HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN cứu bào CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG điều TRỊ UNG THƢ LUẬN án TIẾN sĩ dƣợc học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HỒ HOÀNG NHÂN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 62720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến GS TS Chul Soon Yong HÀ NỘI, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tác giả NCS Hồ Hồng Nhân LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập nghiên cứu thực luận án, nhận đƣợc nhiều hƣớng dẫn, giúp đỡ quý báu từ thầy, cô, nhà khoa học, anh chị em, bạn bè đồng nghiệp gia đình Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến, GS TS Chul Soon Yong, hai ngƣời thầy nhiệt tình hƣớng dẫn, hết lịng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Trƣờng Đại học Y Dƣợc – Đại học Huế tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu thời gian vừa qua Lời cảm ơn tiếp theo, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể thầy cơ, cán nhân viên, anh chị học viên, bạn sinh viên Viện Công nghệ dƣợc phẩm Quốc gia, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp dƣợc, Bộ môn Vật lý – Hóa lý, Phịng Sau đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, thầy cô, đồng nghiệp Khoa Dƣợc, Bộ môn Bào chế - Công nghiệp dƣợc thuộc Trƣờng Đại học Y Dƣợc – Đại học Huế tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin cám ơn thầy cô, bạn bè thuộc Khoa Dƣợc - Trƣờng Đại học Yeungnam - Hàn Quốc, đặc biệt TS Trần Tuấn Hiệp, TS Nguyễn Hạnh Thủy, GS TS Jong Oh Kim, nhƣ thầy cô, bạn bè thuộc Viện Dƣợc – Trƣờng Đại học Tartu - Estonia, đặc biệt GS TS Jyrki Heinamaki, PGS TS Karin Kogermann, GS TS Ain Raal giúp đỡ hƣớng dẫn tơi tận tình q trình làm thực nghiệm hai sở nói Góp phần không nhỏ để đạt đƣợc kết luận án, xin cảm ơn giúp đỡ quý báu cô chú, anh chị thuộc công ty cổ phần Dƣợc phẩm TW 1, công ty cổ phần Dƣợc phẩm Sao Kim, công ty cổ phẩn Dƣợc phẩm Pymepharco, cơng ty cổ phần Dƣợc TW Medipharco, Phịng thí nghiệm Hiển vi điện tử Vi phân tích thuộc Viện Tiên tiến Khoa học Công nghệ - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, thực phẩm mỹ phẩm Thừa Thiên Huế, Trung tâm phƣơng pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học, Phịng Hiển vi điện tử - Viện Khoa học vật liệu, Phịng Thử nghiệm sinh học - Viện Cơng nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ nguyên liệu, hóa chất trang thiết bị, kỹ thuật giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cám ơn đến nhà xuất Taylor & Francis, Hidawi, Bộ Y tế, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội xét duyệt đăng tải kết nghiên cứu đƣợc sử dụng luận án tạp chí Drug Development and Industrial Pharmacy, Journal of Nanomaterials, Tạp chí Dƣợc học, Tạp chí Nghiên cứu Dƣợc Thơng tin thuốc Lời cám ơn cuối muốn dành tặng cho ngƣời thân gia đình bạn bè, đặc biệt gia đình bố mẹ nội ngoại, vợ hai bên cạnh động viên, giúp đỡ hy sinh nhiều để tơi học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2019 NCS Hồ Hoàng Nhân MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng artesunat .2 1.1.1 Công thức 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định artesunat 1.1.4 Các phƣơng pháp định lƣợng artesunat 1.1.5 Tác dụng ức chế ung thƣ 1.1.6 Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thƣ 1.2 Tiểu phân nano polyme 1.2.1 Đặc điểm 1.2.2 Một số phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano polyme 10 1.2.3 Vài nét việc cải thiện đặc tính bề mặt tiểu phân nano PLGA chitosan PEG 12 1.2.4 Phƣơng pháp đánh giá số đặc tính lý hóa tiểu phân nano 15 1.2.5 Phƣơng pháp đƣa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm 19 1.2.6 Một số nghiên cứu tiểu phân nano PLGA chức hóa bề mặt cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa 20 1.3 Ứng dụng công nghệ nano điều trị bệnh ung thƣ 26 1.3.1 Đặc điểm sinh học khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano 26 1.