Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nƣớc thải chế biến thủy sản

Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hồi Hương khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết có đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đồ án TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Huỳnh Mai Nhi i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời tri ân chân thành đến Cơ Nguyễn Hồi Hương tận tình hướng dẫn, bảo em suốt thời gian xây dựng đề cương hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy Huỳnh Văn Thành động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực Đồng thời, em gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường tận tình truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian dài học tập Với kiến thức mà em tiếp thu không giúp em thực tốt đồ án tốt nghiệp mà tảng kiến thức cho cơng việc sau Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình ln chăm sóc, tạo điều kiện cho em đến trường theo đuổi ước mơ chỗ dựa vững không tinh thần mà vật chất cho em suốt năm qua Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến bạn thực đề tài phòng thí nghiệm – người động viên, sát cánh giúp đỡ để em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cám ơn Thầy Cô Hội đồng phản biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy Cô lời chúc sức khỏe TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực Nguyễn Huỳnh Mai Nhi ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU .2 Tính cấp thiết đề tài 2 Tình hình nghiên cứu enzyme protease .3 2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease nước 2.2 Tình hình sản xuất enzyme protease giới .3 Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu .3 Phương pháp nghiên cứu .4 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa đề tài Các kết đạt đề tài Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ngành sản xuất thủy sản 1.2 Tổng quan nước thải chế biến thủy sản 10 1.2.1 Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản 10 1.2.2 Đặc tính nước thải chế biến thủy sản 14 1.2.3 Ảnh hưởng nước thải thủy sản đến môi trường nước .15 1.2.4 Hệ thống xử lý nước thải cho nhà máy sản xuất thủy sản 17 1.3 Tổng quan vi sinh vật nước thải công nghiệp 18 1.3.1 Nguồn gốc vi sinh vật nước thải công nghiệp .18 1.3.2 Thành phần vi sinh vật nước thải công nghiệp 19 1.3.3 Chuyển hóa vật chất vi sinh vật nước thải công nghiệp 19 1.4 Tổng quan trình phân giải chất giàu protein nhờ vi sinh vật21 1.4.1 Quá trình amon hóa protein 22 1.4.2 Vi sinh vật tham gia trình phân hủy protein 23 1.4.2.1 Bacillus subtillis 24 1.4.2.2 Bacillus cereus 25 1.4.2.3 Bacillus mensentericus 25 1.4.3 Enzyme protease vi sinh vật 26 1.4.3.1 Protease ngoại bào vi sinh vật: 26 1.4.3.2 Protease nội bào vi sinh vật: 27 1.4.3.3 Phân loại theo trung tâm hoạt động enzyme 28 1.5 Tổng quan phương pháp xử lý nước thải .28 1.5.1 Các phương pháp xử lý nước thải 29 1.5.1.1 Phương pháp học 29 1.5.1.2 Phương pháp hóa lý 29 1.5.1.3 Phương pháp hóa học 30 1.5.2 Phương pháp sinh học xử lý nước thải 31 1.5.2.1 Nguyên tắc 31 1.5.2.2 Các trình sinh học chủ yếu xảy nước thải 31 1.5.2.3 Các hình thức xử lý nước thải phương pháp sinh học 33 1.5.