Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Hồ Hoàng Nhân NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO ARTESUNAT PHA TIÊM HƯỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2019 Cơng trình hoàn thành tại: - Trường Đại học Dược Hà Nội - Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế - Viện Dược, Đại học Tartu, Estonia - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công Trường Dược, Trường Đại học Yeungnam, Hàn Quốc nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến GS TS Chul Soon Yong Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường ĐH Dược Hà Nội DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Hoang Nhan Ho, Tuan Hiep Tran, Trong Bien Tran, Chul Soon Yong, Chien Ngoc Nguyen (2015), “Optimization and Characterization of Artesunate-Loaded Chitosan-Decorated Poly (D,L-lactide-co-glycolide) Acid Nanoparticles”, Journal of Nanomaterials, Article ID 674175, DOI: 10.1155/2015/674175 Hồ Hoàng Nhân, Hoàng Thị Hương, Phạm Văn Minh, Nguyễn Ngọc Chiến (2016), “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat-PLGA PEG hóa”, Tạp chí Nghiên cứu dược thông tin thuốc, số 4+5, tr.19-23 Hoang Nhan Ho, Ivo Laidmäe, Karin Kogermann, Andres Lust, Andres Meos, Chien Ngoc Nguyen & Jyrki Heinämäki (2017), “Development of electrosprayed artesunate-loaded core–shell nanoparticles”, Drug Development and Industrial Pharmacy, 43(7), pp 1134-1142, DOI: 10.1080/03639045.2017.1300163 Hồ Hoàng Nhân, Nguyễn Ngọc Chiến (2018), “Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat”, Tạp chí Dược học, 58 (501), tr 79, 32 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Artesunat (ART) sản phẩm trình chiết xuất bán tổng hợp từ Artemisia annua L., gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư Nhằm làm tăng sinh khả dụng tác dụng ức chế tế bào ung thư ART, công nghệ nano nghiên cứu Trong đó, tiểu phân nano (viết tắt TP nano) polyme cho thấy kết đầy hứa hẹn hướng điều trị bệnh ung thư Việc kết hợp acid poly (lactic-coglycolic) (PLGA) có khả kiểm sốt trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, phân hủy sinh học với polyme thân nước chitosan (CS) hay polyethylen glycol (PEG) sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt TP nano tăng cường bám dính sinh học giúp làm giảm hoạt hóa bổ thể, giảm tương tác bắt giữ đại thực bào, giúp kéo dài thời gian tuần hoàn TP nano, tạo hội đưa thuốc đến khối u đích điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất, giảm độc tính Mục tiêu luận án Xây dựng cơng thức quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat quy mô phịng thí nghiệm; Xây dựng cơng thức quy trình bào chế bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat quy mơ phịng thí nghiệm; Đề xuất tiêu chuẩn sở đánh giá độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro in vivo tiểu phân nano artesunat Những đóng góp luận án Đến thời điểm tại, chưa tìm thấy cơng bố bào chế đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro in vivo bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART 20 mg sử dụng đồng thời PLGA PLGA-PEG Việt Nam, kết nghiên cứu luận án xem đóng góp lĩnh vực cơng nghệ bào chế dược phẩm nước, cụ thể sau: - Nghiên cứu xây dựng công thức quy trình bào chế TP nano ART sử dụng PLGA bao CS bao PEG phương pháp nhũ hóa – bốc dung mơi, đặc biệt phương pháp phun điện trường quy mơ phịng thí nghiệm - Nghiên cứu xây dựng công thức quy trình bào chế bột đơng khơ pha tiêm chứa TP nano ART hàm lượng 20 mg sử dụng PLGA PLGA-PEG quy mơ phịng thí nghiệm Đồng thời đánh giá tác dụng ức chế ung thư tế bào chuột TP nano ART bào chế chứng tỏ tác dụng ức chế số dòng tế bào ung thư vượt trội so với ART nguyên liệu khả ức chế tốt phát triển khối u in vivo chuột gây khối u tế bào ung thư phổi chuột (Lewis Lung