CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp bào chế và đánh giá đặc tính hệ tiểu phân nano polym e-
2.4.1.1. Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano polyme - lipid chứa paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
Thành phần công thức:
+ Hoạt chất: PTX, DHA-GLU
+ Chất mang: PLGA, LEC + Chất diện hoạt: tween 80
Phương pháp bào chế:
Hệ tiểu phân nano chứa PTX, DHA – GLU là phức hợp dược chất được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa bốc dung mơi, quy trình cụ thể như sau:
Chuẩn bị pha dầu: Hòa tan PTX, DHA-GLU, PLGA và LEC trong dicloromethan.
Chuẩn bị pha nước: Dung dịch chất diện hoạt ở nồng độ thích hợp.
Giai đoạn nhũ hóa: Nhỏ từ từ pha dầu vào pha nước. Đồng nhất hóa nhũ tương
bằng thiết bị siêu âm đầu dị. Duy trì nhiệt độ 0 – 5 oC trong suốt quá trình siêu âm.
Bốc hơi dung môi: Tiếp tục khuấy nhẹ nhàng nhũ tương dưới thiết bị khuấy từ
trong 3h ở nhiệt độ phịng để loại dung mơi hữu cơ.
Tinh chế và thu sản phẩm: Sử dụng cột lọc tiếp tuyến 50 kDalton. Hỗn dịch nano thu được sau bốc hơi dung môi được đưa qua cột lọc tiếp tuyến với màng lọc 50 kDalton bằng bơm nhu động. Dịch không qua màng là dịch đã được loại bớt nước và phân tử có kích thước bé hơn 50 kDal. Lặp lại chu kì lọc 10 lần, thu hỗn dịch sau tinh chế.
2.4.1.2. Phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano chứa paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
a. Đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân
21
Nguyên tắc: Khi chiếu một chùm tia laser vào hệ, ánh sáng tán xạ từ tiểu phân
được hứng lên một màn chắn. Phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ có thể đánh giá được chuyển động Brown và đánh giá kích thước hạt nhờ phương trình Stockes-Einstein.
Tiến hành: Pha lỗng hỗn dịch nano với một lượng nước cất đã lọc (0,22 µm),
sao cho chỉ số đếm (count rate) nằm trong khoảng 200 – 400 kcps. Tiến hành đo trên thiết bị Zetasize ở nhiệt độ 25 oC.
Đọc kết quả kích thước tiểu phân và hệ số phân bố kích thước tiểu phân 3 lần liên tiếp. Lấy kết quả trung bình.
b. Đánh giá thế zeta
Phương pháp: Tán xạ ánh sáng
Nguyên tắc: Khi đặt 1 điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện
cực trái dấu với vận tốc tỉ lệ với thế zeta. Tốc độ này được xác định dựa vào việc phân tích chuyển động của tiểu phân thơng qua ánh sáng tán xạ. Thế zeta được xác định dựa vào định luật Smoluchowski – Huckel.
Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch nano bằng nước cất đến nồng độ vừa đủ sau cho
chỉ số đếm nằm trong khoảng 200 – 400 kcps. Tiến hành đo thế zeta trên thiết bị Zetasize ở nhiệt độ 25 oC, sử dụng cuvet PE.
Đọc kết quả 3 lần liên tiếp, lấy giá trị trung bình.
c. Đánh giá hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất được nano hóa
Phương pháp: Hiệu suất nano hóa và tỷ lệ dược chất được nano hóa được xác
định gián tiếp thơng qua lượng dược chất phân tử tự do và lượng dược chất toàn phần có trong hệ.
Tiến hành:
Xác định lượng dược chất phân tử tự do: Hút chính xác một thể tích hỗn dịch
nano vào ống ly tâm có màng siêu lọc 10.000 Da, tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 rpm/phút, nhiệt độ 25 oC trong 30 phút. Xác định hàm lượng dược chất trong dịch phía dưới màng lọc bằng HPLC để tính ra lượng dược chất phân tử tự do có trong hệ.
22
Xác định lượng dược chất tồn phần: Hút chính xác một thể tích hỗn dịch nano
vào bình định mức. Thêm một lượng vừa đủ ACN, đậy kín, siêu âm trong khoảng 30 phút. Để bình nguội về nhiệt độ phịng, sau đó định mức vừa đủ bằng ACN, lắc đều. Xác định hàm lượng dược chất trong phần dịch để tính ra lượng dược chất tồn phần có trong hệ.
