Nghiên cứu tinh chế thiết lập chất chuẩn vinblastin sulfats và vincristin sulfat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ðẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THANH HÀ NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN VINBLASTIN SULFAT VÀ VINCRISTIN SULFAT LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ðẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THANH HÀ NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN VINBLASTIN SULFAT VÀ VINCRISTIN SULFAT LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC – ðỘC CHẤT Mà SỐ : 60 73 15 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tường Vy PGS TS Trịnh Văn Lẩu HÀ NỘI 2012 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: - PGS.TS Trịnh Văn Lẩu – Chủ tịch Hội ñồng Dược ñiển Việt Nam, nguyên Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương - TS Nguyễn Tường Vy – Phòng Sau ñại học – Trường ðại học Dược Hà Nội Những người thầy trực tiếp hướng dẫn tơi tận tình suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học, Bộ mơn Hóa phân tích thầy giáo trường ðại học Dược Hà Nội giúp đỡ tơi q trình học tập trường trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc, Ths Lê Thị Thu - Phó trưởng Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu bạn ñồng nghiệp Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất ñối chiếu - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện san sẻ cơng việc thời gian qua để tơi hồn thành tốt khóa học luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, quan tâm, chia sẻ khích lệ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2012 Ds Mai Thanh Hà MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng hình ðẶT VẤN ðỀ………………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN………………………………………………… 1.1 Tổng quan ñối tượng nghiên cứu………………………………… 1.1.1 Vinblastin sulfat……………………………………………… 1.1.2 Vincristin sulfat……………………………………………………… 1.1.3 Các nghiên cứu giới………………………………………… 1.1.4 Các nghiên cứu nước………………………………………… 1.1.5 Tổng quan phương pháp phân tích Vinblastin sulfat Vincristin sulfat……………………………………………………… 1.2 Tổng quan tinh chế………………………………………………… 1.3 Tổng quan số phương pháp hóa lý sử dụng nghiên cứu ñề tài………………………………………………………… 1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao………………………… 1.3.2 Phương pháp ño phổ hồng ngoại…………………………………… 1.3.3 Phổ tử ngoại khả kiến………………………………………………… 1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân………………………………………… 1.3.5 Phương pháp phân tích khối phổ…………………………………… 11 1.3.6 Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng………………………… 11 1.4 Phương pháp thiết lập chất ñối chiếu……………………………… 13 1.4.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu……………………… 13 1.4.2 ðánh giá nguyên liệu………………………………………… 14 1.4.3 Sản xuất chất ñối chiếu……………………………………………… 14 1.4.4 Kiểm tra ñộ ñồng trình đóng gói……………… 14 1.4.5 Kiểm tra bán thành phẩm…………………………………………… 14 1.4.6 Lập hồ sơ, chứng chỉ, cấp phát……………………………………… 14 1.4.7 Kiểm tra ñịnh kỳ……………………………………………………… 15 1.4.8 Lưu hồ sơ……………………………………………………… 15 1.5 Tính mới, sáng tạo ñề tài………………………………………… 15 Chương ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 17 2.1 ðối tượng nghiên cứu………………………………………………… 17 2.2 Phương tiện nghiên cứu……………………………………………… 17 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………… 17 2.2.2 Hóa chất, dung mơi, chất đối chiếu………………………………… 17 2.3 Nội dung nghiên cứu…………………………………………… 17 2.3.1 Kiểm tra nguyên liệu trước tinh chế…………………………… 17 2.3.2 Tinh chế………………………………………………………………… 18 2.3.3 Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng ñánh giá nguyên liệu sau tinh chế………………………………………………………………………… 18 2.3.4 Thiết lập chất ñối chiếu……………………………………………… 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 18 2.4.1 Phương pháp tinh chế Vinblastin sulfat Vincristin sulfat…… 18 2.4.2 Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng ñánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat Vincristin sulfat sau tinh chế…………………… 19 2.4.3 Thiết lập chất ñối chiếu……………………………………………… 19 2.4.3.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu…………………… 19 2.4.3.2 ðánh giá nguyên liệu theo quy trình ñã xây dựng…………… 20 2.4.3.3 ðóng gói………………………………………………… 20 2.4.3.4 ðánh giá độ đồng q trình đóng gói……………… 20 2.4.3.5 ðánh giá liên phòng………………………………………………… 20 2.4.3.6 Phương pháp xử lý số liệu………………………………………… 20 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Lựa chọn điều kiện phân tích……………………………………… 21 3.2 Kiểm tra nguyên liệu trước tinh chế………………………… 22 3.3 Quy trình tinh chế……………………………………………… 22 3.3.1 Vinblastin sulfat……………………………………………………… 22 3.3.2 Vincristin sulfat……………………………………………………… 26 3.4 Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng chất sau tinh chế………… 29 3.4.1 Vinblastin sulfat……………………………………………………… 29 3.4.1.1 Tính chất……………………………………………………………… 29 3.4.1.2 Phổ tử ngoại khả kiến……………………………………………… 29 3.4.1.3 Phổ hồng ngoại……………………………………………………… 30 3.4.1.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân…………………………………… 31 3.4.1.5 Phổ khối lượng……………………………………………………… 31 3.4.2 Vincristin sulfat……………………………………………………… 32 3.4.2.1 Tính chất……………………………………………………………… 32 3.4.2.2 Phổ tử ngoại khả kiến……………………………………………… 32 3.4.2.3 Phổ hồng ngoại……………………………………………………… 32 3.4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân…………………………………… 33 3.4.2.5 Phổ khối lượng……………………………………………………… 34 3.5 Thiết lập chất ñối chiếu……………………………………………… 34 3.5.1 Vinblastin sulfat……………………………………………………… 34 3.5.1.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu Vinblastin sulfat 34 3.5.1.2 ðánh giá nguyên liệu……………………………………………… 42 3.5.1.3 ðóng gói……………………………………………………………… 47 3.5.1.4 ðánh giá đồng q trình đóng gói………………………… 47 3.5.1.5 So sánh liên phòng thí nghiệm…………………………………… 48 3.5.1.6 Xử lý kết quả………………………………………………………… 48 3.5.2 Vinblastin sulfat……………………………………………………… 51 3.5.2.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu Vincristin sulfat 51 3.5.2.2 ðánh giá nguyên liệu……………………………………………… 59 3.5.2.3 ðóng gói……………………………………………………………… 63 3.5.2.4 ðánh giá đồng q trình đóng gói………………………… 64 3.5.2.5 So sánh liên phòng thí nghiệm…………………………………… 65 3.5.1.6 Xử lý kết quả………………………………………………………… 65 Chương BÀN LUẬN…………………………………………………… 68 4.1 Tính hiệu kinh tế………………………………………… 68 4.2 Về quy trình tinh chế………………………………………………… 68 4.3 Về xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng chất kiểm tra nguyên liệu sau tinh chế……………………………………………………………… 68 4.4 Về ñánh giá phù hợp phương pháp xác ñịnh tạp chất liên quan ñịnh lượng 69 4.5 Về thiết lập chất ñối chiếu…………………………………………… 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 71 Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril ANOVA : Analysis of variance Phân tích phương sai 13 C-NMR COSY : 13-Carbon nuclear magnetic resonance : Chemical Shift