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế ung thƣ tiểu phân nano 27 1.3.3 Một số chế phẩm nano sử dụng điều trị bệnh ung thƣ 28 1.3.4 Một số nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thƣ tiểu phân nano chứa dẫn chất artemisinin 29 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .34 2.1.1 Nguyên liệu 34 2.1.2 Tế bào động vật thí nghiệm 35 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 35 2.2 Địa điểm nghiên cứu .36 2.3 Nội dung nghiên cứu 37 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 37 2.4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 42 2.4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 47 2.4.4 Đánh giá đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 48 2.4.5 Theo dõi độ ổn định 53 2.4.6 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro tác dụng ức chế khối u in vivo 54 2.4.7 Xử lý số liệu 57 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .58 3.1 Kết bào chế tiểu phân nano artesunat 58 3.1.1 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS phƣơng pháp nhũ hóa bốc dung mơi hấp phụ vật lý 58 3.1.2 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS phƣơng pháp phun điện trƣờng 65 3.1.3 Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 70 3.2 Kết đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 81 3.2.1 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS 81 3.2.2 Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG 85 3.3 Kết bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 89 3.3.1 Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat 89 3.3.2 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg 94 3.4 Kết đánh giá đặc tính bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 96 3.4.1 Một số đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 96 3.4.2 Hình thái tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô 97 3.4.3 Phổ nhiễu xạ tia X 97 3.4.4 Phân tích phổ hồng ngoại 98 3.4.5 Phân tích nhiệt vi sai 99 3.4.6 Khả giải phóng hoạt chất in vitro 99 3.5 Kết đề xuất tiêu chuẩn sở độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 100 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn sở bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 100 3.5.2 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 101 3.5.3 Độ ổn định hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau phân tán lại 106 3.6 Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 107 3.6.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro tiểu phân nano artesunat 107 3.6.2 Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 111 CHƢƠNG BÀN LUẬN 114 4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 114 4.1.1 Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA chitosan 114 4.1.2 Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA PEG 120 4.2 Đánh giá đặc tính lý hóa tiểu phân nano artesunat 125 4.2.1 Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA chitosan 125 4.2.2 Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA PEG 128 4.3 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 130 4.4 Đánh giá đặc tính lý hóa, vi sinh bột đông khô .134 4.5 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm 138 4.6 Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro tác dụng ức chế khối u in vivo 140 4.6.