Tính tốn kết quả:
- Lượng dược chất phân tử tự do có trong hệ:
𝑚𝑡𝑑 = 𝐶𝑡𝑑× 𝑉𝑡𝑑
Trong đó:
mtd: là lượng dược chất phân tử tự do có trong hệ (µg)
Ctd: là nồng độ dược chất xác định được từ dịch ly tâm phía dưới màng lọc (µg/ml)
Vtd: là thể tích của hỗn dịch nano (ml) - Lượng dược chất tồn phần có trong hệ:
𝑚𝑡𝑝 = 𝐶𝑡𝑝 × 𝐷 × 𝑉𝑡𝑝
Trong đó:
mtp: là lượng dược chất tồn phần có trong hệ (µg)
Ctp: là nồng độ dược chất xác định được từ dịch chiết (µg/ml) D: hệ số pha lỗng
Vtp: là thể tích của hỗn dịch nano (ml)
- Cơng thức tính hiệu suất mang dược chất nano (EE):
𝐸𝐸(%) =𝑚𝑡𝑝 − 𝑚𝑡𝑑
𝑚𝑡𝑝 × 100 (%)
- Cơng thức tính tỷ lệ dược chất nano (LC)
𝐿𝐶(%) = 𝑚𝑡𝑝 − 𝑚𝑡𝑑
𝑘ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑖ể𝑢 𝑝ℎâ𝑛 𝑛𝑎𝑛𝑜× 100 (%)
Trong đó:
23
mtp: là lượng dược chất tồn phần có trong hệ (µg)
Khối lượng tiểu phân nano (µg) được xác định bằng tổng khối lượng dược chất và tá dược tham gia vào thành phần nano theo lý thuyết.
d. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ tiểu phân nano
Phương pháp: Khả năng giải phóng in vitro của PTX và DHA từ hệ tiểu phân
nano được đánh giá bằng cách sử dụng màng thẩm tích (14.000 Da). Hút chính xác 3 ml hỗn dịch nano vào túi thẩm tích, kẹp chặt hai đầu, đặt túi vào mơi trường giải phóng sao cho túi thẩm tích ngập trong mơi trường. Duy trì tốc độ lắc ở 100 vòng/phút, nhiệt độ 37 oC bằng thiết bị lắc điều nhiệt. Môi trường giải phóng là 30 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,4 được pha theo DĐVN V. Tiến hành lấy mẫu tại các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ và 84 giờ, mỗi thời điểm 1 ml, bổ sung thể tích sau mỗi lần lấy mẫu.
Cách tính kết quả:
Xác định nồng độ dược chất tại thời điểm ban đầu và các thời điểm t. Lượng dược chất đã giải phóng ra mơi trường tại thời điểm thứ t được tính theo cơng thức:
𝑚𝑡 = 𝐶𝑡× 𝑉𝑚𝑡+ 𝑉𝑡× ∑ 𝐶𝑖
𝑡−1
𝑖=1
Trong đó:
mt: Lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t (µg).
Ct: Nồng độ dược chất trong mơi trường thử tại thời điểm thứ t (µg/ml). Vmt: Thể tích mơi trường giải phóng (ml).
Vt: Thể tích lấy mẫu tại các thời điểm lấy mẫu (ml).
Ci: Nồng độ dược chất trong môi trường thử tại thời điểm thứ i (µg/ml). Phần trăm giải phóng tích lũy tại thời điểm t được xác định bằng công thức:
%𝐺𝑃 = 𝑚𝑡
𝑚𝑜 × 100
Trong đó:
24
mt: lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t (µg).
mo: lượng dược chất ban đầu được đưa vào màng thẩm tích (µg).
e. Phương pháp định lượng paclitaxel, dihydroartemisinin - glucosamin
Qua tham khảo tài liệu, tiến hành định lượng đồng thời DHA-GLU và PTX trong các mẫu đánh giá bằng phương pháp HPLC với điều kiện cụ thể như sau:
Cột sắc ký: C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm).
Pha động: ACN – nước, gradient: acetonitril thay đổi từ 15 % đến 53 %, nước
thay đổi từ 85 % đến 47 % trong 0 - 10 phút. Duy trì tỉ lệ acetonitril – nước (53:47) trong 15 phút tiếp theo.
Detector: detector UV, bước sóng phát hiện 210 nm. Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
Thể tích tiêm mẫu: 50 µl. Dung môi pha mẫu: ACN Tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn DHA-GLU: Cân chính xác khoảng 10,0 mg DHA-
GLU chuẩn, cho vào bình định mức 100 ml. Thêm 60 ml ACN, đậy kín, siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều. Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 100,0 µg/ml, pha lỗng bằng dung mơi pha mẫu thành các dung dịch có nồng độ thuộc khoảng 5 – 100,0 µg/ml. Lọc các dung dịch này qua màng lọc kích thước 0,45 µg/ml, thu được dung dịch chuẩn DHA-GLU.
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn PTX: Cân chính xác khoảng 10,0 mg PTX chuẩn,
cho vào bình định mức 100 ml. Thêm 60 ml ACN, đậy kín, siêu âm trong 15 phút. Bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều. Từ dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 100,0 µg/ml, pha lỗng bằng dung mơi pha mẫu thành các dung dịch có nồng độ thuộc khoảng 1 – 20 µg/ml. Lọc các dung dịch này qua màng lọc kích thước 0,45 µg/ml, thu được dung dịch chuẩn PTX.
- Chuẩn bị dung dịch thử từ hỗn dịch nano: Hút chính xác khoảng 2 ml hỗn dịch
25
khoảng 15 phút. Để nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung ACN đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch thử.
2.4.2. Phương pháp bào chế và đánh giá đặc tính bột đơng khơ chứa nano paclitaxel và dihydroartemisinin - glucosamin