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình xử lý nước thải phương pháp sinh học .35 1.6 Tổng quan chế phẩm sinh học 37 1.6.1 Định nghĩa chế phẩm sinh học 37 1.6.2 Mục đích việc sử dụng chế phẩm sinh học thủy sản .37 1.6.3 Các chế phẩm sinh học xử lý nước thải chứa nito thị trường 38 1.6.3.1 Men vi sinh JUMBO .38 1.6.3.2 Chế phẩm sinh học EMIC .39 1.6.3.3 Chế phẩm AQUAPOND .39 1.6.3.4 Chế phẩm sinh học EM 40 1.6.3.5 Chế phẩm vườn sinh thái cho thủy sản 40 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài .42 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu .42 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 42 2.2 Vật liệu nghiên cứu 42 2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn .42 2.2.2 Hóa chất môi trường 42 2.2.2.1 Hóa chất 42 2.2.2.2 Môi trường 42 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 53 2.2.3.1 Thiết bị 53 2.2.3.2 Dụng cụ 53 2.3 Bố trí thí nghiệm 54 2.4 Bố trí thí nghiệm chi tiết 54 2.4.1 Phân lập định danh sơ chủng vi khuẩn amon hóa 54 2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn amon hóa 54 2.4.1.2 Định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập 57 2.4.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh enzyme protease chủng phân lập 58 2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường thu enzyme đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn 60 2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme môi trường lỗ thạch casein 61 2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối môi trường thu enzyme đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn 63 2.4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cung cấp oxi đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn 64 2.4.2.5 Khảo sát động học tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn 66 2.4.3 Thí nghiệm ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải CBTS 67 2.5 Phương pháp nghiên cứu 68 2.5.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu 68 2.5.2 Phương pháp tăng sinh 69 2.5.3 Phương pháp pha loãng mẫu 69 2.5.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein 69 2.5.4.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết 69 2.5.4.2 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 71 2.5.5 Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập .71 2.5.6 Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 72 2.5.6.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 72 2.5.6.2 Soi khuẩn lạc 72 2.5.6.3 Phương pháp nhuộm gram 72 2.5.6.4 Phương pháp nhuộm bào tử 72 2.5.7 Các thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 73 2.5.7.1 Thử nghiệm catalase .73 2.5.7.2 Thử nghiệm khả di động 73 2.5.7.3 Thử nghiệm Indol 73 2.5.7.4 Thử nghiệm VP .73 2.5.7.5 Thử nghiệm urease 73 2.5.7.6 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) 73 2.5.7.7 Thử nghiệm MR (Methyl Red) .74 2.5.7.8 Thử nghiệm khả lên men nguồn carbohydrate 74 2.5.7.9 Thử nghiệm khả lên men (F) oxy hóa (O) glucose 75 2.5.7.10.Thử nghiệm TSI 75 2.5.7.11.Thử nghiệm citrate 75 2.5.7.12.Thử nghiệm khả chịu mặn 75 2.5.7.13.Thử nghiệm Tyrosine 75 2.5.7.14.API KIT 20E 76 2.5.8 Xác định mật độ tế bào phương pháp đo mật độ quan (OD600nm) 76 2.5.9 Phương pháp đục lỗ thạch .76 2.5.10 Phương pháp nghiên cứu khả phân hủy tinh bột, protein, lipase, cellulose 77 2.5.11 Các phương pháp định lượng số nước thải 79 2.5.11.1.Phương pháp xác định Clorua .79 2.5.11.2.Phương pháp xác định nhu cầu oxi hóa học (COD) .79 + 2.5.11.3.Phương pháp định lượng N-NH4 79 2.6 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 79 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .80 3.1 Kết phân lập lựa chọn chủng có khả phân hủy protein 80 3.2 Kết định danh sơ 80 3.2.1 Kết thử nghiệm sinh hóa 80 3.2.2 Quan sát hình thái, sinh lý .82 3.3 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân lập 88 3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn phân lập 90 3.4.1 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh enzyme protease chủng vi khuẩn phân lập .90 3.