hình 3.3: Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [LISI-H] + 31

Hình 3.4: Giản đồ năng lượng phân mảnh [LISI-H] + 32

Hình 3.5: SKĐ mẫu chuẩn chứa LISI khi sử dụng hệ pha động MeOH-amoniformat pH4 (70:30, v/v) 33

Hình 3.6: SKĐ mẫu chuẩn chứa LISI khi sử dụng hệ dung môi pha động 33

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa LISI khi sử dụng hệ MeOH-acid forcmic 0,1% (50:50, v/v) 33

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa LISI khi chiết lỏng lỏng 34

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chuẩn chứa LISI khi tủa protein 35

Hình 3.10: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn IS 36

Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (Blank) 39

Hình 3.12: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuẩn LISI ở nồng độ 1 ng/mL 39

Hình 3.13: Đường cong trung bình nồng độ Lisinopril theo thời gian của 24 NTN 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt các thông số dược động học của LISI trong một số nghiên cứu 4

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng lisinopril bằng LC-MS/MS 6

Bảng 2.1: Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương 24

Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương 24

Bảng 2.3: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương 24

Bảng 3.1: Điều kiện khối phổ định lượng LISI và IS… 38

Bảng 3.2: Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống 39

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng Rt của LISI và IS 40

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu 41

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát đường chuẩn theo mô hình weighting 1/x 2 42

Bảng 3.6: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới trong 3 ngày 43

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu LLOQ (1,0 ng/mL) 45 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu LQC (3,0 ng/mL) 45

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu MQC (101,5 ng/mL) 46

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu HQC (162,5 ng/mL) 46

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng- độ chính xác trong ngày mẫu SQC (24,4 ng/mL) 47 Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ chính xác khác ngày (n=5) 47

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS 49

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của Lisinopril 50

Bảng 3.15: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội gốc thời gian ngắn nhiệt độ phòng 51

Bảng 3.16: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội gốc thời gian dài ở nhiệt độ 2 0 C – 8 0 C 52

Bảng 3.17: Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ 53

Bảng 3.18: Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 5 chu kỳ đông–rã 54

Bảng 3.19: Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 55

Bảng 3.20: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong autosampler 56

Bảng 3.21: Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo 56

Bảng 3.22: Kết quả ngẫu nhiên và phác đồ sử dụng thuốc 57

Bảng 3.23: Nồng độ lisinopril throng huyết tương sau khi uống thuốc thử (ng/mL) 59

Bảng 3.24: Nồng độ Lisinopril trong huyết tương sau khi uống thuốc chứng (ng/mL) 61

Bảng 3.25: Các thông số dược động học của NTN sau khi uống thuốc thử và thuốc chứng 63

Bảng 3.26: Phân tích phương sai giá trị C max , AUC last , AUC inf 64

Bảng 3.27: Tóm tắt số liệu so sánh sinh khả dụng 65

Bảng 3.28: So sánh giá trị T max theo phương pháp thống kê phi tham số 65

Bảng 3.29: DĐH của ZESTRIL trên 24 NTN Việt Nam và số liệu DĐH đã được công bố của AC Leary 70

Bảng 3.30: Các thông số khám và xét nghiệm lâm sàng của 24 NTN chính thức tham gia

nghiên cứu Error! Bookmark not defined

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh về tim mạch là bệnh phổ biến trong cộng đồng và nếu không điều trị đúng đắn và kịp thời sẽ dẫn tới nhiều biến chứng nguy hiểm, thậm trí có thể gây tử vong

Lisinopril, (S)-1-[N2-(1-carboxy-3-phenylpropyl)-L-lysyl]-L-prolin là thuốc ức chế men

chuyển (ACE) và là một dẫn chất lysin có cấu trúc tương tự enalapril với tác dụng kéo dài Thuốc được dùng chỉ định cho người tăng huyết áp (dùng đơn trị liệu và trong phối hợp thuốc) và điều trị phụ trợ suy tim [1] Theo thực tế lâm sàng, lisinopril là một trong những thuốc hiệu quả nhất trong lớp thuốc ức chế men chuyển angiotensin ACE, nên lisinopril được sử dụng rộng rãi trong điều trị

Trên thị trường Việt Nam có khá nhiều chế phẩm chứa hoạt chất lisinopril như viên nén 2,5 mg; 5 mg; 10 mg; 20 mg; 30 mg và 40 mg hoặc ở dạng phối hợp viên nén lisinopril kết hợp với 12,5 mg hoặc 25 mg hydrocorothiazid , tuy nhiên hầu hết đều chưa được đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) với biệt dược gốc để chứng minh khả năng thay thế so với thuốc biệt dược gốc trên lâm sàng Vì vậy, để góp phần nâng cao chất lượng thuốc trong nước, cung cấp các thuốc chứa lisonopril có chất lượng tốt với giá thành hợp lý, thay thế các thuốc biệt dược gốc tới người bệnh, thì việc đánh giá TĐSH giữa chế phẩm chứa lisinopril với biệt dược gốc là cần thiết

Đối với các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là phải xây dựng được một phương pháp định lượng đủ độ nhạy và đủ

độ tin cậy Với lisinopril, quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thấp Ở mức liều 10 mg, nồng độ lisinopril tối đa (Cmax) trong huyết tương người khoảng 61 ng/mL [18], ngoài ra do nền mẫu dịch sinh học thường rất phức tạp, các thiết bị thông thường như máy quang phổ, sắc ký lỏng không đủ

độ nhạy, thời gian phân tích kéo dài và quy trình xử lý mẫu phức tạp [11], [14], [23]

Hiện nay, bằng việc phối hợp kỹ thuật sắc ký lỏng và phân tích khối phổ hai lần có thể giải quyết được vấn đề về độ chọn lọc, độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp phân

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp LC-MS/MS phân tích

lisinopril trong huyết tương người và ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng lisinopril trong huyết tương bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

2 Ứng dụng phương pháp định lượng nồng độ lisinopril trong huyết tương người tình nguyện và đánh giá TĐSH chế phẩm viên nén lisinopril sản xuất tại Việt Nam

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Lisinopril

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của lisinopril

Công thức phân tử của lisinopril: C21H31N3O5 [10]