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro 140 4.6.2 Tác dụng ức chế khối u in vivo 143 4.7 Đóng góp luận án 148 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .149 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy) ART Artesunat ATN Artemisinin ATNs Artemisinin dẫn chất C6 Coumarin CD Cyclodextrin CS Chitosan DCM Dicloromethan DHA Dihydroartemisinin DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Acid deoxyribonucleic DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry) EPR Hiệu ứng tăng tính thấm lƣu giữ (Enhanced Permeability and Retention effect) FDA Cục quản lý Dƣợc phẩm Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug Administration) FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared Spectroscopy) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) i.p Đƣờng tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection) i.v Đƣờng tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection) KTTP Kích thƣớc tiểu phân trung bình theo cƣờng độ (Z-Average, Intensity Distribution) LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) LLC Ung thƣ phổi Lewis chuột (Lewis Lung Cancer) 2.5 Hàm ẩm Phƣơng pháp Karl-Fisher theo DĐVN IV, sử dụng 0,3g chế phẩm 2.6 pH hỗn dịch sau phân tán lại Thấm ƣớt phân tán lại chế phẩm với ml nƣớc cất lần theo thành lọ chứa bột đông khơ Sau đó, tiến hành lắc nhẹ khoảng phút để đảm bảo rã hịa tan hồn tồn bánh đông khô Tiến hành đo pH theo DĐVN IV - Phụ lục 6.2 2.7 Định tính A Trên sắc ký đồ thu đƣợc mục "Tạp chất liên quan", vết thu đƣợc sắc ký đồ dung dịch thử phải phù hợp vị trí, hình dạng màu sắc với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (3) B Hòa tan 1,0 g chế phẩm 10 ml cloroform cách thủy Làm bay đến giọt dung dịch đĩa sứ đến khô cách thủy, thêm vào cắn giọt dung dịch vanilin % acid sulfuric xuất màu đỏ C Hòa tan 50 mg chế phẩm ml diclorometan, cho bay hết dung mơi cách thủy, sau thêm ml dung dịch hydroxylamin hydroclorid % ethanol 90%, thêm ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 M ethanol Đun nóng hỗn hợp cách thủy đến sơi, để nguội, acid hóa dung dịch acid hydrocloric 10% thêm giọt dung dịch s t (III) clorid %, dung dịch xuất màu tím đỏ 2.8 Tạp chất liên quan Tiến hành theo cách sau: - Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng: Bản mỏng: Silicagel G hoạt hóa 120 oC 30 phút Dung môi khai triển: Ethyl acetat - toluen (1 : 1) Dung dịch thử: Tiến hành phân tán lại bột thuốc ml hỗn hợp dung môi gồm nƣớc cất ACN (tỉ lệ 1:9), sau chuyển vào bình định mức 10 ml bổ sung hỗn hợp dung mơi đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu đƣợc dung dịch thử Dung dịch đối chiếu (1): Chứa 0,2 mg dihydroartemisinin ml ACN Dung dịch đối chiếu (2): Chứa 0,1 mg dihydroartemisinin ml ACN Dung dịch đối chiếu (3): Chứa 10,0 mg artesunat chuẩn ml ACN - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 l dung dịch trên, riêng dung dịch thử tiến hành chấm lần Triển khai sắc ký đến dung môi đƣợc 15 cm, lấy mỏng PL-6 để khơ ngồi khơng khí, phun lên mỏng dung dịch vanilin % acid sulfuric (TT) Sấy 105 oC 10 phút quan sát sắc ký đồ dƣới ánh sáng ban ngày Đọc kết quả: - Trên sắc ký đồ dung dịch thử, ngồi vết tƣơng ứng với vết ART dung dịch đối chiếu (3), vết DHA phải không đƣợc đậm màu vết DHA dung dịch đối chiếu (1) - Và sắc ký đồ dung dịch thử, không đƣợc vết phụ ngồi vết ứng với DHA có màu đậm màu vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) 2.9 Định lượng Tiến hành phƣơng pháp sắc ký lỏng với pha động gồm hỗn hợp ACN dung dịch đệm phosphat pH 3,0 (45:55, thay đổi tỉ lệ cần cách giảm lƣợng ACN) (cách pha dung dịch đệm phosphat pH 3,0: hoà tan 1,36 g kali dihydrophosphat 1000 ml nƣớc, điều chỉnh dung dịch tới pH 3,0 acid phosphoric đậm đặc) Dung dịch thử: Bột đông khô sau phân tán lại nƣớc cất lần bình định mức 10 ml, tiếp tục pha lỗng 10 lần ACN Lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,45μm Dung dịch chuẩn: Cân xác 20,0 mg artesunat chuẩn Hịa tan bình định mức 10 ml hỗn hợp ACN nƣớc (tỉ lệ 9:1, tt/tt) đến vạch Tiếp tục pha loãng 10 lần hỗn hợp ACN nƣớc (tỉ lệ 9:1, tt/tt) để có dung dịch artesunat chuẩn với nồng độ xác khoảng 200 µg/ml Điều kiện s c ký: Cột sắc ký C18 (25 cm  4,6 cm, hạt nhồi m; Detector quang phổ tử ngoại đặt bƣớc sóng 210 nm; Tốc độ dịng: ml/phút; Thể tích tiêm: 50 l Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn thử Tính hàm lƣợng artesunat, C19H28O8, có đơn vị chế phẩm dựa vào diện tích pic thu đƣợc từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lƣợng C19H28O8 artesunat chuẩn 2.10 Tỉ lệ dược chất nano hóa Tiến hành phân tán bột đơng khơ pha tiêm chứa nano ART/PLGA-PEG ml nƣớc cất Sau đó, chuyển hỗn dịch thu đƣợc vào bình định mức 10 ml, bổ sung nƣớc cất đến vạch Hút xác ml hỗn dịch nano, ly tâm 4500 vòng/phút (2332 g) 30 phút ống ly tâm gắn màng 10kDa (MWCO 10 kDa, Millipore, Mỹ) Lấy phần dịch bên dƣới màng lọc, sau tiến hành sắc ký HPLC với điều kiện nhƣ phần định lƣợng Hàm lƣợng dƣợc chất tổng đƣợc định lƣợng cách pha PL-6 loãng mẫu với ACN, lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau tiến hành sắc ký với điều kiện tƣơng tự Hiệu suất mang thuốc (EE) đƣợc tính theo cơng thức nhƣ sau: ( ) 2.11 Khả giải phóng dược chất in vitro Tiến hành phân tán bột đông khô pha tiêm chứa nano ART/PLGA-PEG ml nƣớc cất hai lần Sau đó, chuyển hỗn dịch thu đƣợc vào bình định mức 10 ml, bổ sung nƣớc cất đến vạch Khả giải phóng dƣợc chất in vitro bột đơng khơ pha tiêm đƣợc tiến hành với túi thẩm tích (10kDa – Membra-Cel, Mỹ) chứa ml hỗn dịch nano ART/PLGA-PEG Túi thẩm tích đƣợc giữ cố định hai kẹp nhựa đặt ống ly tâm 50 ml chứa 20 ml dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4 Ống ly tâm đƣợc đặt bể lắc điều nhiệt nhiệt độ 37 ± 0,5oC với tốc độ 100 vòng/phút Sau thời điểm định, thể tích mơi trƣờng bên ngồi túi thẩm tích đƣợc hút để định lƣợng hàm lƣợng dƣợc chất giải phóng thay thể tích mơi trƣờng tƣơng ứng Tiến hành định lƣợng tƣơng tự nhƣ đề cập phần định lƣợng HPLC - Nồng độ ART thời điểm t đƣợc tính theo cơng thức Ct = St Cc Sc Trong đó: Ct, Cc nồng độ ART dung dịch thử dung dịch chuẩn (µg/ml); St, Sc diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn (mAu.s) Khối lƣợng ART giải phóng mơi trƣờng thời điểm thứ t đƣợc tính theo cơng thức: t-1 mt = Ct × + ∑ Ci i=1 Trong đó: mt: Tổng lƣợng ART giải phóng mơi trƣờng hịa tan thời điểm t (μg) Ct: Nồng độ ART môi trƣờng thử thời điểm t (μg/ml) V: Thể tích mơi trƣờng khuếch tán (ml) V‘: Thể tích lần lấy mẫu thử (ml) Phần trăm giải phóng thời điểm t đƣợc xác định cơng thức: mt % ART giải phóng = x100% mo Trong đó: mt khối lƣợng dƣợc chất giải phóng thời điểm t (μg) PL-6 mo khối lƣợng dƣợc chất ban đầu đƣa vào túi thẩm tích (μg) 2.12 Độ vơ khuẩn Thử theo phƣơng pháp cấy trực tiếp (theo chuyên luận ―Thử vô khuẩn‖ ghi phụ lục 13.7 Dƣợc điển Việt Nam IV) Cụ thể, tiến hành phân tán bột đông khô ml nƣớc cất pha tiêm Hút xác ml hỗn dịch sau phân tán cấy