Correlation Spectrometry Liên hệ dịch chuyển hóa học CRS : Chemical reference standard Chất đói chiếu hóa học DAD : Diode array detector DðVN : Dược ñiển Việt Nam DEPT : Distotionless enhancement by polarization transfer Chuyển ñổi phân cực biến ñổi dạng (phổ) ðKSK : ðiều kiện sắc ký HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence Liên hệ ña lượng tử dị nhân H-NMR HPLC : Proton nuclear magnetic resonance : High performance liquid chromatoghraphy Sắc ký lỏng hiệu cao HSQC : Heteronuclear Singular Quantum Coherence Liên hệ ñơn lượng tử dị nhân IR : Infrared Hồng ngoại ICRS : International chemical reference standard JCRS : Japan chemical reference standard LOD : Limit of detection Giới hạn phát MeOH : Methanol MS : Mass spectrometry Phổ khối lượng N : Số ñĩa lý thuyết NMR : Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân PA : Pure analysis PTN : Phòng thí nghiệm R : ðộ phân giải RSD : Relative standard deviation ðộ lệch chuẩn tương đối Spic : Diện tích pic SKð : Sắc ký đồ TB : Trung bình TGA : Thermogravimetric analysis Phân tích nhiệt trọng lượng TLCC & CðC : Khoa Thiết lập chất chuẩn chất ñối chiếu tR : Thời gian lưu WHO : World health organization Tổ chức y tế giới UV – VIS : Ultraviolet - Visible Tử ngoại - khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG TT bảng Bảng 1.1 Tên bảng Trang Chương trình sắc ký phân tích Vinblastin sulfat số 13 dược điển Bảng 1.2 Chương trình sắc ký phân tích Vincristin sulfat số 13 dược ñiển Bảng 3.1 ðiều kiện phân tích Vinblastin sulfat Vincristin sulfat 21 Bảng 3.2 Kết ñánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat 22 Vincristin sulfat trước tinh chế Bảng 3.3 So sánh kết trước sau tinh chế Vinblastin sulfat 25 Bảng 3.4 So sánh kết trước sau tinh chế Vincristin sulfat 28 Bảng 3.5 Kết xác ñịnh giới hạn phát tạp chất liên quan 37 Vinblastin sulfat Bảng 3.6 Kết ñánh giá phù hợp hệ thống sắc ký 38 Bảng 3.7 Kết xác định khoảng tuyến tính định lượng Vinblastin 39 sulfat Bảng 3.8 Kết ñánh giá ñộ lặp lại ñịnh lượng Vinblastin sulfat 40 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ xác trung gian định lượng 40 Vinblastin sulfat Bảng 3.10 Kết xác ñịnh ñộ ñúng ñịnh lượng Vinblastin sulfat 41 Bảng 3.11 Kết khoảng xác ñịnh ñịnh lượng Vinblastin sulfat 42 Bảng 3.12 Kết pH nguyên liệu Vinblastin sulfat 44 Bảng 3.13 Kết khối lượng làm khô nguyên liệu 44 Vinblastin sulfat Bảng 3.14 Kết tạp chất liên quan nguyên liệu Vinblastin sulfat 45 Bảng 3.30 Kết khối lượng làm khô nguyên liệu Vinblastin sulfat Mẫu thử Lượng cân (mg) 3,851 4,161 3,936 4,161 3,900 Lượng mẫu ñi (mg) 0,329 0,349 0,327 0,352 0,335 8,6 8,4 8,3 8,5 8,6 Mất khối lượng làm khơ (%) Trung bình (%) 8,5 RSD (%) 1,4 Hình 3.34 ðồ thị khối lượng làm khô nguyên liệu Vincristin sulfat Nhận xét: Nguyên liệu ñạt yêu cầu với tiêu khối lượng làm khô • Tạp chất liên quan Áp dụng ñiều kiện sắc ký quy trình thiết lập chất đối chiếu xây dựng Yêu cầu: Từng tạp chất ≤ 1,0% tổng tạp ≤ 4,0% 61 Bảng 3.31 Kết tạp chất liên quan nguyên liệu Vincristin sulfat tR (phút) Thử Thử Thử 3,2 Stạp (mAu.s) 227,66 % tạp 0,3 Stạp (mAu.s) 227,85 % tạp 0,3 Stạp (mAu.s) 228,34 % tạp 0,3 4,6 313,65 0,3 317,09 0,4 316,32 0,4 7,7 501,48 0,6 519,97 0,6 520,60 0,6 13,5 635,62 0,7 630,20 0,7 639,31 0,7 % Tổng tạp Trung bình 1,9% 2,0% 2,0% 2,0% 9.438 DAD1 A, Sig=297,4 Ref=360,100 (VINCR\VINCR089.D) mAU 175 150 125 100 0 10 19.376 15.994 13.510 1.551 1.750 25 