Khối lượng phân tử của lisinopril: 405,488 g/mol

1.1.2.1 Dược lý và cơ chế tác dụng

Lisinopril là thuốc ức chế enzym chuyển angiotensin và là một dẫn chất lysin có cấu trúc tương tự enalapril với tác dụng kéo dài.Enzym chuyển angiotensin là một enzym nội sinh có vai trò chuyển angiotesin I thành angiotensin II Angiotensin I tăng trong một số bệnh như suy tim và bệnh thận, do đáp ứng tăng với renin Angiotensin II có tác dụng kích thích tăng trưởng cơ tim, gây tim to (phì đại cơ tìm) và tác dụng co mạch, gây tăng huyết áp Thuốc ức chế enzym chuyển làm giảm nồng độ angiotensin II và aldosteron

do đó làm giảm ứ Na+ và nước, làm giãn mạch ngoại vi, làm giảm sức cản ngoại vi ở cả đại tuần hoàn và tuần hoàn phổi Ngoài ra thuốc còn ảnh hưởng tới hệ kallikrein-kinin, làm giảm sự phân hủy của bradykinin, dẫn đến tăng nồng độ của bradykinin, đây chính là nguyên nhân gây ra một số tác dụng không mong muốn như phù mạch và ho kéo dài của các thuốc ức chế men chuyển [1]

1.1.2.2 Dược động học

Lisinopril được hấp thu chậm và không hoàn toàn qua đường tiêu hóa Sự hấp thu của lisinopril rất khác nhau giữa các cá thể, có thể từ 6 - 60% liều dùng được hấp thu, nhưng trung bình khoảng 25% Bản thân lisinopril là một diacid có sẵn hoạt tính khi vào trong cơ thể không cần phải qua quá trình chuyển hóa mới có hoạt tính như một số thuốc ức chế enzym chuyển khác; đạt nồng độ tối đa trong huyết tương sau khoảng 7 giờ và duy trì tác dụng khoảng 24 giờ Lisinopril gắn với protein huyết tương khoảng 25% Thuốc thải trừ qua nước tiểu ở dạng không biến đổi Nửa đời thải trừ sau khi uống nhiều liều ở người bệnh

có chức năng thận bình thường là 12 giờ [1]

Bảng 1.1: T óm tắt các thông số dược động học của LISI trong một số nghiên cứu

Liều đơn

10 mg,

26 NTN

60,41 ± 20,07*

6,77 ± 1,03

792,73 ± 273,41

841,66 ± 286,07

11,68 ± 4,94

[18] 61,11 ±

19,36**

6,35 ± 0,56

862,74 ± 303,81

906,97 ± 318,72

10,03 ± 1,90 Liều đơn

[19] 78,5 ±

45,1**

7,0 ± 1,39 948,3 ± 531,8 974,4 ± 532,7 10,6 ±

6,4 Liều đơn

20 mg,

24 NTN

90,55 ± 66,04*

6,00 ± 0,4

1063,05 ± 849,58

1181,43 ± 849,99

6,786 ± 1,115

[10] 95,62 ±

66,33**

6,58 ± 0,4

1160,51 ± 848,04

1264,94 ± 837,79

6,554 ± 2,534 (*): thuốc thử; (**): thuốc chứng

Các thông số dược động học của LISI (bảng 1.1) cho thấy: sau khi uống viên nén LISI với mức liều 10 mg và 20 mg, nồng độ Cmax dao động từ 60 – 95 ng/mL Vì vậy phương pháp phân tích trong dịch sinh học cần có giới hạn định lượng dưới khoảng từ 1 - 2 ng/mL (khoảng 1/30 – 1/20 Cmax) và giới hạn định lượng trên của đường chuẩn khoảng 200 ng/mL (khoảng 2-3 lần Cmax)

1.1.3 Chỉ định và chống chỉ định

- Điều trị tăng huyết áp: Dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc điều trị tăng huyết

áp khác như thuốc lợi tiểu thiazid, thuốc chẹn alpha hoặc chẹn kênh calci

- Điều trị suy tim: Dùng phối hợp lisinopril với các glycosid tim và các thuốc lợi tiểu

để điều trị suy tim sung huyết cho người bệnh đã dùng glycosid tim hoặc thuốc lợi tiểu đơn thuần mà không đỡ

- Nhồi máu cơ tim cấp có huyết động ổn định: Dùng phối hợp lisinopril với các thuốc làm tan huyết khối, aspirin và/hoặc các thuốc chẹn beta để cải thiện thời gian sống của người bệnh nhồi máu cơ tim cấp có huyết động ổn định Nên dùng lisiopril ngay trong vòng

24 giờ sau cơn nhồi máu cơ tim xảy ra

- Điều trị bệnh thận do đái tháo đường

1.1.4 Một số phương pháp định lượng lisinopril trong chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học

Để định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) thường sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý (điện di mao quản, sắc ký khí, sắc ký lỏng ) Do nền mẫu dịch sinh học thường rất phức tạp, các kỹ thuật phân tích như HPLC kết nối detector UV thường không đủ độ nhạy để phát hiện và định lượng chính xác nồng độ thuốc Hiện nay với kỹ thuật LC-MS/MS với ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc, các pic không cần phải tách khỏi nhau, nên ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc trong dịch sinh học đặc biệt là thuốc có hàm lượng thấp như lisinopril Một số nghiên cứu định lượng lisinopril bằng LC-MS/MS được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng lisinopril bằng LC-MS/MS

- Pha động: Ammonium acetat methanol (70:30)

- Phương pháp 3, 4: Sử dụng detector khối phổ, sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn nên chi phí thí nghiệm tốn kém Với phương pháp [14] có thời gian phân tích khá dài (khoảng 6,5 phút), với phương pháp [10] có giới hạn định lượng cao (6 ng/mL)