Cancer – LLC) Những nghiên cứu lần đầu thực Việt Nam Cấu trúc luận án Luận án gồm 148 trang không kể tài liệu tham khảo phụ lục với bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang); Tổng quan (31 trang); Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu (24 trang); Kết nghiên cứu (56 trang); Bàn luận (34 trang); Kết luận Kiến nghị (2 trang) Luận án có danh mục cơng trình cơng bố (1 trang), 28 bảng, 49 hình, 177 tài liệu tham khảo (6 tài liệu tiếng Việt 171 tài liệu tiếng Anh), phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương artesunat CH3 H H3C O H O O H O CH OCOCH2 CH2 COOH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo ART - Công thức phân tử: C19H28O8 1.2 Tiểu phân nano polyme 1.2.1 Đặc điểm TP nano polyme tiểu phân có kích thước nano sử dụng polyme làm giá mang dược chất, có cấu trúc dạng siêu vi nang hay siêu vi cầu Các polyme sử dụng bào chế TP nano polyme gồm polyme tự nhiên hay tổng hợp Trong có loại phân hủy sinh học, tương hợp với thể sống, ví dụ PLGA polyme tổng hợp sử dụng phổ biến có khả kiểm sốt trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mơ tế bào 1.2.2 Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme Dựa vào quy trình bào chế phân chia phương pháp bào chế TP nano polyme thành nhóm: - Nhóm phương pháp kết tủa - Nhóm phương pháp nhũ hóa Trong đó, liệt kê phương pháp bao gồm: Kết tủa thay đổi dung mơi, nhũ hóa bốc dung mơi, gel ion hóa, muối hóa, sử dụng dung môi siêu tới hạn, phun sấy, phun điện trường 1.2.3 Vài nét việc cải thiện đặc tính bề mặt tiểu phân nano PLGA chitosan PEG Việc kết hợp với CS hay PEG tiến hành phương pháp hấp phụ hay gắn kết hóa học 1.2.4 Phương pháp đánh giá số đặc tính lý hóa tiểu phân nano Bao gồm: đánh giá KTTP, PDI, zeta, hình thái cấu trúc nano, đánh giá tương tác lý hóa, trạng thái kết tinh, hiệu suất nano hóa (EE) khả nạp thuốc (LC), khả giải phóng dược chất in vitro 1.2.5 Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm Có thể dùng hai dạng thuốc tiêm hỗn dịch thuốc tiêm đơng khơ, ngồi cịn bào chế dạng bột phun sấy 1.2.6 Một số nghiên cứu tiểu phân nano PLGA chức hóa bề mặt cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa Đã có số nghiên cứu ngồi nước sử dụng TP nano PLGA chức hóa bề mặt CS hay PEG, đó, chưa tìm thấy cơng bố liên quan đến hướng nghiên cứu nước Đồng thời, đến thời điểm chưa có cơng bố ngồi nước nước sử dụng CS hay PEG để thay đổi đặc tính TP nano PLGA chứa dược chất ART 1.3 Ứng dụng công nghệ nano điều trị bệnh ung thư 1.3.1 Đặc điểm sinh học khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang thuốc nano Gồm có: Cấu trúc bất thường lớp lót nội mạc mạch máu qua khối u; pH ngoại bào khối u thấp hơn; Các kháng nguyên đặc hiệu khối u 1.3.2 nano 1.3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư tiểu phân Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro Đánh giá tác dụng kháng ung thư hỗn dịch nano sau pha mơi trường phân tán dịng tế bào ung thư sau khoảng thời gian kỹ thuật trypan blue, MTT (3-(4, 5dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromid), phân tích FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), 1.3.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo Mô hình ghép dị lồi (Xenograft model) Sử dụng dịng tế bào ung thư người cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch (hay chuột “nude” BALB/c nude) Mơ hình ghép đồng lồi (Allograft hay syngeneic model) Sử dụng dòng tế bào ung thư chuột cấy ghép chuột có hệ miễn dịch bình thường chuột BALB/c 1.3.3 thư Một số chế phẩm nano sử dụng điều trị bệnh ung Hiện có số chế phẩm sử dụng công nghệ nano thị trường Abraxane (Paclitaxel gắn albumin/100 mg/TP nano polyme), Doxil/Caelyx (Doxorubicin HCl PEG hóa/20mg/10 ml 50mg/25ml/Liposome), 1.3.4 Một số nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư tiểu phân nano chứa dẫn chất artemisinin Qua tổng quan tài liệu cho thấy Việt Nam, việc áp dụng loại thuốc có kích thước nano dẫn chất artemisinin, đặc biệt ART nói riêng cịn hạn chế Vì vậy, đề tài định hướng tạo TP nano polyme ART/PLGA thay đổi đặc tính bề mặt TP nano thu polyme thân nước Tiếp theo, đưa TP nano polyme vào dạng thuốc tiêm, đồng thời đánh giá hiệu chống số dòng tế bào ung thư in vitro in vivo TP nano ART bào chế CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, BP, USP, tinh khiết phân tích HPLC 2.1.2 2.1.2.1 Tế bào động vật thí nghiệm Tế bào thí nghiệm Gồm: Tế bào ung thư vú người MCF-7, tế bào ung thư phổi người A549, tế bào ung thư phổi chuột LLC 2.1.2.2 Động vật thí nghiệm Chuột chủng dịng BALB/c khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, khơng phân biệt giống, khơng mắc bệnh, 8-9 tuần tuổi, có khối lượng 25-29 g 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu Các dụng cụ, thiết bị sử dụng đạt yêu cầu cho bào chế, kiểm nghiệm đánh giá tác dụng dược lý 2.2 Địa điểm nghiên cứu Trường Đại học Dược Hà Nội; Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế; Trường Dược, Trường Đại học Yeungnam, Hàn Quốc; Viện Dược, Đại học Tartu, Estonia; Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam 2.3 Nội dung nghiên cứu Bao gồm nội dung để thực mục tiêu luận án 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat 2.4.1.1 Bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA chitosan phương pháp nhũ hóa bốc dung môi hấp phụ vật lý Bằng phương pháp nhũ hóa bốc dung mơi hấp phụ vật lý TP nano tối ưu có hình cầu, kích thước tiểu phân khoảng 190 nm Phổ IR zeta dương chứng tỏ có mặt CS bề mặt TP nano PLGA Hình 3.16 Hình ảnh TEM Hình 3.18 Đồ thị thể tỷ lệ giải phóng TP nano ART/PLGA-CS dược chất từ TP nano ART/PLGA ART/PLGA-CS (n=3) Khả giải phóng ART từ TP nano ART/PLGA-CS tối ưu môi trường đệm phosphat pH 6,8 thể qua hình 3.18 Tốc độ giải phóng dược chất từ hệ ART/PLGA-CS chậm từ hệ ART/PLGA Đồ thị giải phóng ART từ TP nano có giai đoạn: nhanh ban đầu theo sau giai đoạn chậm 3.2.1.2 Bằng phương pháp phun điện trường Phân tích phổ X-ray chứng tỏ ART CS tồn trạng thái vô định hình TP nano Tương tự, phổ IR gợi ý khơng có tương tác thành phần cơng thức, góp phần xác nhận có mặt CS bề mặt TP nano Hình 3.19 Đồ thị thể tỷ lệ giải phóng dược chất từ bột ART TP nano PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) Với bột ART, 90% ART hòa tan giờ, ngược lại với TP nano ART/PLGA-CS xấp xỉ 50% hàm lượng thuốc giải phóng đặc trưng giai đoạn giải phóng nhanh ban đầu theo sau giai đoạn giải phóng chậm liên tục Phương trình KorsmeyerPeppas mơ tả tốt động học giải phóng dược chất từ nano ART/PLGA-CS có giá trị AIC nhỏ 3.2.2 Đối với tiểu phân nano A T PLGA-PEG TP nano có hình cầu thơng qua hình ảnh SEM, KTTP nhỏ Phổ XRD chứng tỏ ART tồn trạng thái vơ định hình hay dạng phân tán phân tử TP nano Phổ IR chứng tỏ khơng có tương tác ART thành phần công thức Phổ 1HNMR TP nano CDCl3 D2O chứng tỏ tồn chuỗi PEG bên TP nano PLGA-PEG Sự giải phóng ART chia làm pha: pha giải phóng nhanh (giải phóng ạt) đầu pha giải phóng chậm sau Sự giải phóng dược chất TP nano ART/PLGA-PEG nhanh nhiều TP nano ART/PLGA Do có giá trị AIC nhỏ nhất, nên mơ hình Korsmeyer-Peppas mơ tả gần động học giải phóng TP nano ART/PLGA-PEG Như vậy, nghiên cứu bào chế TP nano ART/PLGA CS PEG phương pháp nhũ hóa – bốc dung mơi phun điện trường Tuy nhiên, có EE LC lớn, KTTP nhỏ, q trình bao gắn kết hóa học, đơn giản quy trình thiết bị khả nghiên cứu điều kiện Việt Nam nên TP nano ART sử dụng PLGA-PEG lựa chọn để bào chế bột đông khô 3.3 Kết bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 3.3.1 Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat Đã xây dựng công