7.737 3.280 50 4.612 75 20 30 Hình 3.35 Sắc ký đồ xác ñịnh tạp chất liên quan Nhận xét: Từng tạp chất ≤ 0,7% tổng tạp = 2,0% → Nguyên liệu ñạt tạp chất liên quan - ðịnh lượng: Áp dụng điều kiện sắc ký quy trình thiết lập chất ñối chiếu ñã xây dựng Yêu cầu: Hàm lượng nguyên liệu Vincristin sulfat phải ñạt từ 95,0% ñến 105,0% C46H56N4O10.H2SO4 62 Bảng 3.32 Kết ñịnh lượng nguyên liệu Vincristin sulfat Mẫu thử Lượng cân (mg) 10,73 Diện tích (mAu.s) 5690,46 Hàm lượng (%) 10,96 10,43 10,31 10,82 10,57 5827,47 5548,79 5476,63 5761,00 5593,27 99,6 99,8 99,9 Hàm lượng trung bình (%) RSD (%) 99,8 100,0 99,4 99,8 0,22 5.121 DAD1 A, Sig=297,4 Ref=360,100 (VINCR\VINCR052.D) 5.104 DAD1 A, Sig=297,4 Ref=360,100 (VINCR\VINCR043.D) mAU mAU 400 350 350 300 300 250 250 200 200 150 150 100 100 50 50 0 Sắc ký ñồ mẫu chuẩn Sắc ký ñồ mẫu thử Hình 3.36 SKð định lượng ngun liệu Vincristin sulfat Nhận xét: Ngun liệu có hàm lượng 99,8% (khan), đạt u cầu ñịnh lượng ñể thiết lập chất ñối chiếu Kết luận: Nguyên liệu Vincristin sulfat ñạt yêu cầu chất lượng ñể sản xuất chất ñối chiếu theo quy trình thiết lập chất đối chiếu xây dựng 3.5.2.3 ðóng gói - Nạp khí nitơ 99,99%, độ ẩm tương đối - 10% - Sử dụng lọ thủy tinh nâu, nút xốy có đệm teflon - ðánh số thứ tự lọ từ đến 90, đóng 30 mg/lọ x 90 lọ 63 3.5.2.4 ðánh giá độ đồng lơ - Mất khối lượng làm khô: Lấy lọ theo số thứ tự 5, 20, 35, 50, 65 80 ñem xác ñịnh khối lượng làm khô theo phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) Bảng 3.33 Kết ñánh giá ñộ ñồng khối lượng làm khô Vincristin sulfat Số thứ tự lọ Mất khối lượng làm khơ (%) Trung bình (%) 20 35 50 65 80 8,4 8,5 8,6 8,5 8,5 8,3 8,5 RSD (%) 1,2 Nhận xét: ðộ lệch cuẩn tương ñối lọ ñược kiểm tra khối lượng làm khô 1,2% < 1,5 % → Lơ thành phẩm đồng khối lượng làm khô - Hàm lượng: Lấy lọ theo số thứ tự 15, 30, 45, 60, 75, 90, xác ñịnh hàm lượng lọ phương pháp HPLC Tiến hành song song với chuẩn Vincristin sulfat ICRS Lot 193181 Bảng 3.34 Kết ñánh giá ñộ ñồng hàm lượng Vincristin sulfat Số thứ tự lọ Hàm lượng (%) 15 30 45 60 75 90 99,9 100,1 99,3 100,1 99,9 99,1 Trung bình (%) 99,7 RSD (%) 0,4 Nhận xét: RSD = 0,4% ( < 1,0 %): Lơ thành phẩm đồng hàm lượng Kết luận: Lơ thành phẩm sản xuất ngày 24/08/2012 đồng hàm lượng khối lượng làm khơ → Qui trình đóng gói ổn định 64 3.5.2.5 ðánh giá liên phòng: Bảng 3.35 Kết đánh giá thành phẩm Vincristin sulfat Khoa Vật lý Khoa ño lường TLCC&CðC ðịnh lượng (HPLC) Nguyên liệu phải có hàm 99,74% 99,48% (khan) (khan) - So sánh với chuẩn lượng từ 95,0% ñến 105,0 n=6 n=6 Vincristin sulfat ICRS % C46H56N4O10.H2SO4, RSD = 0,42% RSD = 0,26 % 193181 tính theo chế phẩm khan - HL: 9,3 mg/lọ Quy ñịnh hệ sắc ký: 4,3 4,4 R ≥ 4,0 RSDc ≤ 2,0 % 0,09 - 0,11 0,08 - 0,10 Tiêu chuẩn Yêu cầu Dð 3.5.2.6 Xử lý kết phân tích theo phương pháp thống kê Hàm lượng: - Khoa TLCC & CðC : 99,74 % (khan) ; n = ; RSD = 0,42 % - Khoa Vật lý ño lường : 99,48 % (khan) ; n = ; RSD = 0,26% ðánh giá Anova: Bảng 3.36 Kết đánh giá theo Anova Nhóm Số KQ TĨM TẮT Tổng Trung bình Phương sai PTN 598,41 99,74 0,176 PTN 596,86 99,48 0,067 Nguồn sai số Tổng số bình phương ANOVA Bậc tự Bình phương trung bình Giữa nhóm 0,200 0,200 Trong nhóm 1,217 10 0,122 Tổng cộng 1,417 11 Ftn Ftc 1,645 4,965 Nhận xét: Ftn = 1,645 < Ftc = 4,965 → Phương pháp có độ lặp lại PTN có độ tái lặp PTN tốt Kết luận: Kết phân tích phòng thí nghiệm giống 65 Tính giá trị cơng bố chứng chỉ: - Xác ñịnh giá