- Phương pháp 5: Sử dụng detector khối phổ có giới hạn định lượng thấp (0,46 ng/mL) phù hợp với yêu cầu đề ra, tuy nhiên sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn nên tương đối tốn kém

về chi phí thí nghiệm

- Phương pháp 7, 8: Định lượng LISI bằng HPLC với detector FL, phương pháp này

có ưu điểm nổi bật là trang thiết bị khá phổ biến Tuy nhiên, giới hạn định lượng cao (5 ng/mL) [16], 8 ng/mL [8]; thời gian phân tích khá dài (25 phút) [16], 20 phút [8] Ngoài ra, còn sử dụng kỹ thuật sử lý mẫu phức tạp là phải dẫn suất hóa trước cột và sử dụng kỹ thuật chiết SPE nên chi phí thí nghiệm tương đối tốn kém Do đó, các phương pháp này không phù hợp để phân tích một số lượng mẫu lớn trong nghiên cứu TDSH

1.2 Sắc lý lỏng – khối phổ (LC-MS)

Nguyên tắc của kỹ thuật này là đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)

được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong hệ chân không có áp suất từ 10-6 Pa đến 10-3 Pa

Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khổi phổ

Một thiết bị phân tích MS bao gồm các bộ phận chính: Bộ nạp mẫu (inlet), bộ nguồn ion hoá (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện – đếm lượng ion (detector – đầu dò) và bộ phận ghi/xử lý số liệu (data system)

Trong số các phương pháp LC-MS, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch sinh học Cơ chế hoạt động của thiết bị LC-MS/MS với nguồn ESI như sau:

- HPLC: Phân tách (một phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có trong sắc ký, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với các hoạt

- Trong nguồn ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự

hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt

sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện

- Phổ khối tứ cực kiểu chập ba: Gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3 có cấu

tạo như hình 1.3

Hình 1.3: Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập 3

Tại Q1 sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m/z xác định và được đưa đi lên thẳng đến Q2,

những ion khác sẽ bị loại bỏ đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2 Trong buồng Q2, ion mẹ

chuyển động Brown, va chạm với các phân tử khí trơ có mặt trong buồng (khí argon) Nhờ

va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân tiếp thành các ion nhỏ hơn (ion con) tùy theo mức độ bền vững của các liên kết trong ion ban đầu Các ion con mới hình thành được phân tích khối tách riêng tại Q3 với cơ chế phân tích khối lượng như tại Q1 và cuối cùng được đưa đến detector để định lượng Các hợp chất với

cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như có chế phân mảnh và hình thành

nên các ion con có số khối khác nhau Vì vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất

1.3 Phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học

Trong các nghiên cứu về dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học, phương pháp định lượng hoạt chất/ chất chuyển hóa trong dịch sinh học đóng một vai trò quan trọng, quyết định đến khả năng thành công của các nghiên cứu này Tuy nhiên, có nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp như khoảng nồng độ biến thiên rộng, nồng độ hoạt chất thấp có thể đến cỡ ng/mL, nền mẫu phức tạp (thường chứa muối, lipid, protein…) Chính vì vậy, khi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học cần chú trọng ba vấn đề cơ bản đó là kỹ thuật xử lý mẫu, kỹ thuật phân tích định lượng và cách tiến hành thẩm định phương pháp phân tích nhằm đảm bảo độ tin cậy của phương pháp

1.3.1 Kỹ thuật xử lý mẫu

Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…) thường chứa một tỷ lệ lớn các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất Vì vậy, mẫu phải được loại tạp trước khi tiến hành phân tích Hiện nay, để xử lý mẫu huyết tương người ta hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản sau: tủa protein, chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn [3], [4], [5], [13], [16]

1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein

Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân tạo tủa để loại đi phần lớn lượng protein có trong nền mẫu Đây là kỹ thuật đơn giản, dễ tiến hành nhất trong số các kỹ thuật trên Tác nhân tạo tủa thường dùng là acid (acid tricloroacetic, acid percloric) và dung môi hữu cơ (methanol, acetonitril) Với 2 - 3 mL dung môi hữu cơ hoặc 200 - 500 µL acid có thể kết tủa được trên 99% lượng protein có trong 1 mL mẫu huyết tương Tuy nhiên, nhược điểm của kỹ thuật này là nền mẫu thu được thường không sạch, mẫu bị pha loãng, hoặc hoạt chất có thể bị biến đổi khi thêm acid vào trong mẫu Ngoài ra do mẫu không sạch nên cột hay bị tắc và tuổi thọ của cột bị giảm

1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Nguyên tắc của kỹ thuật chiết lỏng - lỏng trong xử lý mẫu huyết tương là chuyển chất phân tích từ nền mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu cơ không đồng tan với

nước Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là diethylether, tertbutylether, cloroform, dicloromethan,… Các dung môi này có thể dùng đơn thành phần hoặc dùng phối hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng hoạt chất phân tích

So với kỹ thuật tủa protein thì kỹ thuật chiết lỏng - lỏng phức tạp hơn và trong một số trường hợp cho tỷ lệ thu hồi thấp hơn Ưu điểm của kỹ thuật này là mẫu thu được thu được tương đối sạch và có thể làm giàu mẫu

Trên thực tế, người ta có thể phối hợp giữa kỹ thuật tủa protein và kỹ thuật chiết lỏng

- lỏng để tăng hiệu quả của quá trình chiết tách mẫu (tăng độ sạch của nền mẫu và tỷ lệ thu hồi của hoạt chất)

1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn

Là kỹ thuật được phát triển dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật tách sắc ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ dung môi thích hợp)

Ưu điểm của kỹ thuật này là mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi cao và có độ lặp lại tốt hơn hai phương pháp trên Nhưng do chi phí thí nghiệm còn tương đối cao nên giai đoạn này kỹ thuật chiết pha rắn vẫn chưa được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói riêng Mục đích của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp đủ độ nhạy, tin cậy và lặp lại tốt Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng theo hướng dẫn US-FDA [20] và EMA [9] bao gồm các chỉ tiêu sau:

1.3.2.1 Độ chọn lọc

Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích (AN) và chuẩn nội (IS) khi:

- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của AN và IS phải được nhận diện rõ ràng và không

bị ảnh hưởng bởi các pic khác

- Trên SKĐ các mẫu trắng (ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau), tín hiệu đo tại thời điểm trùng với thời gian lưu của pic AN phải không vượt quá 20% tín hiệu đo của mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong đường chuẩn và tín hiệu đo của mẫu trắng tại vị trí trùng với thời gian lưu của pic IS phải nhỏ hơn 5% so với đáp ứng trung bình của IS trong các mẫu đường và mẫu kiểm tra (QC)