trực tiếp vào 200 ml môi trƣờng Fluid Thioglycolat môi trƣờng Soyabean Casein Digest chuẩn bị sẵn, lắc Tiến hành ủ môi trƣờng, theo dõi đánh giá kết sau 14 ngày [1] 2.13 Tồn dư dung mơi Tiến hành phƣơng pháp sắc khí khí với kỹ thuật tiêm pha tĩnh detector ion hóa lửa theo chuyên luận ―Xác định dung môi tồn dƣ‖ ghi phụ lục 10.14 Dƣợc điển Việt Nam IV) Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản - Bột đơng khơ đóng lọ thủy tinh, nút cao su, chụp nhơm kín - Bảo quản nhiệt độ 2-8oC - Nhãn quy chế Hà Nội, ngày PL-6 tháng năm 2017 PHỤ LỤC Kết đánh giá độ ổn định bột đông khô pha tiêm Một số hình ảnh cảm quan mẫu thử nghiệm đánh giá độ ổn định Hình Hình ảnh tính chất mẫu bột đơng khơ trƣớc đánh giá độ ổn định (tháng thứ 0) tháng ± 3oC tháng ± 3oC tháng ± 3oC Hình Hình ảnh m t đáy lọ mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện ± 3oC PL-7 tháng ± 3oC Hình Hình ảnh trƣớc sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện ± 3oC 12 tháng ± 3oC 12 tháng ± 3oC 12 tháng ± 3oC Hình Hình ảnh m t đáy lọ mẫu bột đông khô sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC 12 tháng ± 3oC Hình Hình ảnh trƣớc sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC PL-7 tháng ĐK thực tháng ĐK thực tháng ĐK thực Hình Hình ảnh m t đáy lọ mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực tháng ĐK thực Hình Hình ảnh trƣớc sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực Hình Kích thƣớc tiểu phân PDI mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực PL-7 Hình Hình ảnh mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực Hình 10 Hình ảnh sau phân tán lại mẫu bột đông khô sau tháng bảo quản điều kiện thực (hình khoanh trịn: bơng lơ lửng) Về khả giải phóng dƣợc chất Bảng Phần trăm giải phóng dƣợc chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC Thời gian (giờ) Tỷ lệ giải phóng (%) Ban đầu (t=0) Sau 12 tháng (5 ± 3oC) 12,08 ± 1,19 8,81 ± 0,27 22,37 ± 2,12 17,19 ± 1,43 29,51 ± 3,82 27,31 ± 1,32 44,45 ± 3,05 38,80 ± 4,36 48,01 ± 1,77 43,33 ± 4,60 10 51,90 ± 2,15 47,28 ± 3,93 PL-7 24 66,93 ± 1,65 64,10 ± 1,64 32 70,07 ± 1,07 67,55 ± 1,36 48 72,89 ± 1,52 72,32 ± 2,51 Hình 11 Sắc k đồ ART giải phóng sau từ bột đông khô pha tiêm chứa nano ART sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC Hình 12 Sắc k đồ ART giải phóng sau từ bột đông khô pha tiêm chứa nano ART sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC PL-7 Hình 13 Sắc k đồ mẫu bảo quản 12 tháng điều kiện ± 3oC Hình 14 Phổ XRD ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật l (PM_S), DHA bột đông khô chứa tiểu phân nano ART/PLGA-PEG thời điểm điều kiện bảo quản khác (NPs_S (t=3t, room): sau tháng điều kiện thực, NPs_S (t=12t, 5oC): sau 12 tháng điều kiện ± 3oC) PL-7 PHỤ LỤC Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro in vivo tiểu phân nano artesunat Bảng Tỉ lệ ức chế phát triển tế bào ung thƣ LLC in vitro Tỉ lệ ức chế thời điểm 24 (%) Nồng độ (μg/ml) 100 50 25 12,5 6,25 3,125 Nồng độ (μg/ml) 100 50 25 12,5 6,25 3,125 PLGAPEG ART nguyên liệu Nano ART/PLGAPEG Nồng độ (μg/ml) Paclitaxel 15,86 11,06 4,96 3,71 97,63 52,86 29,82 25,19 15,21 3,02 108,62 107,56 105,29 92,19 56,55 28,79 20 10 2,5 1,25 41,41 10,15 6,93 2,63 0,52 Tỉ lệ ức chế thời điểm 48 PLGAPEG 16,95 12,14 7,21 5,11 ART nguyên liệu 96,37 80,92 57,08 47,10 24,98 10,75 Nano ART/PLGAPEG 104,30 103,33 102,10 101,91 66,55 46,39 Nồng độ (μg/ml) 20 10 2,5 1,25 Hình Hình ảnh chuột ngày thứ 15 (trái: nhóm tiêm ART nguyên liệu, phải: nhóm đối chứng) PL-8 Paclitaxel 109,96 49,36 21,70 3,06 