trị ấn ñịnh phương sai ấn ñịnh: Bảng 3.37 Kết xác ñịnh giá trị ấn ñịnh thành phẩm Vincristin sulfat Xếp tăng dần x _x i * (0) x i (1) * * ( xi (1) _ x(1)) * x i ( 2) * * ( xi ( ) _ x ( ) ) * x i ( 3) x*-1,5s* 90,43 90,62 90,62 x*+ 1,5s* 91,73 91,74 91,74 90,73 0,3500 90,73 0,2018 90,73 0,2018 90,73 90,82 0,2600 90,82 0,1290 90,82 0,1290 90,82 90,91 0,1700 90,91 0,0725 90,91 0,0725 90,91 90,94 0,1400 90,94 0,0572 90,94 0,0572 90,94 90,96 0,1200 90,96 0,0480 90,96 0,0480 90,96 90,99 0,0900 90,99 0,0358 90,99 0,0358 90,99 91,17 0,0900 91,17 0,0001 91,17 0,0001 91,17 91,40 0,3200 91,40 0,0488 91,40 0,0488 91,40 91,47 0,3900 91,47 0,0846 91,47 0,0846 91,47 10 91,49 0,4100 91,49 0,0966 91,49 0,0966 91,49 11 91,63 0,5500 91,63 0,2033 91,63 0,2033 91,63 12 91,64 0,5600 91,64 0,2124 91,64 0,2124 91,64 x 91,18 s 0,329 x (0) 91,08 0,290 * x (n) * s ( n) Kết quả: 0,430 x* = 91,18%; 91,18 91,18 91,18 0,373 0,373 0,373 s* = 0,373 66 - Tính giá trị Z: Tập hợp kết PTN Bảng 3.38 Kết xác ñịnh giá trị Z Số thứ tự Hàm lượng (nguyên trạng) Z (x* = 91,18%; s* = 0,373) 90,73 -1,21 90,82 -0,97 90,91 -0,72 90,94 -0,64 90,96 -0,59 90,99 -0,51 91,17 -0,03 91,40 0,59 91,47 0,78 10 91,49 0,83 11 91,63 1,21 12 91,64 1,23 Số liệu thống kê Hàm lượng trung bình = 91,18% n = 12; S = 0,33; RSD = 0,36% Nhận xét: Các giá trị có /Z/ < 2,0 ⇒ Vậy hàm lượng trung bình : 91,18% C46H58N4O8.H2SO4(nguyên trạng); n = 12; RSD = 0,19% Giá trị công bố chứng chỉ: Hàm lượng: 91,18% C46H56N4O10.H2SO4 (ngun trạng) Tính độ khơng đảm bảo ño mở rộng: ðộ không ñảm bảo ño mở rộng giá trị công bố COA, với hệ số phủ k = ñộ tin cậy 95%: U = ± 0,19% 67 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Tính hiệu kinh tế - ðây lần ñầu tiên Việt Nam thực hiên việc thiết lập hai chất ñối chiếu Vinblastin sulfat Vincristin sulfat Việc thiết lập hai chất đối chiếu góp phần chủ ñộng nguồn chất ñối chiếu công tác kiểm tra chất lượng nguyên liệu chế phẩm có thị trường thuốc ñiều trị ung thư; ñồng thời tiết kiệm ñược thời gian ngân sách dùng ñể mua chất ñối chiếu - Trong trình ñánh giá thiết lập hai chất ñối chiếu trên, chúng tơi sử dụng phương pháp phân tích xác ñịnh khối lượng làm khô phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA Phương pháp vừa xác, tiết kiệm ngun liệu thời gian tiến hành so với phương pháp sấy chân không - Chúng tơi tiến hành kiểm tra phù hợp phương pháp phân tích HPLC xác định tạp chất liên quan ñịnh lượng theo hướng dẫn ASEAN, ICH 4.2 Về quy trình tinh chế - Nguyên liệu Vinblastin sulfat ñược tinh chế qua cột sắc ký pha ñảo C18 với dung môi rửa giải methanol – nước - acid sulfuric 0,05% (chạy chương trình gradient từ 10 - 100% methanol) Vinblastin sulfat ñược rửa giải với thời gian lưu khoảng Gộp phân ñoạn sắc ký chứa Vinblastin sulfat cô kiệt dung môi Sản phẩm thu ñược nguyên liệu Vinblastin sulfat dạng tinh thể màu trắng Nguyên liệu sau tinh chế có hàm lượng 99,9%, khối lượng làm khô 12,5% tổng tạp chất 0,6% - Nguyên liệu Vincristin sulfat ñược tinh chế giống quy trình tinh chế Vinblastin sulfat ñược rửa giải với thời gian lưu khoảng 7,5 Gộp phân ñoạn sắc ký chứa Vincristin sulfat kiệt dung mơi Sản phẩm thu nguyên liệu Vincristin sulfat dạng tinh thể màu trắng Nguyên liệu sau tinh chế có hàm lượng 99,6%, khối lượng làm khô 8,4% tổng tạp chất 2,0% 4.3 Về xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng ñánh giá nguyên liệu tinh chế ñược - Xác ñịnh cấu trúc: Việc phân