Nghiên cứu tinh chế thiết lập chất chuẩn vinblastin sulfats và vincristin sulfat

Bảng 3.15 Kết quả ñịnh lượng nguyên liệu Vinblastin sulfat 46 Bảng 3.16 ðộ ñồng nhất của mất khối lượng do làm khô Vinblastin sulfat 47 Bảng 3.17 ðộ ñồng nhất hàm lượng Vinblastin sulfat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ðẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ðẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THANH HÀ

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN VINBLASTIN SULFAT

VÀ VINCRISTIN SULFAT

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC – ðỘC CHẤT

MÃ SỐ : 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Tường Vy

2 PGS TS Trịnh Văn Lẩu

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- PGS.TS Trịnh Văn Lẩu – Chủ tịch Hội ñồng Dược ñiển Việt Nam,

nguyên Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

- TS Nguyễn Tường Vy – Phòng Sau ñại học – Trường ðại học Dược

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ñốc, Ths Lê Thị Thu - Phó trưởng Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất ñối chiếu và các bạn ñồng nghiệp Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất ñối chiếu - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện và san sẻ công việc trong thời gian qua ñể tôi hoàn thành tốt khóa học và luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia ñình và bạn bè ñã luôn ñộng viên, quan tâm, chia sẻ và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2012

Ds Mai Thanh Hà

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ơn

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng và các hình

đẶT VẤN đỀẦẦẦ 1

Chương 1 TỔNG QUANẦẦẦ 3

1.1 Tổng quan về ựối tượng nghiên cứuẦẦẦ 3

1.1.1 Vinblastin sulfatẦẦẦ 3

1.1.2 Vincristin sulfatẦẦẦ 4

1.1.3 Các nghiên cứu trên thế giớiẦẦẦ 5

1.1.4 Các nghiên cứu trong nướcẦẦẦ

1.1.5 Tổng quan về phương pháp phân tắch Vinblastin sulfat và Vincristin sulfatẦẦẦ

5 6 1.2 Tổng quan về tinh chếẦẦẦ 8

1.3 Tổng quan một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu ựề tàiẦẦẦ 8

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caoẦẦẦ 8

1.3.2 Phương pháp ựo phổ hồng ngoạiẦẦẦ 9

1.3.3 Phổ tử ngoại khả kiếnẦẦẦ 9

1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhânẦẦẦ 9

1.3.5 Phương pháp phân tắch khối phổẦẦẦ 11

1.3.6 Phương pháp phân tắch nhiệt trọng lượngẦẦẦ 11

1.4 Phương pháp thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 13

1.4.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 13

1.4.2 đánh giá nguyên liệuẦẦẦ 14

1.4.3 Sản xuất chất ựối chiếuẦẦẦ 14

1.4.4 Kiểm tra ựộ ựồng nhất của quá trình ựóng góiẦẦẦ 14

1.4.5 Kiểm tra bán thành phẩmẦẦẦ 14

1.4.6 Lập hồ sơ, chứng chỉ, cấp phátẦẦẦ 14

1.4.7 Kiểm tra ựịnh kỳẦẦẦ 15

1.4.8 Lưu hồ sơẦẦẦ 15

1.5 Tắnh mới, sáng tạo của ựề tàiẦẦẦ 15

Chương 2 đỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUẦ 17

2.1 đối tượng nghiên cứuẦẦẦ 17

2.2 Phương tiện nghiên cứuẦẦẦ 17

2.2.1 Thiết bị, dụng cụẦẦẦ 17

2.2.2 Hóa chất, dung môi, chất ựối chiếuẦẦẦ 17

2.3 Nội dung nghiên cứuẦẦẦ 17

2.3.1 Kiểm tra nguyên liệu trước khi tinh chếẦẦẦ 17

2.3.2 Tinh chếẦẦẦ 18

2.3.3 Xác ựịnh cấu trúc, nhận dạng và ựánh giá nguyên liệu sau khi tinh chếẦẦẦ 18

2.3.4 Thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 18

2.4 Phương pháp nghiên cứuẦẦẦ 18

2.4.1 Phương pháp tinh chế Vinblastin sulfat và Vincristin sulfatẦẦ 18

2.4.2 Xác ựịnh cấu trúc, nhận dạng và ựánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat sau khi tinh chếẦẦẦ 19

2.4.3 Thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 19

2.4.3.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 19

2.4.3.2 đánh giá nguyên liệu theo quy trình ựã xây dựngẦẦẦ 20

2.4.3.3 đóng góiẦẦẦ 20

2.4.3.4 đánh giá ựộ ựồng nhất của quá trình ựóng góiẦẦẦ 20

2.4.3.5 đánh giá liên phòngẦẦẦ 20

2.4.3.6 Phương pháp xử lý số liệuẦẦẦ 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Lựa chọn ựiều kiện phân tắchẦẦẦ 21

3.2 Kiểm tra nguyên liệu trước khi tinh chếẦẦẦ 22

3.3 Quy trình tinh chếẦẦẦ 22

3.3.1 Vinblastin sulfatẦẦẦ 22

3.3.2 Vincristin sulfatẦẦẦ 26

3.4 Xác ựịnh cấu trúc, nhận dạng chất sau khi tinh chếẦẦẦẦ 29

3.4.1 Vinblastin sulfatẦẦẦ 29

3.4.1.1 Tắnh chấtẦẦẦ 29

3.4.1.2 Phổ tử ngoại khả kiếnẦẦẦ 29

3.4.1.3 Phổ hồng ngoạiẦẦẦ 30

3.4.1.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhânẦẦẦ 31

3.4.1.5 Phổ khối lượngẦẦẦ 31

3.4.2 Vincristin sulfatẦẦẦ 32

3.4.2.1 Tắnh chấtẦẦẦ 32

3.4.2.2 Phổ tử ngoại khả kiếnẦẦẦ 32

3.4.2.3 Phổ hồng ngoạiẦẦẦ 32

3.4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhânẦẦẦ 33

3.4.2.5 Phổ khối lượngẦẦẦ 34

3.5 Thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 34

3.5.1 Vinblastin sulfatẦẦẦ 34

3.5.1.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất ựối chiếu Vinblastin sulfat 34 3.5.1.2 đánh giá nguyên liệuẦẦẦ 42

3.5.1.3 đóng góiẦẦẦ 47

3.5.1.4 đánh giá ựồng nhất quá trình ựóng góiẦẦẦ 47

3.5.1.5 So sánh liên phòng thắ nghiệmẦẦẦ 48

3.5.1.6 Xử lý kết quảẦẦẦ 48

3.5.2 Vinblastin sulfatẦẦẦ 51

3.5.2.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất ựối chiếu Vincristin sulfat 51

3.5.2.2 đánh giá nguyên liệuẦẦẦ 59

3.5.2.3 đóng góiẦẦẦ 63

3.5.2.4 đánh giá ựồng nhất quá trình ựóng góiẦẦẦ 64

3.5.2.5 So sánh liên phòng thắ nghiệmẦẦẦ 65

3.5.1.6 Xử lý kết quảẦẦẦ 65

Chương 4 BÀN LUẬNẦẦẦ 68

4.1 Tắnh mới và hiệu quả kinh tếẦẦẦ 68

4.2 Về quy trình tinh chếẦẦẦ 68

4.3 Về xác ựịnh cấu trúc, nhận dạng chất và kiểm tra nguyên liệu sau khi tinh chếẦẦẦ 68

4.4 Về ựánh giá sự phù hợp của phương pháp xác ựịnh tạp chất liên quan và ựịnh lượng 69

4.5 Về thiết lập chất ựối chiếuẦẦẦ 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊẦẦẦ 71

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

: Chemical reference standard Chất ñói chiếu hóa học : Diode array detector : Dược ñiển Việt Nam : Distotionless enhancement by polarization transfer Chuyển ñổi phân cực biến ñổi dạng (phổ)