0,28 Bảng Kết xử l thống kê so sánh tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro cơng thức dịng tế bào MCF-7 nồng độ ART 100 µg/ml Overall ANOVA DF Model Error Total Tukey test AP100 AS100 AA100 AS100 AA100 AP100 Sum of Squares Mean Square F Value Prob>F 0,06165 0,03082 33,643 6,65E-05 0,00825 9,16E-04 11 0,06989 MeanDiff SEM q Value Prob Alpha Sig LCL UCL 0,10725 0,0214 7,08663 0,00188 0,05 0,04749 0,16701 0,17400 0,0214 11,4972 5,17E-05 0,05 0,11424 0,23376 0,06675 0,0214 4,41056 0,03005 0,05 0,00699 0,12651 AP: TP nano ART/PLGA; AS: TP nano ART/PLGA-CS, AA: ART nguyên liệu Bảng Kết xử l thống kê so sánh tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro công thức dịng tế bào A549 nồng độ ART 100 µg/ml Overall ANOVA DF Model Error Total Tukey test AP100 AS100 AA100 AS100 AA100 AP100 Sum of Squares Mean Square F Value Prob>F 49,21892 24,60946 41,98434 5,73E-05 4,68926 0,58616 10 53,90818 MeanDiff 0,54392 4,99292 4,44900 SEM q Value Prob Alpha Sig LCL UCL 0,54137 1,42089 0,59455 0,05 -1,00301 2,09085 0,58474 12,07547 7,10E-05 0,05 3,32205 6,66380 0,58474 10,75999 1,62E-04 0,05 2,77812 6,11988 AP: TP nano ART/PLGA; AS: TP nano ART/PLGA-CS, AA: ART nguyên liệu PL-8 Bảng Kết xử l thống kê so sánh khối lƣợng chuột thời điểm trƣớc sau tiêm thuốc nhóm tiêm nguyên liệu ART Normality Test - Shapiro-Wilk DF Statistic p-value Decision at level(5%) NL Ngày 0,76206 0,02607 Reject normality NL Ngày 0,77266 0,03290 Reject normality NL Ngày 10 0,75122 0,02047 Reject normality NL Ngày 15 0,76985 0,03094 Reject normality NL Ngày 20 0,76115 0,02556 Reject normality Friedman ANOVA Descriptive Statistics N Min Q1 Median Q3 Max Ngày 23,70 23,75 25,09 26,39 26,46 Ngày 24,06 24,09 25,58 27,06 27,10 Ngày 10 25,10 25,18 26,00 26,83 26,90 Ngày 15 24,31 24,34 25,08 25,81 25,83 Ngày 20 23,63 23,66 24,26 24,82 24,87 Test Statistics Chi-Square DF Prob>Chi-Square 9,46667 0,05044 Nhận xét: - Nhƣ vậy, khối lƣợng chuột thời điểm nhóm tiêm nguyên liệu ART không tuân theo phân bố chuẩn (p0,05) PL-8 Bảng Kết xử l thống kê so sánh thể tích khối u nhóm thời điểm ngày Normality Test - Shapiro-Wilk Thời điểm Nhóm DF Statistic p-value Decision at level(5%) Ngày Bệnh lý 0,82880 0,10499 Can't reject normality Ngày Nano 0,78111 0,03948 Reject normality Ngày NL 0,75541 0,02249 Reject normality Kruskal-Wallis ANOVA Descriptive Statistics N Min Q1 Median Q3 Ngày Bệnh lý 462,80 464,52 565,56 723,04 Ngày Nano 535,63 537,92 575,49 619,76 Ngày NL 469,55 475,23 592,08 725,01 Test Statistics Chi-Square Ngày DF 0,04678 Prob>Chi-Square 0,97688 Nhận xét: - Nhƣ vậy, thể tích khối u nhóm Nano nhóm ngun liệu ngày khơng tn theo phân bố chuẩn (p0,05) PL-8 Bảng Kết xử l thống kê so sánh thể tích khối u nhóm thời điểm ngày 10 Normality Test - Shapiro-Wilk Thời điểm Nhóm DF Ngày 10 Bệnh lý Ngày 10 Nano Ngày 10 NL Kruskal-Wallis ANOVA Descriptive Statistics N Ngày 10 Bệnh lý Ngày 10 Nano Ngày 10 NL Test Statistics Chi-Square DF Ngày 10 12,31579 Mann-Whitney Test Test Statistics So sánh U Z Bệnh lý Nano 36 2,80224 Nano NL -2,80224 Bệnh lý NL 27 1,36109 Statistic p-value 0,76568 0,02824 0,76004 0,02493 0,74717 0,01869 Decision at level(5%) Reject normality Reject normality Reject normality Min Q1 Median Q3 5007,15 5011,03 5416,45 2220,20 2220,34 2434,57 4618,75 4624,49 4884,58 5791,35 2634,06 5177,88 Prob>Chi-Square 0,00212 Exact Prob>|U| Asymp Prob>|U| 0,00216 0,00507 0,00216 0,00507 0,17965 0,17349 Nhận xét: - Nhƣ vậy, thể tích khối u nhóm Bệnh lý, nhóm Nano nhóm ngun liệu ngày 10 khơng tn theo phân bố chuẩn (p