tích thơng số phổ đặc trưng cho cấu trúc chất tinh chế ñược phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), phổ hồng ngoại (IR), 68 phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) phổ khối lượng (MS) khẳng định cơng thức phân tử cấu tạo chất tinh chế ñược ñúng Vinblastin sulfat Vincristin sulfat - ðánh giá nguyên liệu tinh chế Phương pháp HPLC mà chúng tơi áp dụng ñể xác ñịnh tạp chất liên quan ñịnh lượng ñược tiến hành ñơn giản từ pha mẫu, chuẩn bị pha ñộng ñến tiến hành sắc ký Các dụng cụ, dung mơi, hóa chất dễ tìm Với phương pháp HPLC ñã kiểm tra kiểm tra phù hợp phương pháp, chúng tơi tiến hành xác định tạp chất liên quan ñịnh lượng hai chất tinh chế Hai sản phẩm có hàm lượng 99,0%, ñạt yêu cầu ñể làm chất ñối chiếu kiểm tra chất lượng nguyên liệu chế phẩm chữa ung thư thị trường chứa hai hoạt chất 4.4 Về ñánh giá phù hợp phương pháp xác ñịnh tạp chất liên quan ñịnh lượng - Trên sở Dược điển Mỹ 34, chúng tơi ñã tiến hành kiểm tra phù hợp phương pháp xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu - Kết kiểm tra phù hợp phương pháp HPLC cho thấy phương pháp định lượng có ñộ ñặc hiệu, ñộ lặp lại, ñộ lặp lại trung gian, ñộ ñúng cao Trong khoảng nồng ñộ khảo sát có tương quan chặt chẽ nồng độ diện tích pic phương pháp xác định tạp chất liên quan có độ đặc hiệu giới hạn phát nhỏ nên có ý nghĩa lớn việc xác định có mặt tạp chất nguyên liệu Bảng 4.1 Số liệu kiểm tra phù hợp phương pháp HPLC xác ñịnh tạp chất liên quan định lượng Vinblastin sulfat Tính đặc LOD ðộ tuyến ðộ ðộ xác ðộ Khoảng hiệu (µg/mg) tính xác trung gian (%) xác định (r) (% RSD) (%RSD) (%RSD) TCLQ + 0,67 ðịnh + 100,20,9999 0,4 0,2% lượng 100,8 69 Bảng 4.2 Số liệu kiểm tra phù hợp phương pháp HPLC xác ñịnh tạp chất liên quan ñịnh lượng Vincristin sulfat Tính đặc LOD ðộ tuyến ðộ ðộ xác ðộ Khoảng hiệu (µg/mg) tính (r) xác trung gian xác ñịnh (% RSD) (%RSD) (%RSD) TCLQ + 0,82 ðịnh + 99,9 – 0,9999 0,4% 0,2% lượng 100,6 Bảng 4.3 Các tiêu ñã ñánh giá Vinblastin sulfat Vincristin sulfat ðịnh tính IR x Phản ứng ion x pH x ðộ Mất khối lượng TCLQ ðịnh lượng màu sắc làm khô (HPLC) (HPLC) x x x x Qua kết phân tích sơ nguyên liệu nghiên cứu ñề tài cho thấy hai nguyên liệu có hàm lượng > 99,0%, đáp ứng mục ñích sử dụng ñể thiết lập chất ñối chiếu 4.5 Về thiết lập chất đối chiếu Chất đối chiếu ln bị tác động nhiều yếu tố bên ngồi ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, khơng khí, đặc biệt ñối với hai chất ñối chiếu ñề tài Vinblastin sulfat Vincristin sulfat Sản xuất chất ñối chiếu phải ñược thực ñiều kiện nghiêm ngặt, đóng chuẩn điều kiện khí Nitơ (99,99%), độ ẩm thấp (5 – 10%) bảo quản nhiệt ñộ khơng q -20oC để đảm bảo chất lượng khơng thay ñổi thời gian dài ðánh giá ñồng lơ đóng gói: Qua kết kiểm tra đồng lô sản xuất cho thấy hàm lượng lọ chuẩn ổn ñịnh, RSD hàm lượng 0,6% (Vinblastin sulfat) 0,4%(Vincristin sulfat) (< 1,0%) RSD khối lượng làm khô 1,4% (Vinblastin sulfat) 1,2%(Vincristin sulfat) (< 1,5%), điều chứng tỏ quy trình phân tích, sản xuất, đóng gói bảo quản phù hợp ðánh giá liên phòng thí nghiệm: Hai chất chuẩn đánh giá hai phòng thí nghiệm cho kết 99,86% 99,62% (Vinblastin sulfat); 99,74% 99,48% (Vincristin sulfat) Dựa vào kết xác ñịnh giá trị ấn ñịnh Vinblastin sulfat 86,94% (nguyên trạng) Vincristin sulfat 91,18% (nguyên trạng), ñáp ứng yêu cầu chất ñối chiếu 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu triển khai thực nghiệm, chúng