Xây dựng phương pháp LCMSMS phân tích lisinopril trong huyết tương người và ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THÙY DUNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THÙY DUNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS PHÂN TÍCH LISINOPRIL TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Nguyên Hà TS Tạ Mạnh Hùng HÀ NỘI 2019 LỜI CÁM ƠN Luận văn thực hướng dẫn TS Trần Nguyên Hà – Trường Đại học Dược Hà Nội TS Tạ Mạnh Hùng – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Để hoàn thành luận văn này: Trước hết, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn tận tình bảo, quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi cám ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo, Thầy Cơ Bộ mơn Hóa Phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo, Thầy Cô đồng nghiệp Khoa Dược – Đại học Y Dược Hải Phòng tạo điều kiện cho tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thị Dung, DS Phạm Thanh Huyền toàn thể cán Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương chia sẻ giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ động viện tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, tháng 04 năm 2019 Học viên: Vũ Thùy Dung MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Lisinopril 1.1.1 Tính chất 1.1.2 Tác dụng dược lý dược động học 1.1.3 Chỉ định chống định 1.1.4 Một số phương pháp định lượng lisinopril chế phẩm thuốc dịch sinh học 1.2 Sắc lý lỏng – khối phổ (LC-MS) 1.3 Phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 10 1.3.1 Kỹ thuật xử lý mẫu 10 1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học 11 1.4 Tổng quan sinh khả dụng tương đương sinh học 14 1.4.1 Khái niệm chung 14 1.4.2 Quy trình thực đánh giá tương đương sinh học 14 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 19 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 19 2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 19 2.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2.1 Mẫu huyết tương 20 2.2.2 Mẫu thuốc 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích hệ thống LC-MS/MS 21 2.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích 22 2.5 Xác định nồng độ thuốc huyết tương người tình nguyện 27 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu 27 2.5.2 Cho uống thuốc, lấy mẫu máu 27 2.5.3 Định lượng lisinopril huyết tương 27 2.5.4 Phân tích dược động học đánh giá kết 28 2.5.5 Thông qua hội đồng đạo đức 29 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 Kết xây dựng phương pháp phân tích 30 3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ phân tích lisinopril 30 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 32 3.1.3 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương 34 3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 36 3.2 Kết thẩm định phương pháp phân tích 38 3.2.1 Độ đặc hiệu- chọn lọc 38 3.2.2 Ảnh hưởng mẫu 40 3.2.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 41 3.2.4 Xác định giới hạn định lượng 42 3.2.5 Độ - độ xác ngày 44 3.2.6 Tỷ lệ thu hồi phương pháp 49 3.2.7 Khảo sát độ ổn định 50 3.3 Kết đánh giá TĐSH viên nén Lizectric 10 mg 57 3.3.1 Tuyển chọn NTN 57 3.3.2 Uống thuốc lấy máu 57 3.3.3 Định lượng lisinopril máu NTN sau uống thuốc thử chứng 58 3.3.4 Phân tích dược động học đánh giá tương đương sinh học 63 Chương 4: BÀN LUẬN 67 4.1 Phương pháp phân tích định lượng lisinopril huyết tương người 67 4.1.1 Phương pháp định lượng lisinopril 67 4.1.2 Kỹ thuật xử lý mẫu 67 4.