: ðiều kiện sắc ký : Heteronuclear Multiple Bond Coherence Liên hệ ña lượng tử dị nhân

: Proton nuclear magnetic resonance : High performance liquid chromatoghraphy Sắc ký lỏng hiệu năng cao

: Heteronuclear Singular Quantum Coherence Liên hệ ñơn lượng tử dị nhân

: Infrared Hồng ngoại : International chemical reference standard : Japan chemical reference standard

: Mass spectrometry Phổ khối lượng : Số ñĩa lý thuyết : Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân : Pure analysis

: Phòng thí nghiệm : ðộ phân giải : Relative standard deviation

ðộ lệch chuẩn tương ñối : Diện tích pic

: Sắc ký ñồ : Trung bình : Thermogravimetric analysis Phân tích nhiệt trọng lượng : Khoa Thiết lập chất chuẩn và chất ñối chiếu : Thời gian lưu

: World health organization

Tổ chức y tế thế giới : Ultraviolet - Visible

Tử ngoại - khả kiến

Bảng 3.15 Kết quả ñịnh lượng nguyên liệu Vinblastin sulfat 46 Bảng 3.16 ðộ ñồng nhất của mất khối lượng do làm khô Vinblastin

sulfat

47

Bảng 3.17 ðộ ñồng nhất hàm lượng Vinblastin sulfat 47 Bảng 3.18 Kết quả ñánh giá thành phẩm Vinblastin sulfat 48 Bảng 3.19 Kết quả ñánh giá ANOVA 48 Bảng 3.20 Kết quả xác ñịnh giá trị ấn ñịnh của thành phẩmVinblastin

sulfat

49

Bảng 3.21 Kết quả xác ñịnh giá trị Z 50 Bảng 3.22 Kết quả xác ñịnh giới hạn phát hiện tạp chất liên quan của

Vincristin sulfat

61

Bảng 3.31 Kết quả tạp chất liên quan của nguyên liệu Vincristin sulfat 62 Bảng 3.32 Kết quả ñịnh lượng nguyên liệu Vincristin sulfat 63 Bảng 3.33 ðộ ñồng nhất của mất khối lượng do làm khô Vincristin

sulfat

64

Bảng 3.34 ðộ ñồng nhất hàm lượng Vincristin sulfat 64 Bảng 3.35 Kết quả ñánh giá thành phẩm Vinblastin sulfat 65

Bảng 3.36 Kết quả ñánh giá ANOVA 65 Bảng 3.37 Kết quả xác ñịnh giá trị ấn ñịnh của thành phẩmVincristin

sulfat

66

Bảng 3.38 Kết quả xác ñịnh giá trị Z 67 Bảng 4.1 Số liệu kiểm tra sự phù hợp của phương pháp HPLC xác

ñịnh tạp chất liên quan và ñịnh lượng của Vinblastin sulfat

69

Bảng 4.2 Số liệu kiểm tra sự phù hợp của phương pháp HPLC xác

ñịnh tạp chất liên quan và ñịnh lượng của Vincristin sulfat

70

Bảng 4.3 Các chỉ tiêu ñã ñánh giá Vinblastin sulfat và Vincristin

sulfat

70

H2O2 3%

36

Hình 3.19 Tính ñặc hiệu ñịnh lượng Vinblastin sulfat 38 Hình 3.20 ðồ thị biểu diễn ñộ tuyến tính ñịnh lượng Vinblastin sulfat 39 Hình 3.21 Phổ hồng ngoại của Vinblastin chuẩn 43

Hình 3.22 Phổ hồng ngoại của nguyên liệu Vinblastin sulfat 43 Hình 3.23 ðồ thị mất khối lượng do làm khô của Vinblastin sulfat 44 Hình 3.24 SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vinblastin sulfat 45 Hình 3.25 SKð ñịnh lượng Vinblastin sulfat 46 Hình 3.26 SKð mẫu thử Vincristin sulfat không phân hủy 51 Hình 3.27 SKð mẫu thử Vincristin sulfat ñể ngoài ánh sáng 52 Hình 3.28 SKð mẫu thử Vincristin sulfat phân hủy ở 100oC 52 Hình 3.29 SKð mẫu thử Vincristin sulfat phân hủy trong dung dịch

H2O2 3%

53

Hình 3.30 Tính ñặc hiệu ñịnh lượng Vincristin sulfat 55 Hình 3.31 ðồ thị biểu diễn ñộ tuyến tính ñịnh lượng Vincristin sulfat 56 Hình 3.32 Phổ hồng ngoại của Vincristin chuẩn 59 Hình 3.33 Phổ hồng ngoại của nguyên liệu Vincristin sulfat 60 Hình 3.34 ðồ thị mất khối lượng do làm khô của Vincristin sulfat 61 Hình 3.35 SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vincristin sulfat 62 Hình 3.36 SKð ñịnh lượng Vincristin sulfat 63

ðẶT VẤN ðỀ

ðể ñảm bảo hiệu quả ñiều trị bệnh, thuốc ñòi hỏi phải ñạt chất lượng tốt và ñộ ổn ñịnh cao Muốn như vậy thuốc cần ñược kiểm tra chất lượng từ nguyên liệu ñến thành phẩm thì mới có thể ñạt ñược chất lượng từ khâu sản xuất ñến người sử dụng Một trong những yếu tố góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc ñó là chất chuẩn dùng trong phân tích kiểm nghiệm thuốc Vì vậy, sau khi chiết xuất, tổng hợp hoạt chất ñể làm thuốc thì song song phải nghiên cứu thiết lập chất chuẩn từ hoạt chất ñó

Trong các phác ñồ ñiều trị một số loại ung thư ở các bệnh viện ung bướu hiện nay có mặt hoạt chất là Vincristin sulfat và Vinblastin sulfat Từ thực tế ñó sẽ có rất nhiều nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat cũng như chế phẩm chứa hai hoạt chất này ñược nhập khẩu về Việt Nam hoặc ñược tổng hợp ở Việt nam ñể ñáp ứng nhu cầu sử dụng

Các ñề tài thuộc chương trình “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng ñiểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược ñến năm 2020”, ñã nghiên cứu tổng hợp hoặc chiết xuất ñược 28 hoạt chất trong ñó có Vincistin sulfat và Vinblastin sulfat Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có chất chuẩn Vincristin sulfat và Vinblastin sulfat phục vụ cho kiểm tra chất lượng các sản phẩm của ñề tài cũng như ñánh giá chất lượng chế phẩm trên thị trường Trong khi ñó nếu mua chất chuẩn từ nước ngoài gặp rất nhiều khó khăn do giá rất cao và thủ tục hải quan phức tạp

Thêm vào ñó, Dược ñiển Việt Nam IV và các Dược ñiển nước ngoài (Dược ñiển Anh, Mỹ, Châu Âu, Quốc tế, Trung Quốc) ñã có chuyên luận về Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat, ñều áp dụng các phương pháp phân tích sử dụng các thiết bị hiện ñại yêu cầu phải có chất ñối chiếu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