tơi đạt mục tiêu đề tài ñề ra, với kết cụ thể sau: - ðã đưa quy trình tinh chế Vinblastin sulfat Vincristin sulfat Các quy trình chi tiết, rõ ràng, khoa học, sử dụng dung mơi ñộc hại, cho sản phẩm ổn ñịnh số lượng (hiệu suất) chất lượng - Thiết lập ñược giữ liệu chuẩn nhận dạng Vinblastin sulfat Vincristin sulfat đầy đủ, xác, khoa học bao gồm: phổ IR, phổ UV-VIS, phổ MS, phổ NMR - ðã tiến hành ñánh giá phù hợp phương pháp theo hướng dẫn ASEAN ICH, thiết lập chất ñối chiếu theo ñúng quy ñịnh WHO ASEAN Tham khảo tài liệu quốc tế (Dược ñiển Anh 2010, Mỹ 34, Dược ñiển Trung quốc 2010, Châu Âu 2010) Việt Nam, áp dụng thiết bị phân tích ñại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu ñể ñánh giá chất lượng chất ñối chiếu Kết cho thấy hai chất ñối chiếu ñược thiết lập phù hợp với mục đích sử dụng; điều kiện trang thiết bị phương pháp phân tích đảm bảo độ lặp lại độ tái lặp liên phòng thí nghiệm - Tạo hai chất ñối chiếu Vinblastin sulfat Vincristin sulfat danh mục chất ñối chiếu Việt Nam Kết đề tài có giá trị thực tiễn tăng cường quản lý chất lượng nguyên liệu chế phẩm ñược ñịnh ñiều trị ung thư có chứa hai hoạt chất có mặt thị trường dược phẩm Việt nam - Với giá mua chất chuẩn gốc nước ngoài: chuẩn Mỹ 199 USD/lọ, chuẩn Châu Âu 79 ERU/lọ, chuẩn Quốc tế 70 USD/lọ, chuẩn ASEAN 50 USD/lọ, việc sản xuất ñược hai chất chuẩn ñã tiết kiệm tiền ngân sách khơng phải nhập chuẩn gốc 71 KIẾN NGHỊ - Quy trình tinh chế hai chất Vinblastin sulfat Vincristin sulfat ñược tiến hành quy mơ nhỏ cần nghiên cứu thêm ñể tăng hiệu suất tinh chế nhằm thu ñược nguyên liệu tinh khiết có hàm lượng cao tiến hành quy mơ lớn để có ñược nguồn nguyên liệu có nguồn gốc Việt nam giúp cho xí nghiệp dược nước sản xuất ñược thuốc ñiều trị ung thư mà giảm bớt lượng nhập từ nước - Hai chất ñối chiếu ñề tài hai chất dễ hút ẩm, phải bảo quản điều kiện đặc biệt (khơng q -20oC) cần tiếp tục theo dõi độ ổn ñịnh 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2: Phân tích dụng cụ, NXB Y học Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau ñại học, Trường ðại học Dược Hà Nội Bộ môn Dược liệu, trường ðại học Dược Hà Nội (2007), Bài giảng dược liệu tập 1, 2, NXB Y học Bộ y tế (2009), Dược ñiển Việt nam IV, tr 631-634, NXB Y học Phan ðình Châu, Csaba Szántay cộng (1990), “Tổng hợp toàn phần Vinca ancaloid” Nguyễn Minh ðức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, NXB Y học, TP Hồ Chí Minh ðặng Văn Giáp (1997), Phân tích liệu khoa học chương trình MSExcel, NXB giáo dục Trịnh Văn Lẩu, Thái Nguyễn Hùng Thu (2010), “Phương pháp chiết, phân lập, tinh chế, nhận dạng thiết lập chất chuẩn chất ñặc trưng từ dược liệu” Trần Văn Sung (2002), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hóa hữu cơ, NXB ðại học Quốc gia Hà Nội, tập 10 Mai Ngọc Tâm, Bogomil Pyuskyulev cộng (1990), “Xác ñịnh biến ñổi hàm lượng Vindolin, Catharanthin Vinblastin Dừa cạn vào thời kỳ sinh trưởng khác HPLC” 11 Nguyễn Thị Kim Thanh (2010), “Nghiên cứu thiết lập 10 chất chuẩn chiết từ dược liệu” 12 Trường ðại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu Xí nghiệp Dược phẩm Trung Ương II (1990), “Nghiên cứu chiết xuất Vinblastin Ancaloid khác từ Dừa cạn Việt Nam ñể phục vụ sản xuất thuốc chống ung thư thuốc hỗ trợ tuần hoàn não” 13 Viện Hóa học cơng nghiệp Việt Nam (2011), “Nghiên cứu qui trình tổng hợp Vincristin sulfat Vinblastin sulfat từ Vindolin Catharanthin làm thuốc chống