thức quy trình bào chế bột đơng khơ chứa nano ART với thông số saccarose với nồng độ 10%, thể tích đơng khơ 10 ml, thời gian đông khô với thời gian sấy sơ cấp 48 thời gian sấy thứ cấp 3.3.2 Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg Bột đông khô pha tiêm bào chế điều kiện vô khuẩn với quy trình đơng khơ tốt rút từ nghiên cứu mục 3.3.1 3.4 Kết đánh giá đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 3.4.1 Một số đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat Hình 3.30 Hình ảnh bột đơng khơ pha tiêm trước (A) sau phân tán lại (B) Bảng 3.17 Một số đặc tính bột đơng khơ pha tiêm chứa TP nano ART Chỉ tiêu đánh giá Tính chất bánh thuốc trước phân tán lại Thời gian phân tán Tính chất bánh sau phân tán lại KTTP (nm) PDI Thế zeta (mV) Độ đồng khối lượng (%) Độ ẩm (%) EE (%) pH hỗn dịch sau pha lại Hàm lượng (%) Độ vô khuẩn Tồn dư dung môi DCM Kết Bánh màu trắng, xốp, mịn Dưới phút Hỗn dịch màu trắng đục, không lắng cặn, đồng 199,0 ± 2,4 0,124 ± 0,007 -18,1 ± 0,7 Chênh lệch so với TB < 10% 1,314 ± 0,051 96,25 ± 1,32 3,770 ± 0,030 101,81 ± 0,96% Đạt 0,05) Q trình giải phóng dược chất với giai đoạn: nhanh ban đầu, chậm 3.5 Kết đề xuất tiêu chuẩn sở độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn sở bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat Bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART dạng bánh màu trắng, tạo hỗn dịch màu trắng đục, đồng sau phân tán lại, KTTP < 220 nm, PDI < 0,300, độ đồng khối lượng ± 10,0%, phần trăm dược chất giải phóng theo thời gian (qua màng thẩm tích 10kDa, pH 7,4) 15% sau giờ, 15-25% sau giờ, 25-35% sau giờ, tỉ lệ ART nano hóa khơng 90%, hàm ẩm khơng q 3%, định tính có mặt ART, đạt tạp chất liên quan, hàm lượng ART từ 90110% so với lượng ghi nhãn, đảm bảo vô khuẩn, tồn dư dung môi DCM không 60 ppm 3.5.2 Độ ổn định bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat Sau 12 tháng bảo quản điều kiện ± 3oC, bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART đảm bảo tiêu ban đầu Tuy nhiên, bảo quản điều kiện thực (15-35oC, độ ẩm 50-90%), sau tháng, bánh khơng cịn xốp, bị co vón lại Sau tháng điều kiện thực, KTTP TP nano lớn 674,6 ± 24,2 nm, PDI 0,198 ± 0,067, đồng thời mẫu bắt đầu xuất đỉnh kết tinh saccarose 3.5.3 Độ ổn định hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau phân tán lại Sau bảo quản hai điều kiện ± 3oC điều kiện thực (15-35oC, độ ẩm 50-90%), hỗn dịch nano sau phân tán lại nước cất đảm bảo tiêu giới hạn quy định 3.6 Kết đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro tác dụng ức chế khối u in vivo tiểu phân nano artesunat 3.6.1 Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro tiểu phân nano artesunat Trước đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo, hai TP nano ART sử dụng PLGA bao CS hay PEG bào chế phương pháp nhũ hóa – bốc dung môi sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro nhằm có nhìn bao quát tác dụng ức chế khối u TP nano ART 3.6.1.1 a Đối với tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA CS Đánh giá khả thấm vào tế bào TP nano PLGA-CS giúp cải thiện khả thấm vào tế bào so với TP nano PLGA khơng bao gói b Đánh giá độc tính tế bào in vitro TP nano bao CS cho kết độc tính cao tế bào MCF-7 A549 so với TP nano ART/PLGA (p 0,05) 3.6.2.2 khối u Sự phát triển Hình 3.43 Sự phát triển khối u chuột sử dụng đường tiêm tĩnh mạch đuôi TP nano mg/kg/ngày, ART tiêm liều 60 i.v., ngày/lần thể khả ức chế khối u tố so với nhóm đối chứng bệnh lý nhóm ART nguyên liệu liều 60mg/kg, tiêm i.v, ngày/lần mức có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) Việc sử dụng ART nguyên liệu liều 60mg/kg/ngày (đường tiêm i.v., ngày/lần) làm giảm kích thước khối u so với nhóm đối chứng bệnh lý, nhiên, thể sai khác thể tích khối u ngày 20 thí nghiệm (p