Đoàn thị hải hạnh nghiên cứu xác định đồng thời gelsemin và koumin trong máu bằng sắc ký lỏng khối phổ luận văn thạc sĩ dƣợc học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ HẢI HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI GELSEMIN VÀ KOUMIN TRONG MÁU BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ HẢI HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI GELSEMIN VÀ KOUMIN TRONG MÁU BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.Phạm Quốc Chinh PGS.TS.Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI 2023 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Quốc Chinh PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Ngƣời thầy, cô hƣớng dẫn, giúp đỡ đồng hành suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Pháp y Quốc gia ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tham gia học tập hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Phịng Quản lý Đào tạo, Khoa Hóa phân tích Kiểm nghiệm Thuốc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập Trƣờng Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến anh chị em Khoa Độc chất – Viện Pháp y Quốc gia động viên, giúp đỡ chia sẻ với cơng việc nhƣ q trình thực đề tài Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên tơi q trình học tập thực luận văn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Sơ lƣợc ngón 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Các hợp chất alcaloid 1.1.3 Tác dụng độc tính 1.2 Tổng quan gelsemin 1.2.1 Công thức danh pháp gelsemin 1.2.2 Tính chất lý hóa gelsemin 1.2.3 Dược động học 1.3 Tổng quan koumin 1.3.1 Công thức danh pháp koumin 1.3.2 Tính chất lý hóa koumin 1.3.3 Dược động học 1.4 Các phƣơng pháp chiết gelsemin koumin máu 1.4.1 Phương pháp tủa protein 10 1.4.2 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 10 1.4.3 Phương pháp chiết pha rắn 11 1.5 Một số phƣơng pháp thƣờng dùng để phân tích alcaloid ngón 13 1.5.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ 13 1.5.2 Sắc ký lỏng khối phổ 14 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.2 Điều kiện nghiên cứu 18 2.2.1 Chất chuẩn 18 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 19 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Khảo sát tối ưu điều kiện phổ khối 21 2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng 21 2.3.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 22 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 24 2.3.5 Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế 28 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời gelsemin koumin máu LC-MS/MS 29 3.1.1 Khảo sát phổ khối 29 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 30 3.1.3 Khảo sát phương pháp chiết mẫu 35 3.1.4 Tổng hợp quy trình chiết xuất, phân tích gelsemin koumin LC-MS/MS 37 3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 39 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS 39 3.2.2 Độ đặc hiệu, chọn lọc 40 3.2.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 41 3.2.4 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn 42 3.2.5 Độ độ xác 44 3.2.6 Hiệu suất chiết 45 3.2.7 Ảnh hưởng mẫu 46 3.2.8 Độ ổn định 47 3.2.9 Độ nhiễm chéo 48 3.3 Áp dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc để phân tích gelsemin koumin máu số trƣờng hợp nghi ngộ độc alcaloid ngón 49 Chƣơng BÀN LUẬN 53 4.1 Về đối tƣợng nghiên cứu 53 4.1.1 Đối tượng phân tích 53 4.1.2 Các chất phân tích 53 4.2 Về quy trình xử lý mẫu 54 4.3 Về phƣơng pháp phân tích thẩm định 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 Kết luận 58 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC Phục lục Kết khảo sát phổ khối chất phân tích Phụ lục Kết khảo sát gradient pha động Phụ lục Kết khảo sát tốc độ dòng 14 Phụ lục Kết khảo sát dung môi chiết mẫu 18 Phụ lục Kết khảo sát độ chọn lọc, đặc hiệu 22 Phụ lục Quy trình phân tích Gelsemin Koumin máu 25 LC/MS/MS 25 Phụ lục Sắc ký đồ đƣờng chuẩn 26 Phụ lục Sắc ký đồ số mẫu thực tế 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích ACN Acetonitril EI Va chạm điện tử (Electron impact) (Et)2O Diethyl ete EtOAc Ethyl acetat HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liqid Chromatography) HQC Mẫu kiểm tra hàm lƣợng cao (High Quality Control) IS Chuẩn nội (Internal Standard) LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography -Mass spectrometry) LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal Dose) LLE Chiết lỏng lỏng (Liquid–liquid extraction) LLOQ Giới hạn định lƣợng dƣới (Lower limit of quantitation) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of quantification) LQC Mẫu kiểm tra hàm lƣợng thấp (Low Quality Control) MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm tra hàm lƣợng trung bình (Medium quality control) MS Khối phổ (Mass Spectrometry) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) SPE Chiết pha rắn (solid phase extraction) TIC Sắc ký toàn ion (Total Ion Chromatogram) ULOQ Giới hạn định lƣợng (Upper limit of quantitation) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ phân tích gelsemin, koumin papaverin 30 Bảng 3.2 Khảo sát hệ pha động 31 Bảng 3.3 Chƣơng trình gradient 10 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 35 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống 39 Bảng 3.6 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 41 Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính, đƣờng chuẩn gelsemin, koumin máu 43 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ độ xác phƣơng pháp 44 Bảng 3.9 Hiệu suất chiết gelsemin, koumin máu 45 Bảng 3.10 Kết đánh giá ảnh hƣởng mẫu 46 Bảng 3.11 Độ ổn định chất sau giờ, ngày, 21 ngày 47 chu kì rã – đông 47 Bảng 3.12 Kết phân tích mẫu máu thực 50 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây ngón Hình 1.2 Cấu trúc nhóm alcaloid có ngón Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo gelsemin [13] Hình 1.4 Công thức cấu tạo koumin[13] Hình 2.1 Thiết bị LC-MS/MS Viện Pháp y Quốc gia 20 Hình 3.1 Phổ khối scan lần phổ ion gelsemin, koumin papaverin 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ chất phân tích theo hệ pha động 32 Hình 3.3 Sắc ký đồ chất chuẩn gelsemin(a), koumin (b) 34 chuẩn nội papaverin (c) tốc độ dòng 0,4mL/phút 34 Hình 3.4.Kết khảo sát quy trình chiết 36 Hình 3.5 Sắc đồ mẫu máu thêm chuẩn chuẩn nội 38 phân tích LC-MS/MS 38 Hình 3.6 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn 40 chất phân tích 41 Hình 3.7 Sắc đồ xác định LOD thông qua xác định S/N mẫu máu 42 Hình 3.8 Đƣờng chuẩn phân tích gelsemin koumin máu 43 Hình 3.9 Sắc ký đồ đánh giá độ nhiễm chéo 49 Hình 3.10 Sắc ký đồ xác nhận có mặt gelsemin koumin mẫu MT9 51 Hình 3.11 Sắc ký đồ xác nhận có mặt gelsemin koumin mẫu MT8 51 PL-32 PL-33 PL-34 PL-35 PL-36 PL-37 PL-38 PL-39 PL-40 PL-41 PL-42 PL-43 Phụ lục Sắc ký đồ số mẫu thực tế Sắc đồ mẫu máu MT7 PL-44 Sắc đồ mẫu máu MT3 PL-45 Sắc đồ mẫu máu MT4 PL-46