Xuất phát từ các lý do trên và nhằm chủ ñộng cho việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu và chế phẩm Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat của ñề tài, tiết kiệm ngoại tệ nên việc thiết lập hai chất chuẩn này trở nên cấp thiết

ðề tài “Nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn Vincristin sulfat và

Vinblastin sulfat” ñược thực hiện với 2 mục tiêu:

- Tinh chế nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat ñạt tiêu chuẩn ñể làm chất chuẩn

- Thiết lập chất chuẩn Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat phục vụ công tác kiểm nghiệm

Với mong muốn, ñề tài hoàn thành sẽ góp thêm vào danh mục chất ñối chiếu của Việt Nam và ñảm bảo ñược chất lượng nguyên liệu, chế phẩm thuốc Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat ñiều trị ung thư trên thị trường dược phẩm

(3aR,4R,5S,5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9-carboxylate sulphate

Vinblastin sulfat có cấu trúc hóa học như sau:

Vinblastin sulfat là một alkaloid ñược chiết xuất, phân lập từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocyaceae), có tác dụng chống ung thư

Vinblastin sulfat có nhiệt ñộ nóng chảy 284 - 2850C, góc quay cực [α]26D = - 280 (trong methanol) [30]

Vinblastin sulfat thường ñược bào chế dưới dạng thuốc tiêm hàm lượng 10 mg/ml Vinblastin là thuốc ñược lựa chọn ñể ñiều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, rau thai, ung thư biểu mô tế bào có vảy ở ñầu và cổ, ung thư cổ và ung thư biểu mô tế bào thận, ung thư vú Các nghiên cứu cho thấy Vinblastin gây ñộc tế bào bằng cách

ức chế sự tạo thành các vi ống trên thời gián phân dẫn tới ngừng phân chia tế bào

ở pha giữa Ở nồng ñộ cao Vinblastin còn thể hiện nhiều tác dụng phức tạp trên tổng hợp acid nucleic và protein Vinblastin hấp thu và phân bố nhanh vào các

mô của cơ thể, thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 75%, ít qua hàng rào máu não và không ñạt nồng ñộ ñiều trị trong dịch não tủy Vinblastin chuyển hóa chủ yếu ở gan thành Deacetyl Vinblastin là chất có hoạt tính mạnh hơn Thuốc ñược thải trừ qua mật và nước tiểu, một số ñào thải dưới dạng không biến ñổi

Methyl(3aR,4R,5S,5aR,10bR,13aR)-4-(acetyloxy)-3a-ethyl-9-carboxylate sulphate

Vincristin sulfat có cấu trúc hóa học như sau:

Vincristin sulfat là một alkaloid ñược chiết xuất, phân lập từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus Apocyaceae), có tác dụng chống ung thư

Vincristin sulfat có nhiệt ñộ nóng chảy ở 2730 – 2810C, góc quay cực [α]26D = +8,50, phổ tử ngoại khả kiến cho hấp thụ cực ñại ở λmax = 218, 252, 285, 293 nm trong methanol

Cũng giống như Vinblastin sulfat, Vincristin sulfat thường ñược bào chế dưới dạng thuốc tiêm hàm lượng 0,5 – 1,0 mg/ml, lọ 1mg, 2 mg, 5 mg bột ñông khô Vincristin ñược chỉ ñịnh ñiều trị các bệnh leukemia, bệnh Hodgkin, u lympho, sarcom cơ vân, u sùi dạng nấm, ung thư vú, ung thư tử cung và một số bệnh ung thư khác Vincristin là chất ức chế mạnh tế bào, liên kết ñặc hiệu với tubulin là protein ống vi thể, phong bế sự tạo thành các thoi phân bào cần thiết cho sự phân

chia tế bào ở kỳ giữa Ở nồng độ cao thuốc diệt được tế bào, nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào Vincristin hấp thu kém qua đường tiêu hĩa, sau khi tiêm tĩnh mạch thuốc được phân bố khắp cơ thể trừ dịch não tủy Vincristin bị chuyển hĩa ở gan, thải trừ qua mật 40 -70% và 10% qua nước tiểu

1.1.3 Các nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, đi tiên phong và thành cơng trong việc triển khai sản xuất thuốc chống ung thư từ các ancaloid Dừa cạn và phải kể đến các cơng ty như:

- Cơng ty Eli Lilly - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VELBAN® cĩ hoạt chất chính

là Vinblastin sunfat chỉ định điều trị các bệnh Hodgkin, ung thư máu, ung thư biểu mơ tinh hồn, u Kaposi, ung thư dạ con

- Cơng ty Pharmacia Corporation Kalamazoo - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VINCASAR PSF cĩ hoạt chất chính là Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat được chỉ định đặc hiệu điều trị bệnh bạch cầu ác tính

Ngày nay các quốc gia và vùng lãnh thổ cĩ thể trồng được Dừa cạn đều đã chủ động nghiên cứu và triển khai sản xuất Vinblastin và các dẫn xuất như Trung Quốc, Ấn ðộ, Pakistan, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước Trung Á, Bắc Phi,

Cĩ thể nêu một vài con số theo thống kê năm 2002 của FAO làm ví dụ: Madagasca xuất khẩu 1000 tấn (khơ) lá và hoa Dừa cạn hàng năm; Ở Hungari, năng suất lá và hoa Dừa cạn đạt tới 1,5 - 2 tấn lá khơ/ha/năm; Ở Ấn ðộ, riêng tập đồn Cipla hàng năm sản xuất khoảng 15 - 25 kg Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

Do độc tính cao, nên Vincristin được sử dụng trong điều trị ung thư máu ít hơn

so với Vinblastin, vậy mà ở khu vực Bắc Mỹ và châu Âu, chỉ tính riêng lượng tiêu thụ Vincristin sulfat đã đạt tới 40 triệu USD hàng năm

1.1.4 Các nghiên cứu trong nước

- Nhĩm tác giả thuộc Viện Hĩa học cơng nghiệp Việt Nam - Tổng cơng ty Hĩa chất Việt nam đang thực hiện đề tài thuộc chương trình khoa học cơng nghệ quốc gia về hĩa dược (2009 - 2011) “Nghiên cứu qui trình tổng hợp Vincristin sulfat và Vinblastin sulfat từ Vindolin và Catharanthin làm thuốc chống ung thư máu” [13]

- Từ những năm 1980 - 1990, Trường đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu và

Xắ nghiệp Dược phẩm Trung Ương II ựã thực hiện các ựề tài nghiên cứu chiết xuất Vinblastin và các Ancaloid khác từ Dừa cạn Việt Nam ựể phục vụ sản xuất thuốc chống ung thư và thuốc hỗ trợ tuần hoàn não Các tác giả ựã nghiên cứu chiết ancaloid mô phỏng theo các quy trình của Noble và Svoboda [12]

- Trong nỗ lực tổng hợp toàn phần các Vinca ancaloid, năm 1990, các tác giả

Phan đình Châu (đại học Dược Hà Nội), Csaba Szántay (đại học kỹ thuật Budapest - Hungary) và các cộng sự ựã ựiều chế thành công các dẫn xuất