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme môi trường lỗ thạch casein .92 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối đến khả tăng trưởng sinh enzyme protease chủng phân lập 98 3.4.3.1 Khả tăng sinh khối chủng nồng độ muối khác 99 3.4.3.2 Kết ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh enzyme chủng phân lập 102 vii 3.4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng oxi đến khả sinh enzyme protease chủng phân lập 106 3.4.5 Khảo sát động học tổng hợp protease môi trường nhân tạo 108 3.4.6 Ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải 110 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .54 Kết luận 54 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 A Tài liệu Tiếng Việt 120 B Tài liệu Tiếng Anh 121 C Tài liệu Internet 123 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CBTS: Chế biến thủy sản CFU: Colony forming unit ĐKVPG: Đường kính vòng phân giải DO: Oxy hòa tan (Dissolved Oxygen) ĐKVPG: Đường kính vòng phân giải FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc MT: Môi trường MT1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân hủy protein, chứa 1% gelatine MT2: Môi trường thu enzyme N2 : Khi Nitơ NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth + Amonium - Nitrite NO3 : - Nitrate OD: Optical Density TN: Thí nghiệm TSB: Tripticase Soya Broth TSI: Triple Sugar Iron Agar TSS: Total suspended solids (tổng vật chất lơ lửng) VK: Vi khuẩn VP – MR: Voges – Proskauer – Methyl Red VSV: Vi sinh vật NH4 : NO2 : DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 theo giá so sánh 2010 Bảng 1.2 Khối lượng sản phẩm thủy sản xuất từ năm 2002 – 2005 Bảng 1.3 Năng lực sản xuất sở chế biến thủy sản đông lạnh 10 Bảng 1.4 Lượng phế thải trung bình cho sản phẩm thủy sản 12 Bảng 1.5 Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản 13 Bảng 1.6 Giá trị thông số ô nhiễm làm sở tính tốn giá trị tối đa cho phép.13 Bảng 1.7 Một số vi sinh vật tham gia trình amon hóa protein 24 Bảng 2.1 Kết thử nghiệm khử nitrate thành nitrite 74 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập .80 Bảng 3.2 Kết định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải thủy sản 80 Bảng 3.3 Kết khảo sát enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân lập .88 Bảng 3.4 pH môi trường nuôi cấy tối ưu để tổng hợp enzyme protease chủng phân lập 92 Bảng 3.5 pH hoạt động tối ưu enzyme protease chủng phân lập .97 Bảng 3.6 pH môi trường nuôi cấy tối ưu pH hoạt động tối ưu enzyme protease tổng hợp từ chủng vi khuẩn .98 Bảng 3.7 Nồng độ muối tối ưu cho khả tăng trưởng chủng phân lập 102 Bảng 3.8 Nồng độ muối tối ưu cho khả sinh enzyme protease chủng phân lập 106 Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện oxi đến khả sinh enzyme chủng 108 Bảng 3.10 Thời gian nuôi cấy tối ưu chủng phân lập 110 10 Sau 24 giờ, chủng vi khuẩn không lên men nguồn đường rhamnose, lactose, xylose, arabinose cho kết âm tính (mơi trường khơng chuyển sang màu vàng, chuyển sang màu cam chứng tỏ pH môi trường trung tính) Với chủng NT4.3 khơng có khả lên men lactose nên sau 24 nuôi cấy mơi trường giữ ngun màu đỏ phenol red (Hình D.6) Từ thử nghiệm TSI khả lên men lactose, chứng tỏ chủng NT4.3 có khả sử dụng nguồn đường glucose saccharose sử dụng lactose để làm nguồn carbon tăng trưởng Các chủng NT1.3, NT1.4, NT2.3, NT4.3 có khả lên men đường Glucose sinh acid làm thay đổi pH môi trường (môi trường chuyển sang màu vàng) không sinh (trừ chủng NT4.3 sinh ít) Riêng chủng NT3.3 khơng có khả lên men đường nên mơi trường khơng chuyển sang màu vàng Chỉ có chủng NT4.3 có khả lên men đường manitol khơng sinh hơi, chủng NT1.3, NT1.4, NT2.3, NT3.3 khơng có khả lên men đường manitol Đối với đường Manose: có chủng 4.3 có khả lên men đường sinh acid làm cho pH môi trường giảm, môi trường chuyển sang màu vàng Các chủng NT1.3, NT1.4, NT2.3, NT3.3 khơng có khả lên men đường manose Kết thể qua hình D.6, D.7, D.8, D.9, D.10, D.11 Hình D.6 Kết lên men Glucose Hình D.7 Kết lên men Mannitol Hình D.8 Kết lên men Lactose Hình D.9 Kết lên men đường Rhamnose Hình D.10 Kết lên men đường Xylose Hình D.11 Kết lên men đường Arabinose D.10 Thử nghiệm khử nitrate Sau 24 nuôi cấy tiến hành định tính khả phân giải nitrate Đối với chủng NT3.3 cho Griess A GRiess B vào giọt canh trường khơng có chuyển sang màu hồng đậm (hình D.12) bổ sung viên kẽm có xuất màu hồng Vì vậy, chủng NT3.3 âm tính Với mẫu NT1.3, NT1.4, NT2.3, NT4.3 thấy có khử nitrate thành nitrite tạo màu hồng đậm giọt canh trường cho thuốc thử Griess A Griess B vào (hình D.12) Cho kết dương tính Hình D.12 Kết thử nghiệm nitrate D.11 Thử nghiệm di động Sau 24 nuôi cấy, mẫu E coli cho thấy khơng có di động bề mặt thạch Các mẫu thử nghiệm NT1.3, NT1.4, NT2.3 NT4.3 di động mạnh mẽ, từ điểm cấy ban đầu, sau 24 nuôi cấy vi khuẩn dường lan khắp bề mặt thạch (Hình D.1 3) Như chứng thiết thực để chứng tỏ có mặt tiên mao NT1.3, NT1.4, NT2.3 NT4.3 Riêng chủng NT3.3 di động Hình D.13 Thử nghiệm tính di động môi trường thạch mềm 0,5% agar D.12 Thử nghiệm phân giải tinh bột Sau cấy chủng vào môi trường thạch chứa 1% tinh bột Sau 24 – 48 cho thấy tất chủng NT1.3, NT3.3, NT4.3, NT1.4 NT2.3 có khả phân hủy tinh bột Từ đó, nhận thấy chủng vi khuẩn có khả tiết enzyme amylase Hình D.14 Thử nghiệm phân giải tinh bột D.13 Thử nghiệm tyrosine Cấy vi khuẩn vào đĩa thạch Nutrient Agar có Tyrosine Ủ 35 C, quan sát kết thời gian – 20 ngày Đánh giá khả phân giả tyrosine chủng cách quan sát xuất vòng phân giải đĩa thạch Kết cho thấy, chủng NT1.3, NT3.3 NT4.3 khả phân giải tyrosine Chỉ có chủng NT1.4 NT2.3 có khả phân giải tyrosine Hình D.15 Thử nghiệm Tyrosine D.14 Thử nghiệm O/F Sau 24 giờ, kết khảo sát cho thấy ống đối chứng E.coli chuyển sang màu vàng, nghĩa vi khuẩn E.coli lên men đường glucose hai mơi trường hiếu khí (ống khơng có parafin lỏng) kỵ khí (ống có chứa parafin lỏng) Các sản phẩm axit lên men làm giảm pH môi trường từ pH 7,1 xuống pH 6,0 dẫn đến làm thay đổi màu chị thị bromthymol blue từ xanh sang vàng Các chủng NT1.3, NT1.4, NT2.3, NT3.3 NT4.3 có tượng giống mẫu đối chứng Chứng tỏ, chủng có khả lên men đường glucose mơi trường hiếu khí kỵ khí Hình D.16 Thử nghiệm O/F D.15 Thử nghiệm NH3 Trên môi trường NB với thuốc thử Nessler: màu dung dịch thu biến thiên từ màu vàn rơm đến màu nâu đậm, phụ thuộc vào hàm lượng NH3 sinh Kết cho thấy chủng sinh NH3 sau 24 ni cấy Hình D.17 Thử nghiệm NH3 D.16 Thử khả chịu mặn Trên môi trường TSB có bổ sung muối để đạt 6,5% chủng có khả tăng trưởng sau 72 Chứng tỏ, chủng phân lập có khả chịu muối Hình D.18 Khả chịu mặn chủng NT4.3 D.17 Test API KIT D.17.1 Chuẩn bị môi trường NB  Thành phần môi trường:  Pepton: 0.5%  Cao thịt: 0.3%  NaCl: 1%  Hấp khử trùng 1210C, 15 phút D.17.2 Tăng sinh chủng phân lập Lấy sinh khối vi sinh vật từ ống giống cấy vào mơi trường NB, lắc 150 vòng 24 Sau đó, đo OD600nm cho OD = 0.6 D.17.2.1 Pha loãng mẫu Hút 1ml dịch tăng sinh vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý 0.85% ta -1 -1 dung dịch pha loãng 10 Sau đó, tiếp tục hút 