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 68 4.2 Kết phân tích mẫu huyết tương NTN 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Giải thích Chữ viết tắt AN Chất phân tích (Analyte) ASEAN Liên hiệp quốc gia Đơng Nam Á AUC Diện tích đường cong Cmax Nồng độ đỉnh CV Hệ số biến thiên EMA Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu GABA Gabapentin GLP Thực hành tốt phòng thí nghiệm HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao HT Huyết tương IS Chuẩn nội LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần LISI Lisinopril LLOQ Giới hạn định lượng LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp m/z Khối lượng/điện tích MeCN Acetonitril MeOH Methanol MEL Meloxicam MET Metformin MF Hệ số mẫu MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình NTN Người tình nguyện PRT Piracetam QC Mẫu kiểm tra SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng SKĐ Sắc ký đồ SPE Chiết pha rắn STT Số thứ tự SQC Mẫu kiểm tra bổ sung TĐSH Tương đương sinh học Tmax Thời gian đạt nồng độ cực đại TFA Trifluoroacetic ULOQ Giới hạn định lượng US-FDA Hiệp hội thực dược phẩm Mỹ UV-VIS Tử ngoại - khả kiến VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương v/v Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của lisinopril Hình 1.2: Sơ đờ khới của máy khổi phổ Hình 1.3: Cấu tạo chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập Hình 3.1: Khới phở MS dung dịch chuẩn LISI… .30 Hình 3.2: Giản đờ tới ưu điện “thấu kính hội tụ” ion có sớ khới 406 Da 31 Hình 3.3: Phở khới MS/MS phân mảnh ion [LISI-H]+ 31 Hình 3.4: Giản đồ lượng phân mảnh [LISI-H]+ 32 Hình 3.5: SKĐ mẫu chuẩn chứa LISI sử dụng hệ pha động MeOH-amoniformat pH4 (70:30, v/v) 33 Hình 3.6: SKĐ mẫu chuẩn chứa LISI sử dụng hệ dung mơi pha động 33 Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn chứa LISI sử dụng hệ MeOH-acid forcmic 0,1% (50:50, v/v) 33 Hình 3.8: Sắc ký đờ mẫu huyết tương chuẩn chứa LISI chiết lỏng lỏng 34 Hình 3.9: Sắc ký đờ mẫu huyết tương chuẩn chứa LISI tủa protein 35 Hình 3.10: Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn IS 36 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (Blank) 39 Hình 3.12: Sắc ký đờ mẫu huyết tương trắng có pha IS chuẩn LISI nồng độ ng/mL 39 Hình 3.13: Đường cong trung bình nồng độ Lisinopril theo thời gian của 24 NTN 58 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tóm tắt các thơng số dược động học của LISI số nghiên cứu Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng lisinopril LC-MS/MS Bảng 2.1: Cách chuẩn bị đường chuẩn huyết tương 24 Bảng 2.2: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ huyết tương 24 Bảng 2.3: Cách chuẩn bị mẫu QC huyết tương 24 Bảng 3.1: Điều kiện khối phổ định lượng LISI IS… 38 Bảng 3.2: Kết đánh giá phù hợp của hệ thống 39 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của mẫu trắng thời điểm trùng Rt của LISI IS 40 Bảng 3.4: Kết đánh giá ảnh hưởng của mẫu 41 Bảng 3.5: Kết khảo sát đường chuẩn theo mơ hình weighting 1/x2 42 Bảng 3.6: Kết xác định giới hạn định lượng ngày 43 Bảng 3.7: Kết khảo sát độ đúng- độ xác ngày mẫu LLOQ (1,0 ng/mL) 45 Bảng 3.8: Kết khảo sát độ đúng- độ xác ngày mẫu LQC (3,0 ng/mL) 45 Bảng 3.9: Kết khảo sát độ đúng- độ xác ngày mẫu MQC (101,5 ng/mL) 46 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ đúng- độ xác ngày mẫu HQC (162,5 ng/mL) 46 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ đúng- độ xác ngày mẫu SQC (24,4 ng/mL) 47 Bảng 3.12: Kết khảo sát độ xác khác ngày (n=5) 47 Bảng 3.13: Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS 49 Bảng 3.14: Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi của Lisinopril 50 Bảng 3.15: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc chuẩn nội gớc thời gian ngắn nhiệt độ phòng 51 Bảng 3.16: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc chuẩn nội gốc thời gian dài nhiệt độ 20C – 80C 52 Bảng 3.17: Kết độ ổn định của mẫu HT nhiệt độ phòng 53 Bảng 3.18: Kết độ ổn định của mẫu huyết tương sau chu kỳ đông–rã 54 ... huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu không đồng tan với 10 nước Trong thực nghiệm, dung môi hay lựa chọn diethylether, tertbutylether, cloroform, dicloromethan,… Các dung mơi dùng đơn thành phần... 50 Bảng 3.15: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc chuẩn nội gớc thời gian ngắn nhiệt độ phòng 51 Bảng 3.16: Khảo sát độ ổn định dung dịch chuẩn gốc chuẩn nội gốc thời... thành hạt sương nhỏ mang điện tích bề mặt Khí nhiệt xung quanh cung cấp nhiệt làm bay dung môi khỏi giọt sương Dung mơi bay làm gia tăng mật độ điện tích bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích tăng