Vinca ancaloid monomeric như vincadifformin, (+/-)-3-oxominovine và

tabersonin Tuy nhiên, ngoài tabersonin thể hiện hoạt tắnh làm giảm nhẹ huyết

áp (khoảng 25 % khi so sánh với reserpin), các chất này ựều chưa tìm ựược ứng dụng trong ựiều trị lâm sàng [5]

- Cũng trong những năm 1990, các tác giả Mai Ngọc Tâm (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Bogomil Pyuskyulev (Viện Hàn lâm khoa học Bungari)

và các cộng sự ựã sử dụng HPLC phân tắch xác ựịnh sự biến ựổi hàm lượng vindolin, catharanthin và vinblastin trong lá Dừa cạn vào các thời kỳ sinh trưởng khác nhau đóng góp vào các hiểu biết về bán tổng hợp, chuyển hóa và

cấu trúc của các Vinca ancaloid kiểu Vinblastin, tác giả Mai Ngọc Tâm cùng

các cộng sự cũng ựã thực hiện những biến cải hóa học ở các vị trắ C-16, C-17

và C-20Ỗ của vinblastin tạo ra dẫn xuất mới 15(16)vinblastin và dẫn xuất tri-O-axetylguanosin ở C-17 của hợp chất này [10]

-17-deaxetoxy-20Ỗ-deoxy Cho tới nay, việc tiếp thu các kỹ thuật phân lập hiện ựại và nghiên cứu hoàn

thiện công nghệ ựiều chế Vinblastin từ Dừa cạn Vinca rosea L ở Việt Nam

còn chưa ựược quan tâm ựúng mức và chưa ựược tổ chức triển khai nghiêm túc Với một nguồn nguyên liệu Dừa cạn ựạt vượt tiêu chuẩn của châu Âu ựã ựược tổ chức canh tác rất quy mô, sản lượng xuất khẩu sang thị trường Pháp và châu Âu ựạt hàng trăm tấn một năm, mà chúng ta vẫn phải nhập khẩu Vinblastin sulfat

1.1.5 Tổng quan về phương pháp phân tắch Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat [4,29,31]

- Hiện nay các dược ựiển (DđVN, Mỹ, Anh, Trung Quốc, Quốc tế, Châu Âu) ựều ựưa ra chuyên luận Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat Một trong những

phương pháp ñược sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp HPLC-DAD ðây là kỹ thuật phân tích cho phép phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat chính xác, lượng mẫu phân tích không cần nhiều và ñặc biệt có thể áp dụng ở hầu hết các phòng thí nghiệm

- Sau ñây là một số chương trình sắc ký phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat ñã có trong một số Dược ñiển:

Bảng 1.1 Chương trình sắc ký phân tích Vinblastin sulfat của một số dược ñiển

-

Dược ñiển

Cột sắc ký C18 150x4,6 mm,5µm C8 250x4,6 mm,5µm C8 250x4,6 mm,5µm Pha ñộng PðA: 14ml diethylamin +

986ml nước (pH 7,5): 38

PðB: (Acetonitril –

Methanol = 20 – 80): 62

Dung dịch diethylamin 1,5% (pH 7,5) : 38 Acetonitril : 12 Methanol : 50

Dung dịch diethylamin 1,5% (pH 7,5) : 38 Methanol : 50 Acetonitril : 12 Tốc ñộ dòng

ml nước (pH 7,5) : 30 Methanol : 70

Dung dịch diethylamin 1,5% (pH 7,5) : 30 Methanol : 70

Dung dịch diethylamin 1,5% (pH 7,5) : 30 Methanol : 70 Tốc ñộ dòng

1.3 Tổng quan một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu ñề tài

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1,4,6,8]

HPLC là một kỹ thuật tách trong ñó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác ñộng của pha ñộng lỏng Quá trình sắc ký lỏng dựa trên

cơ chế hấp phụ, phân bố, trao ñổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detetor thích hợp Hiện nay có nhiều loại detector như: UV-VIS, huỳnh quang, tán xạ bay hơi, ñộ dẫn, MS, nhưng sử dụng nhiều nhất vẫn là detector UV-VIS Ứng dụng:

• ðịnh tính

Trên các máy HPLC hiện ñại với DAD (diod array detector) ta có thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ lên nhau và ñánh giá tương ñồng thông qua hệ số Match

Với detector khối phổ, nhờ thư viện phổ mà không cần chất chuẩn cũng có thể ñịnh tính nếu như chất thử có mặt trong thư viện phổ này

1.3.2 Phương pháp ño phổ hồng ngoại (IR) [1,2,4,8]

1.3.2.1 Nguyên tắc

Phổ hồng ngoại ño sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó ñi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau Xác ñịnh sự có mặt của các nhóm chức trong phân tử dựa vào phổ IR ñể ñịnh tính các chất Trong kiểm nghiệm thuốc hầu hết các dược ñiển chủ yếu sử dụng IR vào việc ñịnh tính, ít ñược dùng trong ñịnh lượng

1.3.2.2 Ứng dụng phổ hồng ngoại trong ñịnh tính

- ðịnh tính sử dụng chất chuẩn:

Chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh và mẫu thử rồi ño phổ của chúng từ 4000 ñến 670

cm-1 trong cùng ñiều kiện

Cực ñại hấp thụ ở phổ của mẫu thử phải tương ứng với phổ của chất chuẩn về vị trí và trị số

- ðịnh tính dùng phổ chuẩn trong atlas hoặc thư viện phổ:

ðể có thể so sánh phổ của chất thử với phổ chuẩn tra cứu trong atlas hoặc thư viện phổ thì ta phải chuẩn hóa máy quang phổ Tất cả các dược ñiển ñều chuẩn hóa 2 thông số cơ bản của máy là ñộ phân giải và thang số sóng

1.3.3 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) [1,2,4,8]

- Các hợp chất hóa học có ñặc trưng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại khả kiến Phổ hấp thụ của các chất khác nhau ñặc trưng riêng cho chất ñó Trên mỗi phổ có các cực trị hấp thụ khác nhau (λmax, λmin)

- Ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc:

+ ðịnh tính và thử tinh khiết

+ ðịnh lượng: phương pháp ño phổ trực tiếp, gián tiếp, phương pháp so sánh, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp ñường chuẩn, phương pháp thêm ñường chuẩn, phương pháp ñịnh lượng hỗn hợp, phương pháp phổ ñạo hàm

1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR ) [2,8]

ðây là phương pháp phổ hiện ñại và ñược dùng nhiều trong xác ñịnh cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều có thể xác ñịnh chính xác cấu trúc của hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của phương pháp

phổ NMR là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H,

13

C) dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau ñược biểu diễn bằng ñộ dịch chuyển hóa học Ngoài ra ñặc trưng của phân tử còn ñược xác ñịnh dựa vào các tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau

1.3.4.1 Các ñại lượng ñặc trưng

- ðộ dịch chuyển hóa học δ: là sự khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn

- Sự tương tác spin - spin: sự tương tác từ của các nhóm proton khác nhau cho biết:

+ Số lượng H ở nguyên tử C bên cạnh

+ Mối tương quan lập thể của các nguyên tử H với nhau

1.3.4.2 Ứng dụng:

- Phổ proton (1H-NMR): xác ñịnh sự có mặt của các nhóm có proton, bộ khung của hợp chất, số lượng proton ở C láng giềng, số lượng tương ñối của proton cho tín hiệu cộng hưởng, phân biệt các dạng ñồng phân, tính ñồng nhất và sự có mặt của tạp chất