1ml từ độ pha lỗng 10 vào -2 ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý ta độ pha loãng 10 Thực -3 -4 -5 tương tự ta độ pha loãng 10 , 10 , 10 D.17.2.2 Cấy chuyển sang mơi trường NA Từ độ pha lỗng hút l00µl vào đĩa petri chứa mơi trường NA vơ trùng Tiến hành cấy trang đĩa petri ( nồng độ lặp lại lần) Ủ 37°C 24 Sau 24h, kiểm tra xem có khuẩn lạc đặc trưng khơng Nếu chưa có phải ủ thêm D.17.2.3 Chuẩn bị Mc Faland, nước muối sinh lý  Dung dịch BaCl2 1% (w/v) : cân 1.000g BaCl2.2H2O cho vào 50ml nước cất, khuấy đến tan định mức 100ml  Dung dịch H2SO4 1% (v/v): hút 1ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào bình định mức 100ml, sau dùng nước cất định mức 100ml Bảng D.1 Độ đục chuẩn (McFarland) Nồng độ 0.05 BaCl2 1% (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 H2SO4 1% (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6  Chuẩn bị nước muối sinh lý 0.85%, ống nghiệm 10ml  Nước cất, pipetman thủy tinh (nhét không thấm nước vào đầu pipet hạn chế lây nhiễm vi sinh vật bên vào Tất hấp khử trùng 121 C/ 15 phút  Dầu khoáng (paraffin oil) sấy nhiệt độ 150 C D.17.2.4 Bắt đầu test (thực điều kiện vô trùng)  Dùng pipetman chuẩn bị hút nước cất vô trùng vào khay nhựa để KIT đạt độ ẩm định  Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng cho vào nước muối sinh lý hấp khử trùng, đạt độ đục với Mc Faland mức  Dùng pipetman chuẩn bị trên, hút nước muối có vi khuẩn vào phản ứng KIT sau:  ONPG, TDA, IND, GLU ARA: cho dịch vào cho đầy cupble  ADH, LDC, ODC, H2S, URE: cho dịch vào không đầy cupble, cho dầu khống vào ngập cupble tube (đổ cho lồi lên)  CIT, VP, GEL: cho dịch vào cho đầy cupble tube  Ghi lại tên người thực hiện, ngày sau cấy xong  Ủ KIT nhiệt độ 370C, từ 18-24h Sau đọc kết D.17.2.5 Cách đọc kết  Sau 18 giờ: đọc tất phản ứng tượng test ( trừ TDA, IND, VP), sau ghi nhận lại kết cách : dương tính (+), âm tính (-)  ONPG :  Nếu chuyển từ không màu sang màu vàng (+)  Nếu không đổi màu (-)  ADH, LDC, ODC :  Nếu chuyển từ màu vàng sng màu đỏ cam (+)  Nếu khơng có tahy đổi màu (-)  CIT :  Nếu có chuyền đổi màu từ xanh lợt vàng sang xanh đậm xanh da trời (+)  Nếu khơng có thay đổi màu (-)  H2 S :  Nếu có chuyển màu từ khơng màu sang đen (+)  Nếu khơng có thay đổi (-)  URE:  Nếu có chuyển màu từ vàng sang đỏ cam (+)  Nếu chuyển màu (-)  GEL:  Nếu chuyển từ màu xanh dương sang màu đen (+)  Nếu khơng có thay đổi màu (-)  Từ GLU ARA:  Nếu chuyển màu từ xanh dương sang màu vàng (có ko sinh hơi) (+)  Nếu khơng có thay đổi màu (xanh dương xanh cây) (-) Sau 24h: đọc lại tất phản ứng tượng test kể TDA, IND, VP, sau ghi nhận lại kết quả: dương tính (+), âm tính (-)  Đầu tiên đọc GLU trước : có thay đổi màu từ xanh dương sang vàng (+) ta tiến hành đọc tiếp kết lại Nếu khơng có thay đổi màu (-) ta dừng khơng đọc kết  Tiếp theo đọc TDA cách: nhỏ giọt thuốc thử Feric chloric 10% vào test TDA:  Nếu có thay đổi màu từ vàng sang nâu đỏ (+)  Nếu khơng có thay đổi màu (vàng) (-)  Tiếp theo đọc VP cách: nhỏ giọt thuốc thử VP1(αnaphthol) VP2 (40% KOH) vào test VP chờ 10 phút (nên bổ sung KOH đầu tiên):  Nếu từ không màu sang màu hồng đỏ (+)  Nếu khơng có thay đổi màu (-)  Đọc tới IND cách : nhỏ giọt thuốc thử Kovac’c (Jame) vào test IND phút:  Nếu có xuất vòng đỏ (+)  Nếu khơng có xuất vòng đỏ (-)  Đọc N2 cách :  Nếu có xuất bọt khí test GLU có xuất khí N2 (+)  Nếu khơng có xuất bọt khí GLU khơng có xuất N2 (-)  Đọc NO2 cách: nhỏ giọt NIT1 NIT2 vào test GLU, chờ vòng 2-3 phút:  Nếu có chuyển màu từ vàng sang hồng đỏ (+)  Nếu khơng có thay đổi màu (-)  Đọc Catalase cách: nhỏ giọt