1.3.2.2 Giới hạn định lượng dưới

Mẫu chuẩn có nồng độ AN thấp nhất của đường chuẩn được coi là mẫu giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp khi:

- Pic AN được nhận diện rõ ràng, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác và

có tín hiệu đo ít nhất bằng 5 lần tín hiệu đo của mẫu trắng có thêm IS (zero)

- Độ đúng (so với nồng độ thực) phải đạt từ 80 - 120%, với giá trị CV ≤ 20%

1.3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng độ của chất phân tích có trong mẫu Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ có sự tương quan tuyến tính

giữa nồng độ AN có trong mẫu với tỷ lệ tín hiệu đo của AN và IS

Đường chuẩn phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính,

có hệ số tương quan r > 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:

- Độ đúng nằm trong khoảng 85 - 115%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ) cho phép độ đúng nằm trong khoảng 80 - 120%;

- Ít nhất 75% số điểm thuộc đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả mẫu

có nồng độ thấp nhất (LLOQ) và nồng độ cao nhất (ULOQ)

1.3.2.4 Ảnh hưởng của nền mẫu

Phương pháp LC-MS/MS không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị CV của tỷ số

MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau phải ≤ 15% Giá trị MFAN,

MFIS của AN và IS được xác định bằng cách so sánh diện tích pic AN và IS giữa các mẫu pha trong nền mẫu với các mẫu pha trong pha động

1.3.2.5 Độ chính xác (độ đúng, độ chụm) trong ngày và khác ngày

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ AN định lượng được với nồng

độ thực Độ chụm phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt của nồng độ AN định lượng được giữa các lần phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ

Độ đúng và độ chụm được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu

Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85 - 115%; độ chụm trong ngày (độ lặp lại) và giữa các ngày (độ tái lặp) với giá trị CV ≤ 15% Riêng nồng độ LLOQ cho phép độ đúng trong khoảng 80 - 120% và các giá trị CV ≤ 20%

1.3.2.6 Độ thu hồi hoạt chất và chuẩn nội

Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của AN và IS sau quá trình chiết tách, xử lý mẫu bằng các kỹ thuật như tủa protein, chiết lỏng – lỏng hoặc chiết SPE Xác định độ thu hồi AN và IS bằng cách so sánh nồng độ (hoặc hàm lượng, tín hiệu đo) của AN hoặc IS trong các mẫu QC có qua quá trình chiết tách, xử lý với nồng độ (hoặc hàm lượng, tín hiệu đo) tương ứng của các mẫu chuẩn không qua xử lý, chiết tách (mẫu pha trong dung môi)

1.3.2.7 Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học

Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH…quá trình phân tích thường kéo dài vì số lượng mẫu lớn Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các mẫu này sau các quá trình phân tích và bảo quản mẫu

Các nghiên cứu độ ổn định bao gồm: Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông – rã đông; độ

ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng; độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản; độ

ổn định của mẫu sau xử lý và độ ổn định ở điều kiện dài ngày

Các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu (trừ độ ổn định của dung dịch) nếu độ đúng của mẫu ổn định nằm trong khoảng 85% - 115% so với nồng độ lý thuyết ban đầu

1.3.2.8 Độ nhiễm chéo

Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình phân tích khi tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu trắng không lớn hơn 20% so với

đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của mẫu trắng không được lớn hơn 5% đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ

1.4 Tổng quan về sinh khả dụng và tương đương sinh học

1.4.1 Khái niệm chung

- Sinh khả dụng: Trong đánh giá tương đương sinh học invivo thuốc generic thì khái niệm

sinh khả dụng được định nghĩa là tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ chế phẩm thuốc vào hệ tuần hoàn chung Các đại lượng được sử dụng để biểu thị tốc độ và mức độ hấp thu dược chất vào hệ tuần hoàn chinh được ứng dụng trong nghiên cứu TĐSH bao gồm: Cmax

(nồng độ đỉnh) và AUC (diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian) [2]

- Tương đương sinh học: Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu sinh khả

dụng của chúng khác nhau không đáng kể khi dùng cùng mức liều trong cùng điều kiện thử nghiệm [2]

Trên thực tế, nhiều chế phẩm thuốc có cùng hoạt chất, cùng dạng bào chế nhưng tốc

độ và mức độ hấp thu vào tuần hoàn lại khác nhau nên tác dụng điều trị không hoàn toàn giống nhau Chất lượng nguyên liệu, thành phần tá dược và kỹ thuật bào chế là những yếu

tố có ảnh hưởng nhiều đến sự hấp thu thuốc Trong quá trình phát triển sản phẩm, đánh giá TĐSH là một trong những phương pháp thường được sử dụng để lựa chọn công thức và kỹ thuật bào chế Kết quả đánh giá TĐSH là bằng chứng về hiệu quả điều trị của thuốc và làm

cơ sở cho việc lựa chọn và thay thế thuốc trong lâm sàng Dựa vào kết quả đánh giá TĐSH, nhà sản xuất có thể tự khẳng định chất lượng cho sản phẩm của mình, nhà quản lý có cơ sở

để xem xét, thẩm định khi cấp phép lưu hành và thầy thuốc có thêm các thông tin về dược động học để lựa chọn, thay thế thuốc trong điều trị

1.4.2 Quy trình thực hiện đánh giá tương đương sinh học

1.4.2.1 Đối tượng tham gia nghiên cứu

Trong nghiên cứu tương đương sinh học, đa số trường hợp chọn đối tượng tham gia nghiên cứu nam giới khỏe mạnh Một số trường hợp cần thiết chỉ sử dụng đối với phụ nữ, khi đó cần giải thích rõ Với thuốc dùng cho trẻ em vẫn nên chọn người lớn để thử nghiệm

tra lâm sàng, xem xét tiền sử bệnh và các xét nghiệm cơ bản NTN phải có khả năng hiểu các thông tin về nghiên cứu và tự viết bản tình nguyện tham gia nghiên cứu NTN tự nguyện tham gia nghiên cứu và ký vào Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu theo mẫu được Hội đồng đạo đức thông qua Số lượng NTN phải chọn đủ để đảm bảo kết quả phân tích thống kê Dùng tối thiểu 12 người cho một nghiên cứu Số lượng NTN có thể nhiều hơn nếu dược chất thuộc loại có tốc độ và mức độ hấp thu biến thiên giữa các cá thể là khác nhau nhiều [2], [6]