- Phổ carbon, 13C-NMR: cho tín hiệu của vạch phổ carbon, mỗi nguyên tử carbon

sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau

- Phổ chuyển ñổi phân cực biến dạng (DEPT): phổ này cho những tín hiệu phổ phân loại các loại carbon khác nhau Trên phổ DEPT 135o, tín hiệu của carbon bậc 4 biến mất, tín hiệu phổ carbon bậc 3 và carbon bậc 1 nằm về một phía còn carbon bậc 3 nằm về phía ñối diện Còn trên phổ DEPT 90o thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của carbon bậc 3

- Phổ cộng hưởng từ hai chiều (2D-NMR):

+ Phổ liên hệ dịch chuyển hóa học (1H-1H COSY): biểu diễn tương tác H-H chủ yếu của các proton ñính với carbon liền kề nhau Phổ này nối ghép các phần của phân tử lại với nhau

+ Phổ liên hệ ña liên kết dị nhân (HMBC): biểu diễn các tương tác xa của carbon và H trong phân tử Phổ này cho phép xác ñịnh cấu trúc từng phần cũng như toàn bộ phân tử chất

- Phổ liên hệ ñơn lượng tử dị nhân (HSQC): tương tác trực tiếp C-H ñược xác ñịnh nhờ vào các pic giao nhau trên phổ HSQC Trên phổ này, một trục là phổ

1

H-NMR còn trục kia là 13C-NMR

1.3.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) [1,2,8]

Khối phổ là một kỹ thuật ño trực tiếp tỷ số khối lượng và ñiện tích của ion (m/z) ñược tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

1.3.5.2 Ứng dụng:

- Xác ñịnh ñồng vị: các nguyên tử ñồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số ñiện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác nhau Có thể dùng MS ñể xác ñịnh thành phần ñồng vị của các nguyên tố trong mẫu

- ðịnh tính: phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng của các phân

tử M+, (M+1)+, (M+2)+ Bên cạnh ñó xem xét thêm các pic ñồng vị, tỷ số cường ñộ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác ñịnh ñược công thức của chất phân tích Trong ngành dược thường sử dụng GC-MS, LC-MS so sánh với thư viện phổ hoặc phổ chất ñối chiếu ñể ñịnh tính mẫu

- Xác ñịnh công thức cấu tạo: dùng kỹ thuật ion hóa thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion ñể làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên kết hợp với phổ NMR và IR

- ðịnh lượng: thường dùng kết nối LC-MS hoặc GC-MS, CE-MS ñể tăng tính chọn lọc, giới hạn ñịnh lượng cho phương pháp phân tích ðiểm nổi bật của phân tích khối phổ là tính chọn lọc và ñộ nhạy Nên thường dùng kỹ thuật này

ñể phân tích hàm lượng vết trong mẫu phức tạp

1.3.6 Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) [20,34]

- Phân tích nhiệt là phương pháp phân tích mà trong ñó các tính chất vật lý, hóa học của mẫu ño một cách liên tục như là những hàm của nhiệt ñộ (nhiệt ñộ ñược

thay ñổi có quy luật) Trên cơ sở lý thuyết về nhiệt ñộng học, từ sự thay ñổi các tính chất ñó ta có thể xác ñịnh ñược các thông số yêu cầu của việc phân tích Các tính chất ñược xác ñịnh như: nhiệt ñộ chuyển pha, khối lượng mất ñi, biến ñổi về kích thước:

- Cơ sở vật lý của phương pháp:

Kỹ thuật phân tích nhiệt dựa trên nguyên lý về nhiệt ñộng học Khi có ñộ chênh lệch về ñộ lớn, nhiệt ñộ sẽ chuyển từ nơi này sang nơi khác và làm cho các ñại lượng vật lý khác như năng lượng chuyển pha, ñộ nhớt, entropy…cũng thay ñổi Thường khảo sát mối quan hệ giữa nhiệt ñộ và nhiệt lượng: ∆T = ∆Q/mC

(C là nhiệt dung phụ thuộc vào bản chất khối vật liệu)

Entropy là một ñại lượng gắn bó chặt chẽ với năng lượng và nhiệt ñộ của hệ trong các quá trình thay ñổi trạng thái

Vật chất thường tồn tại ở 3 dạng: rắn, lỏng khí Trong ñó hiện tượng chuyển pha

là hiện tượng rất quan trọng

- Cơ sở và tính năng của phương pháp

Phương pháp này dựa trên cơ sở xác ñịnh khối lượng của mẫu vật chất mất ñi hay thu vào trong quá trình chuyển pha như một hàm của nhiệt ñộ TGA cho ta xác ñịnh khối lượng chất bị mất ñi trong quá trình chuyển pha ðường phổ TGA ñặc trưng cho một hợp chất hoặc một hệ do thứ tự của các phản ứng hóa học xuất hiện tại một khoảng nhiệt ñộ xác ñịnh là một hàm của cấu trúc phân tử Các ñường dữ liệu liên quan tới nhiệt ñộng học và ñộng năng của dạng phản ứng hóa học, cơ chế phản ứng

Các thông tin ta nhận ñược dùng ñể xác ñịnh thành phần khối lượng các chất có trong mẫu Ngoài ra ta xác ñịnh ñược thành phần dung môi, tá dược…

- Thiết bị: Hệ ño TGA có cấu tạo gồm:

+ Giá giữ mẫu

+ Lò nhiệt

+ Thiết bị ñiều khiển nhiệt ñộ

+ Sensor khối lượng

+ Hệ ghi kết quả ño

Mẫu ñược cân liên tục và nung nóng ñến nhiệt ñộ bay hơi Mẫu ñược ñặt trên ñĩa

và gắn với bộ cân bằng ghi tự ñộng, bộ cảm biến tự ñộng chọn ñiểm cân bằng

Bộ biến năng là các tế bào quang ñiện, khi vị trí cân bằng ban ñầu ñược thiết lập

sự thay ñổi khối lượng của mẫu sẽ ñược làm cân bằng Nhiệt ñộ của lò ñược thay ñổi liên tục và ñiều khiển bởi cặp nhiệt Khối lượng thay ñổi ñược ño so với tín hiệu vào ban ñầu

Sơ ñồ cấu tạo của thiết bị TGA như sau:

- Hoạt ñộng và phân tích kết quả:

Ban ñầu cân ở vị trí cân bằng Thiết bị ñiều khiển làm tăng nhiệt ñộ, trong quá trình ñó các quá trình lý, hóa xảy ra làm thay ñổi khối lượng mẫu nhờ ñó các sensor khối lượng chuyển tín hiệu về máy tính và chuyển ñổi thành phần trăm khối lượng của mẫu bị mất ñi

1.4 Phương pháp thiết lập chất ñối chiếu [11,14,37]

1.4.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất ñối chiếu

Tham khảo các dược ñiển, áp dụng các phương pháp ñịnh lượng ñể ñánh giá ñúng chất lượng nguyên liệu dự kiến thiết lập chất ñối chiếu Sau ñó lựa chọn phương pháp ñịnh lượng ñáp ứng mục ñích sử dụng ñể tiến hành ñánh giá chất lượng thành phẩm Các phương pháp trong quy trình phải là các phương pháp phân tích chính thức trong dược ñiển Trong trường hợp phải thay ñổi một số ñiều kiện sắc ký khác với tỉ lệ cho phép thì phải tiến hành thẩm ñịnh phương pháp