H2O2 vào MAN, INO, SOR vòng phút  Nếu có sủi bọt khí (+)  Nếu khơng sủi bọt khí (-) D.17.2.6 Kết Hình D.19 Test API KIT chủng NT1.3 Hình D.20 Test API KIT chủng NT1.4 Hình D.21 Test API KIT chủng NT2.3 Hình D.22 Test API KIT chủng NT3.3 Hình D.23 Test API KIT chủng NT4.3 D.18 Các phương pháp định lượng số nước thải D.18.1 Phương pháp xác định Clorua D.18.1.1 Tiến hành - Dùng pipet hút 50 ml mẫu vào bình nón - Dùng giấy đo pH hay máy đo pH kiểm tra pH dung dịch mẫu Đưa pH mẫu khoảng – dung dịch NaOH 1N hay H2SO4 1N Thêm 1ml dung dịch thị cromat - Tiến hành chuẩn độ dung dịch mẫu dung dịch AgNO3 chuẩn 0,0141N kết thúc chuẩn độ dung dịch vừa chuyển màu từ vàng trắng sang vàng cam - Ghi nhận thể tích dung dịch chất chuẩn AgNO3 (V ml) sử dụng Tiến hành song song mẫu trắng theo trình tự bước trên, thay mẫu thử nước cất D.18.1.2 Tính tốn kết - Nồng độ Clorua (mgCl /l) = ( ) Với: V thể tích dung dịch chất chuẩn AgNO3 sử dụng (ml) để chuẩn độ mẫu thử phép xác định VB thể tích dung dịch chất chuẩn AgNO3 sử dụng (ml) để chuẩn độ mẫu trắng phép xác định Vmẫu thể tích mẫu lấy phép xác định (ml) D.18.2 Phương pháp xác định nhu cầu oxi hóa học (COD) D.18.2.1 Tiến hành  Rửa ống COD nút dung dịch H2SO4 20% trước sử dụng  Hút thể tích mẫu hóa chất vào ống COD có kích thước 16*100(mm) theo thứ tự sau:   Mẫu: 2,5 ml Dung dịch K2Cr2O7 0,1N: 1,5 ml  H2SO4dd: 3,5 ml  Cho acid chảy dọc theo thành ống nghiệm Sau đó, đậy nắp lắc mẫu thật Làm tương tự mẫu trắng (thay mẫu nước cất)  Cho vào máy COD nhiệt độ 150 C vòng (Mẫu trắng, mẫu TN)  Sau lấy ra, để nguội đến nhiệt độ phòng, đổ erlen Tráng lại ống nghiệm vài ml nước cất trút sang bình nón  Thêm giọt thị ferroin định phân FAS 0,1N Kết thúc phản ứng dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu nâu đỏ Tương tự, định phân mẫu trắng D.18.2.2 Tính tốn kết COD = Trong đó: ( )  V1 thể tích dung dịch FAS sử dụng để chuẩn độ mẫu thử, ml  V2 thể tích dung dịch FAS sử dụng để chuẩn độ mẫu trắng, ml  CFAS = x0,1 nồng độ thực tế dung dịch FAS thời điểm phân tích xác định COD  Vmẫu – thể tích dung dịch mẫu lấy phép xác định, ml  VK2Cr2O7 thể tích dung dịch K2Cr2O7 thêm vào ống nghiệm theo kích cỡ để thực phép phân tích với mẫu trắng khơng gia nhiệt  VFAS thể tích dung dịch FAS sử dụng để chuẩn độ K2Cr2O7 ống nghiệm phép phân tích với mẫu trắng không gia nhiệt D.18.3 Phương pháp định lượng N-NH4 + D.18.3.1 Tiến hành theo bước mô tả bảng D.1 Bảng D.1 Các bước tiến hành định lượng NH4 Thể tích (ml) + Số thứ tự Mẫu trắng Mẫu TN L1 Mẫu TN L2 Mẫu TN L3 Mẫu 0,5 0,5 0,5 Nước cất 100 99,5 99,5 99,5 ZnSO4 1 1 NaOH 6N 0,5 0,5 0,5 0,5 Để yên 30 – 45 phút Sau đem lọc bỏ tủa, lấy 50 ml dịch 1 1 EDTA NH4 (giọt) 1 1 Dd Nessler 2 2 Na2S2O3 N/70 + Lắc để yên phút Đo độ hấp thụ bước sóng 430nm D.18.3.2 Tính tốn kết Hàm lượng amoni tính dựa phường trình đường chuẩn y = 0,1697x 0,0005 với x nồng độ, y độ hấp thu quang (Cao Dương, 2008) Hàm lượng amoni sinh = ( ) ... lập số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả phân hủy protein nước thải chế biến thủy sản thực nhằm tìm chủng vi khuẩn có khả phân giải protein điều kiện có nồng độ NaCl mức 3% để sản xuất chế phẩm... trình phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein từ nước thải chế biến thủy sản 55 Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả phân hủy protein .56 Hình 2.4 Quy trình định danh sơ chủng. .. phẩm sinh học ứng dụng xử lý nước thải thủy sản, bảo vệ môi trường Các kết đạt đề tài  Phân lập chủng có khả sinh enzyme protease phân hủy protein từ nước thải chế biến thủy sản Từ kết phân lập