1.4.2.2 Thuốc thử và thuốc đối chứng

- Thuốc thử: Thuốc thử dùng trong nghiên cứu TĐSH phải được sản xuất theo tiêu

chuẩn GMP và các quy định liên quan của cơ quan quản lý với cỡ lô phù hợp

- Thuốc đối chứng: Là thuốc phát minh cùng loại, nếu thuốc phát minh không có sẵn

trên thị trường tại thời điểm nghiên cứu có thể dùng một thuốc tương đương đã được cấp phép thay thế

- Kết quả hàm lượng dược chất so với hàm lượng ghi trên nhãn của mẫu thuốc thử

khác không quá 5% so với lô thuốc đối chứng trong nghiên cứu TĐSH [2], [6]

1.4.2.3 Thiết kế nghiên cứu

 Lựa chọn mô hình nghiên cứu

Nghiên cứu trong TĐSH thường được bố trí theo 2 mô hình: mô hình chéo và mô hình song song Trong mỗi mô hình có thể tiến hành nghiên cứu theo thử nghiệm đơn liều hoặc

đa liều

• Mô hình nghiên cứu chéo:

- Chéo 2 thuốc, 2 giai đoạn: áp dụng khi cần so sánh 1 thuốc thử với một thuốc chứng NTN được chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm, 2 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1: Nhóm 1 sử dụng thuốc thử, nhóm 2 sử dụng thuốc chứng

+ Giai đoạn 2: Nhóm 2 sử dụng thuốc thử, nhóm 1 sử dụng thuốc chứng

- Chéo 3 thuốc, 3 giai đoạn: Áp dụng khi so sánh 2 thuốc thử với 1 thuốc chứng NTN được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm, 3 giai đoạn

Ưu điểm:

- Mỗi nhóm NTN đều uống thuốc thử và thuốc chứng nên hạn chế ảnh hưởng của yếu tố cá thể

- Số NTN tham gia nghiên cứu ít nên tiết kiệm được kinh phí, nhân lực

Nhược điểm: Thời gian nghiên cứu kéo dài, NTN có thể bỏ giữa chừng nên ảnh hưởng

đến kết quả nghiên cứu

• Mô hình nghiên cứu song song:

NTN được chia thành 2 nhóm:

+ Nhóm 1: Sử dụng thuốc thử

+ Nhóm 2: Sử dụng thuốc chứng

Ưu điểm: Thời gian nghiên cứu ngắn nên mô hình thích hợp khi thuốc có thời gian

bán thải kéo dài

Nhược điểm: Do mỗi nhóm chỉ sử dụng một thuốc nên khó đánh giá ảnh hưởng của

cá thể NTN, của quá trình dùng thuốc Vì vậy số NTN phải nhiều để loại bớt ảnh hưởng của cá thể

• Nghiên cứu đơn liều: Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá các thông số dược động học

sau khi dùng một liều duy nhất

• Nghiên cứu đa liều: Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá các thông số dược động học

của thuốc ở trạng thái ổn định - sau khi dùng thuốc từ 5 đến 7 liều

 Thời gian đào thải

Thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn dùng thuốc phải đủ đề liều đã dùng ở giai đoạn trước được đào thải hết trước khi dùng liều sau Thời gian này được tính bằng 5 - 7 lần thời gian bán thải của thuốc

 Liều thử

Mức liều thử phải giống với liều dùng trong lâm sàng và nên sử dụng mức liều thấp nhất có thể được mà vẫn xác định được chính xác các thông số DĐH trên đối tượng tham gia nghiên cứu khi sử dụng mức liều đó Trong nghiên cứu TĐSH tốt nhất là liều thử của thuốc thử phải giống với liều của thuốc chứng Trong trường hợp phải sử dụng liều khác

nhau, cần nêu rõ lý do và phải hiệu chỉnh các giá trị DĐH thu được một cách phù hợp theo

tỷ lệ mức liều dùng

 Thời điểm lấy mẫu và uống thuốc

Thời điểm và khoảng thời gian lấy mẫu phải được lựa chọn phù hợp để thu được đường cong DĐH sao cho thể hiện đầy đủ quá trình hấp thu, phân bố, thải trừ của thuốc NTN được phân ngẫu nhiên vào nhóm uống thuốc đối chứng hoặc thuốc thử Uống thuốc với 240 ml, nước ấm Nếu cần uống nước thêm phải đợi 1h sau khi uống thuốc Trong khoảng thời gia thích hợp trước và trong khi thử nghiệm không được uống các thuốc khác,

và không được dùng thức ăn và đồ uống có tác động lên chức năng tuần hoàn, tiêu hóa, gan

và thận Trong quá trình thử nghiệm, nếu các biến cố bất lợi, các tác dụng phụ xảy ra cần phải được xử trí và điều trị kịp thời Trường hợp xảy ra biến cố bất lợi nghiêm trọng, cần phải ngừng ngay nghiên cứu và báo cáo các bên liên quan theo đúng quy định [2], [6]

1.4.2.4 Phân tích mẫu sinh học

Do quá trính phân tích mẫu sinh học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như lượng mẫu ít, nồng độ thấp, lẫn nhiều tạp chất là các chất nội sinh (lipid, protein, chất nội sinh, chất chuyển hóa…) và sự khác nhau giữa các cá thể nên phương pháp phân tích phải được thiết lập và thẩm định để đảm bảo độ tin cậy Nội dung và các phương pháp thẩm định được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích gồm các chỉ tiêu như: độ đặc hiệu - chọn lọc, giới hạn định lượng dưới, đường chuẩn - khoảng tuyến tính, ảnh hưởng của nền mẫu, độ chính xác (độ đúng, độ chụm) trong ngày và khác ngày, ảnh hưởng của nền mẫu, tỷ lệ thu hồi của hoạt chất và chuẩn nội, độ ổn định của mẫu huyết tương ở các điều kiện bảo quản khác nhau [2], [6]