1.4.2 đánh giá nguyên liệu:

- Lấy một lượng nguyên liệu (ở ựiều kiện nhiệt ựộ 22 - 25oC và ựộ ẩm tương ựối

40 - 50%) ựủ ựể ựánh giá các tiêu chuẩn theo quy trình thiết lập chất ựối chiếu

- đánh giá nguyên liệu theo quy trình thiết lập chất ựối chiếu

- Nguyên liệu dùng ựể sản xuất chất ựối chiếu phải ựạt các tiêu chuẩn quy ựịnh trong quy trình thiết lập chất ựối chiếu

- Kết quả phân tắch nguyên liệu ựược lưu trong hồ sơ kiểm nghiệm

1.4.3 Sản xuất chất ựối chiếu:

- Chuẩn bị buồng ựóng: nhiệt ựộ khoảng 25oC, ựộ ẩm 5 Ờ 10%

- Chuẩn bị lọ trước khi ựóng: ựánh số thứ tự lọ, ựể lọ ổn ựịnh trong buồng ựóng

- đóng lọ

1.4.4 Kiểm tra ựộ ựồng nhất của quá trình ựóng gói

- Lấy mẫu: số lượng lọ lấy ựể ựánh giá ắt nhất là n+ 1

(n : số lượng lọ ựóng ựược)

- Kiểm tra ựộ ựồng nhất của quá trình ựóng gói :

+ độ ẩm của từng lọ: mất khối lượng do làm khô hoặc hàm lượng nước + Hàm lượng của hoạt chất trong từng lọ (sử dụng phương pháp phân tắch trong quy trình thiết lập chất ựối chiếu ựã xây dựng)

- đánh giá kết quả:

RSD giữa các lọ ≤ 1,0%: ựiều kiện ựóng gói ổn ựịnh, lô sản xuất ựồng nhất RSD giữa các lọ > 1,0%: tiến hành lấy mẫu lại ựể kiểm tra

1.4.5 Kiểm tra bán thành phẩm

- Chuẩn bị mẫu: Mẫu 1: PTN 1 kiểm tra chỉ tiêu ựộ ẩm và ựịnh lượng

Mẫu 2: PTN 2 kiểm tra chỉ tiêu ựịnh lượng

1.4.6 Lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn, bảo quản và cấp phát

1.4.7 Kiểm tra ñịnh kỳ

- Kiểm nghiệm viên thực hiện: người không tham gia vào quá trình thiết lập ban ñầu

- Kiểm tra ñịnh kỳ: 2 chỉ tiêu tạp chất liên quan và ñịnh lượng

- Thời gian kiểm tra:

Lần 1: 12 tháng (từ thời gian công bố trên chứng chỉ)

Hàm lượng (theo nguyên trạng): chênh lệch ≤ ± 1,0% so với chứng chỉ Tạp chất liên quan: chênh lệch ≤ ± 1,5 lần so với chứng chỉ

Lần 2: 24 tháng tính từ thời gian kiểm tra ñịnh kỳ lần 1 và kết quả kiểm tra ñịnh kỳ lần 1 ñạt quy ñịnh

Lần 3 và các lần tiếp theo: 36 tháng tính từ thời gian kiểm tra ñịnh kỳ

trước ñó và kết quả kiểm tra ñịnh kỳ trước ñó ñạt quy ñịnh

Nếu sau 12, 24 hoặc 36 tháng kết quả của hàm lượng hoặc tạp chất liên quan khác với quy ñịnh thì kiểm tra lại chỉ tiêu ñó ñổi tay kiểm nghiệm viên

- Nếu kết quả không khác kiểm nghiệm viên trước thì làm lại chứng chỉ hoặc hủy

- Nếu kết quả khác với kiểm nghiệm viên trước thì ñổi tay kiểm nghiệm viên thứ

3 và phụ trách Khoa TLCC & CðC lập báo cáo và trình lãnh ñạo Viện xem xét

1.4.8 Lưu hồ sơ: lưu hồ sơ trong file hồ sơ TT/HS/CC và ñược lưu theo thủ tục

kiểm soát hồ sơ VKN/TT/14.09

1.8 Tính mới, sáng tạo của ñề tài

- Sử dụng kỹ thuật mới trong xác ñịnh mất khối lượng do làm khô bằng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng Phương pháp này có ưu ñiểm hơn so với phương pháp sấy chân không: ñộ chính xác cao, thời gian phân tích mẫu ngắn, lượng mẫu sử dụng ít và có kết quả hiển thị trên máy

- Lần ñầu tiên ở Việt Nam thực hiện nghiên cứu tinh chế, thiết lập chất chuẩn Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

- Quy trình thiết lập chất ñối chiếu ñược xây dựng theo ñúng quy ñịnh của WHO

và ASEAN

- Các kỹ thuật phân tích ñều ñược kiểm tra sự phù hợp của phương pháp theo ñúng quy, các thiết bị phân tích sử dụng ñều ñược hiệu chuẩn theo quy ñịnh của ISO-IEC 17025 nhằm thu ñược kết quả có ñộ chính xác và ñộ tin cậy cao

- Chất chuẩn ñược ñóng trong Glovebox có chứa khí Nitơ khô (99,99%), sử dụng lọ thủy tinh nâu tránh ánh sáng, nắp lọ có tấm ñệm teflon tránh hút ẩm bên ngoài ñảm bảo chất lượng của chất chuẩn từ khâu bảo quản ñến sử dụng

- Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat là thuốc ñiều trị ung thư ñang rất ñược quan tâm trên thế giới cũng như ở Việt Nam Thiết lập thành công hai chất chuẩn Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat có ý nghĩa trong công tác kiểm tra

và giám sát chất lượng thuốc

- Các ñơn vị kiểm nghiệm và sản xuất trong cả nước có thể sử dụng chất chuẩn nghiên cứu trong ñề tài ñể kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm ñược sản xuất và lưu hành trên thị trường Chất chuẩn sản xuất ñược từ kết quả ñề tài

sẽ có giá rẻ hơn rất nhiều so với chất chuẩn mua từ nước ngoài Vì vậy, các ñơn vị kiểm nghiệm và sản xuất ñã tiết kiệm ñược thời gian và tài chính dành cho việc mua chuẩn từ nước ngoài

CHƯƠNG 2 ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat có hàm lượng trên 95% từ ñề tài “Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat từ Vindolin và Caranthin làm thuốc chống ung thư”

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương (ñã ñược hiệu chuẩn):

- Cân phân tích: Mettler toledo MS105

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Agilent 1100 và Shimadzu 20A

- Máy sắc ký lỏng cao áp ñiều chế labomatic HD3000

- Cột: C18 Gemini 150 x 4,6 mm, 5µm và C18e Purospher star 150 x 4,6 mm, 5µm C8 Luna 250 x 4,6 mm, 5µm và C8 Lichrospher 250 x 4,6 mm, 5µm C18 500 x 60 mm, 15 - 25 µm