ung thư máu” 14 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2006), Thiết lập hiệu chuẩn chất chuẩn, ống chuẩn ñộ, thủ tục VKN/TT/21.20, ban hành lần 15 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), ðảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc 16 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2003), “Hướng dẫn ASEAN ñể thẩm định quy trình phân tích”, trích dẫn theo hướng dẫn ICH (International Conference on Harmonisation) 17 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2008), Thủ tục thẩm định đánh giá phương pháp phân tích dược ñiển tiêu chuẩn sở 18 Vụ khoa học ñào tạo – Bộ y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm Tài liệu tiếng Anh 19 Asean document guidelines (2007), Guidelines for the establishment, handing, storage and use of ASEAN Reference Substances 20 British Pharmacopoeia (2010), volume 2, p 2198 – 2201 21 Christopher M Riley and Thomas W Rosanske (1997), Development and Validation of Analytical method 22 European pharmacopoeia (2010), seventh edition, volume 3, p 3200 – 3202 23 ISO 13528:2005, Statistical method for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons 24 ISO Guide 34: 2000, General requirement for the competence of Reference material producers 25 Leanne Embree, “Validation of a high - performance liquid chromatographic assay method for quantification of total vincristine sulfate in human plasma following administration of vincristine sulfate liposome injection” 26 Maryse Hostettmann Andrew Marston (1997), Preparative chromatography techniques: applications in natural product isolation, Chapman & Hall, London 27 Myron R Karon, A preliminary report on Vincristine sulfate – “A new active agent for the treatment of acute leukemia” 28 Martindale 36th edition, p 786 - 789 29 Oishan Lin and Jinghua Zhu (2011), Determination of Vincristine and Vinblastine in Catharanthus Roses Leaves by Liquid Chromatography Mass Spectrometry 30 OMCL Network of the Council of Europe Quality Assurance Document (2005), Validation of analytical procedures 31 Pharmacopoeia of the people’s republic of China (2010), volume 2, p 1259-1260 32 The International Pharmacopoeia (2006), fourth edition, volume 2, p 937 – 940 33 The Merck Index (Thirteeth Editon), Vinblastin, Vincristin 34 The United States Pharmacopeia 34 (2011) 35 S.K.Volko and E.I Grodnitskaya, Application of high-performance liquid chromatography to the determination of vinblastine in Catharanthus roseus, Elsevier 36 WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements – Part 2: Validation, World Health Organization, Geneva 37 WHO document guidelines (2006), General guidelines for the establishment, maintance and distribution of chemical reference substances ... việc thiết lập hai chất chuẩn trở nên cấp thiết ðề tài Nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn Vincristin sulfat Vinblastin sulfat ñược thực với mục tiêu: - Tinh chế nguyên liệu Vinblastin sulfat. .. dụng có kết hiển thị máy - Lần Việt Nam thực nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn Vinblastin sulfat Vincristin sulfat - Quy trình thiết lập chất đối chiếu xây dựng theo ñúng quy ñịnh WHO... VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ðối tượng nghiên cứu Nguyên liệu Vinblastin sulfat Vincristin sulfat có hàm lượng 95% từ đề tài Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp Vinblastin sulfat Vincristin sulfat