1.4.2.5 Phân tích thống kê và đánh giá TĐSH

 Phân tích thống kê

Phương pháp thống kê để xác định SKD tương đối là khoảng tin cậy 90% tỷ lệ các giá trị trung bình giữa các chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu với các thông số cần quan tâm

Thông số DĐH được tính toán từ nông độ như AUC, Cmax, được phân tích chuyển dạng logarit cơ số 10 hoặc cơ số e Riêng với Tmax không chuyển dạng logarit, được xử lý theo phương pháp thống kê phi tham số

Phân tích phương sai xác định ảnh hưởng của các yếu tố như trình tự/ phác đồ sử dụng thuốc, cá thể, thuốc, giai đoạn thử thuốc… tới kết quả tương đương sinh học bằng phương pháp phân tích thống kê phù hợp tương ứng với mô hình nghiên cứu đã được sử dụng

Từ kết quả phân tích phương sai, xác định khoảng tin cậy 90% cho tỷ lệ lnCmax và khoảng tin cậy 90% cho tỷ lệ lnAUC giữa thuốc thử với thuốc đối chứng tương ứng của mỗi người tình nguyện theo phương pháp thống kê phù hợp (two one-sided test với độ tin

cậy α = 0,1) So sánh giá trị Tmax của thuốc thử và thuốc đối chứng (số liệu chuyển sang

thang logarit) bằng một trong các phương pháp thống kê phi tham số

 Khoảng chấp nhận đối với các thông số dược động học

Với AUC và Cmax: Khoảng tin cậy 90% cho giá trị SKD tương đối phải trong khoảng 80,0 – 125,0 %

+ Đối với các chế phẩm có khoảng điều trị hẹp, khoảng chấp nhận phải nhỏ hơn + Một số trường hợp, chấp nhận khoảng tin cậy lớn hơn (70% - 145%) nhưng cần xem xét các dữ liệu lâm sàng [2], [6]

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

- Chất chuẩn và chuẩn nội (IS):

+ Lisinopril - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, SKS: WS0118343.01, hàm lượng 90,46% (nguyên trạng), độ ẩm 8,6%

+ Gabapentin - Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh, SKS:

- Dụng cụ thiết bị dùng trong phân tích:

+ Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba TSQ Vantage với nguồn ESI (Thermo Scientific – Mỹ), lắp đặt tại Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc TW

+ Cân phân tích (Metller Toledo – Thụy Sỹ, độ chính xác d = 0,01 mg)

+ Tủ lạnh sâu -35oC ± 5oC (Panasonic – Nhật Bản)

+ Máy ly tâm (Sigma 2-16K – Đức)

+ Micropipet 10-100µL, 100-1000µL, 500-5000µL

+ Dụng cụ: Bình định mức, pipet thuỷ tinh class A, Prolabo - Pháp

- Dụng cụ thiết bị dùng trong lâm sàng (xét nghiệm, lấy máu NTN):

+ Các xét nghiệm lâm sàng ( sinh hóa, huyết học, nước tiểu, miễn dịch) tiến hành tại khoa xét nghiệm tại bệnh viện Medlatec tiến hành

+ Các dụng cụ lấy mẫu: Kim luồn, bơm và kim tiêm vô khuẩn dùng 1 lần

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Mẫu huyết tương

- Mẫu trắng: Huyết tương trắng - Viện Huyết học và Truyền máu TW

- Mẫu chuẩn hay mẫu thử tự tạo: Hòa tan LISI chuẩn trong huyết tương trắng với các nồng độ thích hợp

- Mẫu thử: Huyết tương của NTN sau khi uống LISI chứng hoặc thử

HĐĐĐ thông qua

Các mẫu huyết tương của NTN sau khi uống thuốc thử hoặc thuốc đối chứng được

sử dụng để xác định nồng độ LISI trong mẫu

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lương LISI trong huyết tương NTN bằng LC- MS/MS: + Quy trình chiết tách LISI: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp

+ Lựa chọn điều kiện khối phổ, điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách LISI khỏi các thành phần tạp trong huyết tương cho phép xác định được lượng LISI trong mẫu có độ chính xác thích hợp

+ Thẩm định phương pháp với các chỉ tiêu: tính đặc hiệu – chọn lọc, độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày, khoảng tuyến tính, giới hạn định lương dưới, tỷ lệ thu hồi hoạt chất, độ ổn định, độ nhiễm chéo

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng xác định nồng độ LISI trong máu NTN sau khi uống chế phẩm viên nén LISI 10mg thử hoặc đối chứng Kết quả định lượng được sử dụng

để đánh giá TĐSH viên nén Lizetric 10mg sản xuất tại Việt Nam, theo quy định của ASEAN [6]

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích trên hệ thống LC-MS/MS

2.4.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ xác định lisinopril

Sử dụng hệ thống LC – MS loại Triple Quadrupole với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ LISI: Bơm trực tiếp vào máy khối phổ dung dịch LISI 1µg/mL pha trong hỗn hợp MeOH : H2O (50:50, v/v) để xác định:

+ Ion mẹ cho LISI

+ Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa và bộ phận thấu kính hội tụ để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất

+ Mảnh ion con của LISI có cường độ tín hiệu cao và ổn định

- Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên để lượng ion

2.4.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn chứa LISI và dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa đồng thời LISI

và IS trong pha động Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên cột Necleodur; 50 x 2,1 mm; 1,8µm với các hệ pha động gồm MeOH kết hợp với amoniformat pH 4; TFA 0,1% và acid formic với các tỷ lệ khác nhau

2.4.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu trong huyết tương

Tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu trên mẫu huyết tương trắng và các mẫu tự tạo có chứa LISI bằng các kỹ thuật như:

+ Tủa protein với tác nhân gây tủa có thể là: MeOH và MeCN, HClO4

+ Chiết lỏng - lỏng sử dụng các dung môi cloroform, terbutylether, hỗn hợp diethylether-cloroform (70 : 30)

2.4.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội:

Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa học của các chất để tiến hành lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn Dự kiến chuẩn nội lựa chọn gồm có: piracetam; metformin; gabapentin, meloxicam Tiến hành tối ưu hóa điều kiện phối phổ của chuẩn nội tương tự như với chất chuẩn LISI để thu được cường độ tín hiệu cao và

ổn định

2.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp định lượng LISI trong huyết tương người bằng kỹ thuật