- Máy ño phổ IR: 670-FTIR NICOLET-NEXUS

- Máy ño phổ khối ESI-MS: THERMO-FINNIGAN LCQ ADVANTAGE MAX

- Máy cộng hưởng từ: BRUKER AVANCE AM500FT-NMR

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến: Hitachi U-3900H

- Máy phân tích nhiệt trọng lượng: TGA – Mettler toledo

- Các dụng cụ thủy tinh class A cần thiết cho quá trình thực nghiệm

2.2.2 Hóa chất, dung môi, chất chuẩn

- Chất chuẩn:

Vinblastin sulfat, chuẩn theo Dược ñiển Nhật Bản (JCRS), Lot VB9501, hàm lượng 100% (khan), 11,4% (ẩm), 50mg/lọ

Vincristin sulfat, chuẩn theo Dược ñiển Quốc tế (ICRS), Lot 193181, 9,3 mg/lọ

- Các dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu ñề tài ñạt ñộ tinh khiết phân tích

(PA) và tinh khiết sắc ký (dùng cho HPLC)

Loại tinh khiết phân tích: Diethylamin, acid phosphoric, nước RO…

Loại tinh khiết sắc ký: Acetonitril, Methanol (Merck)

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Kiểm tra nguyên liệu trước khi tinh chế

- Tạp chất liên quan

% từng tạp = Stừng tạp / (∑Scác tạp + 25 x Spic của dung dịch so sánh 4%)

% tổng các tạp = Stổng các tạp / (∑Scác tạp + 25 x Spic của dung dịch so sánh 4%)

- định lượng (kèm phổ DAD): tiến hành song song với chuẩn

2.3.2 Tinh chế

- Tinh chế Vinblastin sulfat

- Tinh chế Vincristin sulfat

2.3.3 Xác ựịnh cấu trúc, nhận dạng và ựánh giá nguyên liệu sau khi tinh chế

- Xác ựịnh cấu trúc của Vinblastin sulafat và Vincristin sulfat sau khi tinh chế

- Chỉ tiêu ựánh giá của Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat tinh chế ựược: + Mất khối lượng do làm khô

+ Tạp chất liên quan

+ định lượng (phổ DAD)

2.3.4 Thiết lập chất ựối chiếu

- Xây dựng quy trình thiết lập chất ựối chiếu

+ Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp HPLC: Xác ựịnh tạp chất liên quan và ựịnh lượng

+ Xây dựng quy trình thiết lập chất ựối chiếu

- đánh giá nguyên liệu

- Sản xuất chất ựối chiếu

- Kiểm tra ựộ ựồng nhất của quá trình ựóng gói

- Kiểm tra bán thành phẩm

- Lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn, bảo quản và cấp phát

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tinh chế Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

Ớ Tinh chế:

Do tắnh chất tan tốt trong nước và các alcol của các muối sulfat các Vinca alcaloid, áp dụng phương pháp sắc ký phân bố pha ựảo ựể tách tinh chế Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat từ hỗn hợp sản phẩm phản ứng hoặc từ sản phẩm nguyên liệu thô, trong ựó chất mang pha tĩnh phổ biến nhất hay ựược sử dụng là octadecyl silica gel (C18) Trong ựề tài này, chúng tôi khảo sát tinh chế Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat trên cột sắc ký Silica gel C18

- Cột tách: ID 60 × L 500 mm, pha tĩnh LichroPrep C18 cỡ hạt 15 - 25 µm

- Mẫu khảo sát: 5 g hỗn hợp muối sulfat của Vinblastin sulfat hoặc Vincristin sulfat trong 25 ml hỗn hợp methanol - nước (1-1)

- Phát hiện: Detector UV 262 nm (Vinblastin sulfat), 297 nm (Vincristin sulfat)

- Pha ñộng: Methanol - Nước - Acid sulfuric 0,05 % rửa giải theo gradient từ 10% - 100% thể tích methanol

- Khảo sát tốc ñộ dòng: 15 ml/phút, 25 ml/phút, 45 ml/phút và 60 ml/phút

• Kết tinh:

Các phân ñoạn sắc ký chứa Vinblastin sulfat hoặc Vincristin sulfat ñược gộp lại, cô kiệt dung môi, sấy dưới áp suất giảm <150 mbar ở nhiệt ñộ 40 – 50oC và thu ñược sản phẩm dạng cao Hòa tan sản phẩm trong ethanol khan, acid hóa ñến pH 4 bằng dung dịch acid sulfuric 1% trong ethanol (lắc nhẹ bình ñựng dung dịch trong quá trình acid hóa) ðể lắng trong 24 giờ ở nhiệt ñộ phòng Lọc hút chân không ñể thu kết tủa Hòa kết tủa tan hoàn toàn trong methanol, bổ sung tiếp ethanol khan, lắc nhẹ ðể yên hỗn hợp 3 giờ ở nhiệt ñộ phòng Sau ñó lọc hút chân không và thu ñược Vinblastin sulfat hoặc Vincristin sulfat

2.4.2 Xác ñịnh cấu trúc, nhận dạng và ñánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat

và Vincristin sulfat tinh chế ñược

- Xác ñịnh cấu trúc và nhận dạng hoạt chất sau khi tinh chế: IR, NMR, LC-MS, UV-VIS

- Chỉ tiêu ñánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat sau khi tinh chế: mất khối lượng do làm khô, tạp chất liên quan, ñịnh lượng (phổ DAD)

2.4.3 Thiết lập chất ñối chiếu

2.4.3.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất ñối chiếu

- Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp HPLC:

Phương pháp phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat ñã có trong USP 34, tuy nhiên theo quy ñịnh về thiết lập chất ñối chiếu thì phương pháp áp dụng phải ñược kiểm tra sự phù hợp Vì vậy, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự phù hợp của phương pháp theo ñiều kiện sắc ký ñã lựa chọn

+ Xác ñịnh tạp chất liên quan của Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat:

Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp: ñộ ñặc hiệu và giới hạn phát hiện

+ ðịnh lượng Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của phương pháp: ựộ ựặc hiệu, ựộ ựúng, ựộ tuyến tắnh, khoảng xác ựịnh, ựộ lặp lại và ựộ chắnh xác trung gian

- Xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn

- đánh giá sơ bộ nguyên liệu theo quy trình ựã xây dựng

2.4.3.2 đánh giá nguyên liệu theo quy trình thiết lập chất chuẩn

- Nạp khắ nitơ 99,99%, ựộ ẩm tương ựối 5 - 10%

- Sử dụng lọ thủy tinh nâu, nút xoáy có ựệm teflon

- đánh số thứ tự lọ, ựóng 30 mg/lọ x 90 lọ

2.4.3.4 đánh giá ựộ ựồng nhất của quá trình ựóng gói

Lấy 12 lọ sao cho cách ựều từ lọ số 1 ựến lọ số 90, kiểm tra chỉ tiêu hàm lượng

và mất khối lượng do làm khô trong từng lọ, sử dụng phương pháp trong quy trình thiết lập chất ựối chiếu đánh giá kết quả theo phương pháp thống kê Yêu cầu RSD của kết quả hàm lượng giữa các lọ ựược kiểm tra ≤ 1,0% và mất khố lượng do làm khô ≤ 1,5%

→ ựiều kiện ựóng gói ổn ựịnh, nguyên liệu ựóng trong các lọ là ựồng nhất

2.4.3.5 đánh giá liên phòng

- Chuẩn bị mẫu: mẫu chuẩn bán thành phẩm và quy trình thiết lập chất ựối chiếu

Mẫu 1: Khoa TLCC & CđC kiểm tra chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô (6 lọ)

2.4.3.6 Phương pháp xử lý số liệu:

Các số liệu ựược tắnh toán và xử lý bằng Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Lựa chọn ñiều kiện phân tích

Qua tham khảo các Dược ñiển, chúng tôi ñã lựa chọn các ñiều kiện phân tích

Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat như sau:

Bảng 3.1 ðiều kiện phân tích Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

Tốc ñộ dòng nitơ: 40 ml/phút

Nhiệt ñộ: 25 – 200oC Tốc ñộ gia nhiệt: 5oC/phút

A – B = 380 – 620

Nước

262 2,0

100 4,0%

0,8

C8, 250 x 4,6mm, 5 µm

Dd Diethylamin 1,5% (pH 7,5) Methanol

Chương trình gradient

Nước

297 2,0

100 4,0%

R ≥ 4,0 RSD (%) ≤ 1.0%

C8, 250 x 4,6mm, 5µm

5 ml Diethylamin + 295 ml nước (pH7,5)

Methanol Pha ñộng A–Pha ñộng B=30-70

Nước

297 1,5

10 1,0 mg Vincristin sulfat/ml 1,0 mg Vincristin sulfat/ml 1,0 mg Vincristin sulfat/ml

R ≥ 4,0 RSD (%) ≤ 1.0%

3.2 Kiểm tra nguyên liệu trước khi tinh chế

Tiến hành kiểm tra nguyên liệu các chỉ tiêu: Mất khối lượng do làm khô, tạp chất liên quan, ñịnh lượng (phổ DAD) theo các ñiều kiện phân tích ñã lựa chọn

Bảng 3.2 Kết quả ñánh giá nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat

trước khi tinh chế

theo chất khan

96,6 (n = 3) Theo DAD: 96,6%

96,8 (n = 3) Theo DAD: 97,8% Nhận xét Nguyên liệu Vinblastin sulfat và Vincristin sulfat ñạt hàm

- Tốc ñộ dòng thấp < 45 ml/phút hiệu quả tách cao hơn, píc sắc ký sắc nét hơn, lượng dung môi tiêu tốn ít hơn, nhưng thời gian thực hiện một lượt tách lại quá dài, hơn 8 giờ/ca

- Ở tốc ñộ dòng 45 ml/phút, hiệu quả tách ñạt tương ñương như các trường hợp

tốc ñộ thấp, thời gian một lượt tách sắc ký 8 giờ/ca Như vậy, tốc ñộ dòng pha ñộng 45 ml/phút là phù hợp nhất ñể tiến hành tách hiệu quả tinh chế Vinblastin sulfat trên cột sắc ký LichroPrep C18 ID 60 x L500 mm

Kết quả: Vinblastin sulfat ñược rửa giải ra ở ñoạn dung môi Methanol - Nước -

Acid sulfuric 0,05 % = 20 % - 70 % - 10 %, tương ứng với thời gian lưu ~ 4 giờ

• Kết tinh:

Các phân ñoạn sắc ký chứa Vinblastin sulfat ñược gộp lại, cô kiệt dung môi, sấy dưới áp suất giảm < 150 mbar ở nhiệt ñộ 40 – 50oC và thu ñược sản phẩm Vinblastin sulfat Hòa tan 10 g sản phẩm Vinblastin sulfat trong 50 ml ethanol khan, acid hóa ñến pH 4 bằng dung dịch acid sulfuric 1% trong ethanol (lắc nhẹ bình ñựng dung dịch trong quá trình acid hóa) ðể lắng trong 24 giờ ở nhiệt ñộ phòng Lọc hút chân không ñể thu kết tủa Hòa kết tủa tan hoàn toàn trong 50 ml methanol, bổ sung tiếp 200 ml ethanol khan, lắc nhẹ ðể yên hỗn hợp 3 giờ ở nhiệt ñộ phòng Sau ñó ñông khô ở nhiệt ñộ - 80oC, áp suất chân không 2 - 6 mbar trong 48 giờ và thu ñược 5,5 g Vinblastin sulfat

Hiệu suất tinh chế ñạt 55%

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi ñã tổng kết và ñưa ra ñược quy trình tinh chế Vinblastin sulfat theo sơ ñồ dưới ñây:

0,05%

Dịch phân ñoạn

Áp suất < 150 mbar Nhiệt ñộ : 40-50oC Sản phẩm Vinblastin sulfat

NL Vinblastin sulfat > 99%

Hòa tan, ñể yên 3 giờ

NL Vinblastin sulfat > 95%

Dung dịch

• So sánh kết quả kiểm tra nguyên liệu Vinblastin sulfat trước và sau khi tinh chế

Nguyên liệu Vinblastin sulfat sau quá trình tinh chế ñạt kết quả so với trước khi tinh chế như sau:

Bảng 3.3 So sánh kết quả trước và sau khi tinh chế Vinblastin sulfat

Tổng các tạp chất = 0,6%

Hàm lượng (%)

theo chất khan

96,6 (n = 3) 96,6 (theo DAD)

99,9 (n = 4) 96,4 (theo DAD)

DAD1 A, Sig=262,4 Ref=360,100 (VINBL\VINBL058.D)

Trước khi tinh chế Sau khi tinh chế

Hình 3.2 SKð tạp chất liên quan trong nguyên liệu Vinblastin sulfat trước và

sau khi tinh chế

Trước khi tinh chế Sau khi tinh chế

Hình 3.3 SKð ñịnh lượng nguyên liệu Vinblastin sulfat trước và sau khi tinh chế

Nhận xét:

- Sau khi tinh chế nguyên liệu Vinblastin sulfat, mất khối lượng do làm khô giảm, số lượng các tạp chất giảm từ 8 tạp xuống còn 4 tạp và tổng các tạp chất giảm từ 3,2% xuống 0,06% và hàm lượng tăng từ 96,6% lên 99,9% Như vậy quá trình tinh chế ñã loại ñược tạp, làm tăng ñộ tinh khiết của hoạt chất

- Về hiệu quả khoa học: ðưa 10 g nguyên liệu ñi tinh chế, sau quá trình tinh chế thu ñược 5,5 g Như vậy hiệu suất tinh chế ñạt 55%

3.3.2 Vincristin sulfat

Quy trình tinh chế áp dụng giống của nguyên liệu Vinblastin sulfat

Kết quả: Vincristin sulfat ñược rửa giải ra ở ñoạn dung môi Methanol - Nước -

Acid sulfuric 0,05% = 20 – 70 - 10 tương ứng với thời gian lưu ~ 7,5 giờ

• Kết tinh:

Các phân ñoạn sắc ký chứa Vincristin sulfat ñược gộp lại, cô kiệt dung môi, sấy dưới áp suất giảm < 150 mbar ở nhiệt ñộ 40 – 50oC và thu ñược sản phẩm dạng cao Hòa tan 10 g cao Vincristin sulfat trong 50 ml ethanol khan, acid hóa ñến

pH 4 bằng dung dịch acid sulfuric 1% trong ethanol (lắc nhẹ bình ñựng dung dịch trong quá trình acid hóa) ðể lắng trong 24 giờ ở nhiệt ñộ phòng Lọc hút chân không ñể thu kết tủa Hòa kết tủa tan hoàn toàn trong 50 ml methanol, bổ sung tiếp 200 ml ethanol khan, lắc nhẹ ðể yên hỗn hợp 3 giờ ở nhiệt ñộ phòng