LC – MS/MS theo quy định của US-FDA [20] và EMA [9] về thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm: độ đặc hiệu – chọn lọc, giới hạn định lượng dưới; đường chuẩn và khoảng tuyến tính; ảnh hưởng của nền mẫu; độ chính xác trong ngày – khác ngày; tỷ lệ thu hồi của hoạt chất; độ ổn định của mẫu huyết tương

Tiến hành thẩm định trên các mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa chuẩn LISI

có nồng độ phù hợp Các mẫu HT tự tạo chứa LISI được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong dung môi:

+ Dung dịch chuẩn gốc để pha đường chuẩn (CCA): Cân chính xác khoảng 28 mg

chất chuẩn LISI hòa tan trong MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ LISI khoảng 500 µg/mL

+ Dung dịch chuẩn làm việc trong nước (CCB): Từ dung dịch chuẩn gốc CCA, chuẩn

bị dung dịch chuẩn làm việc trong nước (CCB) có nồng độ LISI khoảng 4 µg/mL

+ Dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu kiểm tra (QCA): Cân chính xác khoảng 28 mg

chất chuẩn LISI hòa tan trong MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ LISI khoảng 500 µg/mL

+ Dung dịch chuẩn làm việc trong nước (QCB): Từ dung dịch chuẩn gốc QCA, chuẩn

bị dung dịch chuẩn làm việc trong nước (QCB) có nồng độ LISI khoảng 4 µg/mL

+ Dung dịch chuẩn nội gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn Gabapentin hòa

tan trong nước thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ Gabapentin khoảng 250 µg/mL

+ Dung dịch chuẩn nội làm việc: Từ dung dịch chuẩn nội gốc, tiến hành pha loãng

trong H2O để thu được dung dịch chuẩn nội làm việc có nồng độ Gabapentin khoảng 800 ng/mL

- Chuẩn bị đường chuẩn và mẫu LLOQ trong huyết tương

+ Từ dung dịch CCB, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương

WSS-CC1 và WSS-CC2 có nồng độ Lisinopril tương ứng khoảng 200 ng/mL và 10 ng/mL + Mỗi đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết tương trắng có pha IS (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn LISI và IS

+ Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn (CC) và mẫu giới hạn định lượng dưới (LLOQ) trong huyết tương được trình bày ở bảng 2.1 và 2.2

Bảng 2.1: Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương

Mẫu Blank Zero S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương

- Chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương

+ Từ dung dịch QCB, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (WSS-QC1

và WSS-QC2) tương tự như dung dịch WSS-CC1 và WSS-CC2

+ Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra (QC) trong huyết tương được trình

bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3: Cách chuẩn bị mẫu QC trong huyết tương

đường chuẩn và các mẫu QC Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn tại thời gian lưu của lisinopril và tỷ lệ đáp ứng pic mẫu trắng/CC và QC

tại thời gian lưu của chất chuẩn nội

2.4.2.2 Giới hạn định lượng dưới

Tiến hành phân tích 6 mẫu huyết tương trắng và 6 mẫu chuẩn trong huyết tương có chứa lisinopril ở nồng độ thấp nhất trong đường chuẩn, thực hiện trong 3 ngày Ghi lại sắc

ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu chuẩn/ mẫu zero tại thời gian lưu của lisinopril Xác định nồng độ lisinopril có trong mẫu dựa vào tỷ lệ đáp ứng pic của chuẩn/IS và đường chuẩn xây dựng cùng Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được với nồng độ thực

2.4.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành phân tích 8 mẫu chuẩn lisinopril trong huyết tương có nồng độ từ LLOQ đến ULOQ Trong đó các mẫu LLOQ có nồng độ bằng khoảng 1/30 - 1/20 giá trị Cmax và mẫu ULOQ có nồng độ khoảng 2 - 3 lần giá trị Cmax Ghi lại sắc ký đồ và tính tỷ lệ đáp ứng pic chuẩn/IS tại các nồng độ tương ứng Xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic chuẩn/IS và nồng độ chuẩn có trong mẫu sử dụng hệ số tỷ trọng (weighting factor) phù hợp Xác định độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được với nồng độ thực

2.4.2.4 Ảnh hưởng của nền mẫu

Chuẩn bị ít nhất 6 lô huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau, tiến hành xử lý theo qui trình thu được các dung dịch nền mẫu Chuẩn bị các mẫu chuẩn kiểm tra LQC và HQC trong các dung dịch nền mẫu tương ứng Trong đó mẫu LQC có nồng độ bằng 3 lần nồng

độ LLOQ và mẫu HQC có nồng độ bằng 60 - 80% nồng độ mẫu ULOQ Song song chuẩn

bị các mẫu chuẩn ở nồng độ LQC và HQC trong pha động Đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu qua tỷ số MFchuẩn/MFIS trong đó MFchuẩn, MFIS được xác định bằng cách so sánh diện tích pic của chuẩn và IS của các mẫu pha trong nền mẫu so với diện tích pic của các mẫu pha trong pha động

2.4.2.5 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau: LLOQ, LQC (có nồng độ bằng khoảng 3 lần LLOQ), MQC (có nồng độ bằng khoảng 50% nồng độ cao nhất của đường chuẩn), HQC Mỗi lô mẫu gồm ít nhất 5 mẫu độc lập Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic Tính nồng độ chuẩn có trong các mẫu dựa trên tỷ lệ đáp ứng pic của chuẩn/IS

và đường chuẩn được phân tích cùng Độ đúng được xác định bằng cách so sánh nồng độ định lượng được so với nồng độ thực Độ chụm được xác định bằng cách tính CV (%) giữa nồng độ định lượng được của các mẫu trong cùng một lô mẫu

Độ đúng và độ chụm trong ngày được xác định khi tiến hành phân tích các lô mẫu trong một ngày Độ đúng và độ chụm khác ngày được xác định bằng cách tiến hành lặp lại cách xác định độ đúng và độ chụm trong ngày trong ít nhất 5 ngày phân tích khác nhau

2.4.2.6 Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất

Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất được xác định trên 3 mức nồng độ (thấp, trung bình và cao) với ít nhất 5 mẫu độc lập ở mỗi nồng độ trong huyết tương và trong dung môi Xác định tỷ lệ thu hồi của hoạt chất bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu huyết tương qua chiết tách với các mẫu pha trong dung môi không qua chiết tách tại thời gian lưu của hoạt chất

2.4.2.7 Độ ổn định của mẫu huyết tương

Đánh giá độ ổn định của mẫu huyết tương ở các điều kiện phân tích và bảo quản khác nhau: như độ ổn định ở nhiệt độ phòng, trong thời gian ngắn; độ ổn định ở nhiệt độ bảo quản, trong khoảng thời gian từ ngày đầu tiên lấy mẫu đến ngày phân tích cuối cùng;

độ ổn định sau các chu kỳ đông và rã đông; độ ổn định của mẫu sau xử lý tính từ khi để trong autosampler đến khi được phân tích

2.4.2.8 Độ nhiễm chéo

Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ LLOQ và 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ cao nhất của đường chuẩn Phân tích sắc ký các mẫu LLOQ, sau đó tiêm xen kẽ từng mẫu huyết tương trắng sau đó mẫu ULOQ

2.5 Xác định nồng độ thuốc trong huyết tương của người tình nguyện

2.5.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, đơn liều, 2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn Uống thuốc sau khi nhịn ăn ít nhất 10 giờ Thời gian nghỉ giữa hai giai đoạn là 07 ngày Nghiên cứu thực hiện trên 24 NTN NTN sử dụng thuốc khi đói (thiết kế nghiên cứu chi tiết được hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương phê duyệt trước khi tiến hành nghiên cứu) Lấy máu tại các thời điểm trước và sau khi dùng thuốc (thử, chứng) để phân tích xác định nồng lisinopril trong huyết tương

2.5.2 Cho uống thuốc, lấy mẫu máu

- Liều dùng: Liều đơn, 1 viên x 10 mg thuốc Thử hoặc thuốc Chứng cho mỗi giai đoạn

- Cách dùng: Uống nguyên vẹn viên thuốc với 240 mL nước ấm Trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc, NTN không được nằm

- Lấy mẫu máu: Dùng kim luồn tĩnh mạch vô khuẩn lấy máu tĩnh mạch cẳng tay NTN Lấy

máu tại các thời điểm: thời điểm 0 (trong vòng 1,5 giờ trước khi uống thuốc) và các thời điểm sau khi dùng thuốc 1,5; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12; 16; 24; 36; 48; 72 giờ Mỗi lần lấy khoảng 5mL máu Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống có ghi nhãn chứa chất chống đông EDTA Lắc ống bằng cách lật ngược ống 3 - 4 lần ngay sau khi cho máu vào Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút Tách lớp huyết tương cho vào các ống polyethylen

có dán nhãn, bảo quản ngay ở – 35oC  5oC cho đến khi phân tích Nhãn trên ống đựng máu

và ống đựng huyết tương ghi các thông tin: mã số NTN, số nghiên cứu, giai đoạn, thời điểm lấy mẫu

2.5.3 Định lượng lisinopril trong huyết tương

Định lượng LISI trong các mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc bằng phương pháp phân tích đã thẩm định Phân tích mẫu được bắt đầu ngay sau khi lấy mẫu Quá trình phân tích tuân thủ theo hướng dẫn về phân tích mẫu trong dịch sinh học của ASEAN [6]

i i

AUC

2.5.4 Phân tích dược động học và đánh giá kết quả

Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu huyết tương, vẽ đường cong nồng độ thuốc – thời gian của từng cá thể Xác định các thông số DĐH của thuốc thử và thuốc chứng:

- Cmax và Tmax xác định trực tiếp từ các số liệu thực nghiệm

- AUC0 - t (hay AUClast): Xác định bằng phương pháp hình thang, tính từ thời điểm

0 đến thời điểm t (điểm cuối cùng có thể xác định được nồng độ thuốc trong huyết tương của từng cá thể) theo công thức (2)

Trong đó: C i là nồng độ thuốc tại thời điểm lấy mẫu t i

- AUC0 -  (hay AUC inf): Ngoại suy từ giá trị AUC0-t, ước tính đến vô cùng theo mô hình dược động học tuyến tính, không ngăn, theo công thức (3):

(3) AUC0-∞ = AUC0-t +

Cn

/kel/

kel: là hằng số tốc độ thải trừ

Đánh giá TĐSH viên nén Lizetric 10 mg thông qua so sánh các thông số Cmax , Tmax,

AUC0-∞ của thuốc thử với thuốc chứng (ZESTRIL) theo hướng dẫn của ASEAN (2015)

với thuốc Chứng, tính trên số liệu đã chuyển logarit; sử dụng phần mềm WinNonlin

- So sánh giá trị T max : Theo phương pháp phân tích phi tham số của Wilcoxon (Wilcoxon

signed–rank test), dựa trên việc xác định tổng giá trị xếp hạng dương và âm hoặc xác định

mức ý nghĩa p của phương pháp theo giá trị Z theo cách sau:

12/)1)(

2/1(

4/)1(

N

N N R Z

Trong đó: R là tổng xếp hạng (dương hoặc âm)

N là số cặp giá trị Tmax của thuốc Thử và thuốc Chứng có sai khác

Từ giá trị Z, tra bảng: Cumulative normal distribution để xác định giá trị Area, giá trị p = 1- Area

Hai chế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu khoảng tin cậy 90% của thuốc Thử so với thuốc Chứng, tính trên giá trị Cmax và AUC trung bình nằm trong giới hạn 80,00 – 125,00% và giá trị Tmax của thuốc Thử và thuốc Chứng khác nhau không có ý nghĩa thống

kê (Giá trị tổng xếp hạng dương và giá trị tổng xếp hạng âm (sum of possitive/negative

thuốc Chứng có sai khác) hoặc Giá trị p-value > 0,05)

2.5.5 Thông qua hội đồng đạo đức

Để đảm bảo vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Y- sinh học, toàn bộ nội dung đề tài bao gồm đề cương nghiên cứu và các biểu mẫu liên quan, sẽ được nhóm nghiên cứu và nhà tài trợ đệ trình lên HĐĐĐ theo đúng các quy định và hướng dẫn về GCP Nghiên cứu chỉ được tiến hành sau khi nhận được sự chấp thuận của HĐĐĐ