4.1. Xác định cấu trúc của hợp chất 1.
Hợp chất 1 phân lập được dưới dạng bột vô định hình, màu trắng. Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của hợp chất 1 nhận thấy tín hiệu cộng hưởng của hai proton thơm (δH 6.44, 2H, s), hai tín hiệu cộng hưởng của anome proton (δH 4.78, 1H, d, J = 7.6 Hz và 4.95, 1H, d, J = 2.5 Hz), tín hiệu cộng hưởng của ba nhóm methoxy (δH 3.78, 6H, s và 3.69, 3H, s) và các tín hiệu cộng hưởng của cacbinol proton trong vùng δH 3.30-4.02 (Hình 4.1.a).
Hìn h 4.1.a. Phổ proton 1H-NMR của hợp chất 1
Các phân tích phổ C-NMR và DEPT cho thấy trong phân tử hợp chất 1 có chứa 20 nguyên tử cacbon bao gồm: năm nguyên tử cacbon bậc 4 (bốn cacbon olefin và một cacbon cacbinol), chín nguyên tử cacbon bậc 3 (hai cacbon olefin và bảy cacbon cacbinol), ba nguyên tử cacbon bậc 2 (ba cacbon hydroxymetylen), và ba nguyên tử cacbon bậc 1 (ba metoxi cacbon). Các dữ kiện trên cho thấy cấu trúc hóa học của hợp chất1 có dạng là một dẫn xuất phenyl glycoside.
Sự xuất hiện của các cặp tín hiệu cộng hưởng tương đương nhận được trên phổ 1H, và 13C-NMR [H-2/H-6 (δH 6.44); 3-OMe/5-OMe (δH 3.78); C- 3/C-5 (δC 154.80); C-2/C-6 (δC 96.29); 3-OMe/5-OMe (δC 56.70)] cho phép dự đoán aglycone trong hợp chất 1 có cấu trúc đối xứng dạng phenyl thế bốn vị trí 1,3,4,5.
Hình 4.1.c. Phổ DEPT 135 của hợp chất 1
Tiếp đó, vị trí các nhóm thế, và liên kết glycoside trong hợp chất 1 được đưa ra qua các tín hiệu tương tác nhận được khi phân tích phổ 2 chiều HMBC và HSQC.
Hình 4.1.e. Phổ 2 chiều HMQC của hợp chất 1
Tương tác HMBC giữa proton metoxi δH (3.78) và C-3/C-5 (δC 154.80) cho phép khẳng định nhóm metoxi thế tại vị trí C-3 và C-5. So sánh với các tài liệu đã công bố về các dẫn xuất 1,3,4,5-tetrahydroxybenzen, [10,11] tín hiệu cộng hưởng tại δC 134.58 được gán cho nguyên tử C-4. Kết hợp với tương tác HMBC nhận được giữa tín proton metoxi còn lại δH (3.69) với C-4 (δC 134.58) đã khẳng định nhóm metoxi còn lại thế tại vị trí C-4. Tương tác HMBC giữa proton anome của đơn vị đường δH 4.87 và C-1 (δC 155.96) cho thấy liên kết glucoside tại vị trí C-1. Sự có mặt của hai đơn vị đường trong hợp chất 1 được chỉ ra bởi hai tín hiệu cộng hưởng của anome proton (δH 4.78 và 4.95) tương ứng với hai tín hiệu cộng hưởng của anome cacbon (δC 103.17 và 110.84) quan sát được trên phổ hai chiều HMQC. Hơn nữa, các đơn vị đường được xác định là glucose và apiose bằng việc thủy phân hợp chất 1
trong môi trường axit, chiết với CHCl3, sau đó phân tích TLC (CHCl3:CH3OH:H2O, 3:2:0.3) lớp nước và so sánh với đường chuẩn (Glucose Rf 0.29, Apiose Rf 0.48). Đơn vị apiose liên kết với glucose tại vị trí C-6ʹ được chỉ ra bởi sự dịch chuyển về vùng trường thấp của nguyên tử C-6ʹ (δC 68.75) nhận được trên phổ 13C-NMR hơn nữa bởi tương tác HMBC quan sát được giữa H2-6ʹ(δH 4.02, 3.56)/C-1ʹʹ (δC 110.84) và H-1ʹʹ (δH 4.95)/C-6ʹ (δC 68.75). Do đó, cấu trúc hóa học của hợp chất 1 được xác định là 3,4,5- trimethoxyphenyl 1-O-β-apiofuranosyl-(1ʹʹ→6ʹ)-β-glucopyranoside [14] với công thức phân tử C20H30O13 có số khối M = 478, 1686 là hoàn toàn phù hợp. (Hình 4.1.f)
Bảng 4.1. Kết quả phổ NMR của hợp chất 1
No.
#,dδC [12]
#,aδC [13] #,aδC [14] a,bδC
a,cδH (mult., J in Hz) HMBC (H→C) 1 154.9 156.1 134.6 155.96 - - 2 95.6 96.2 96.4 96.29 6.44 (s) C-1, C-3, C-4, C-6 3 154.1 154.8 154.8 154.80 - - 4 134.1 134.5 156.0 134.58 - - 5 154.2 154.8 154.8 154.80 - - 6 95.6 96.2 96.6 96.29 6.44 (s) C-1, C-2, C-4, C-5 3,5-OMe 56.2 56.6 56.7 56.70 3.78 (s) C-3, C-5 4-OMe 60.6 61.2 61.2 61.24 3.69 (s) C-4 1-O-Glc 1ʹ 102.2 103.2 103.2 103.17 4.78 (d, 7.6) C-1 2ʹ 74.4 75.0 74.9 74.91 3.89* 3ʹ 77.3 78.4 77.9 77.92 3.42* 4ʹ 71.0 71.7 71.6 71.59 3.30* 5ʹ 75.5 78.1 77.0 77.01 3.56* 6ʹ 64.6e 62.8 68.8 68.75 4.02 (d, 8.9) 3.56* C-1′′ 6ʹʹ-O-Api 1ʹʹ 110.9 110.84 4.95 (d, 2.5) C-6ʹʹ 2ʹʹ 77.9 77.84 3.85 (d, 2.5) 3ʹʹ 80.5 80.48 - 4ʹʹ 74.9 74.91 3.93 (d, 9.6) 3.72 (d, 9.6) 5ʹʹ 65.4 65.33 3.52 (d, 2.0) a)
CD3OD-d4, b)150MHz, c)600 MHz, d)Acetone-d6 + CD3OD-d4, e)6′-O-galloyl,*)
Overlapped signals
O OOH OH OMe OMe OMe O OH OH OH OH OH O 1 3 5 Hình 4.1.g. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 1 4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất 2 (Icariside F2).
Hợp chất 2 phân lập được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ cộng hưởng từ proton của hợp chất 2 nhận thấy sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của một nhóm phenyl với ba nhóm tín hiệu cộng hưởng 7.25 (1H, t, J = 6.8 Hz, H-4), 7.34 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-3/H-5), và 7.41 (2H, d, J = 6.8 Hz, H- 2/H-6). Hai tín hiệu cộng hưởng của proton anome quan sát thấy tại các vị trí cộng hưởng H-1’ (4.31 1H, d, J = 7.6 Hz) và H-1’’ (5.03 1H, d, J = 2.4 Hz).
Phân tích phổ C -NMR của hợp chất 2 cho thấy tín hiệu của 18 nguyên tử cacbon .Trong đó 11 nguyên tử cacbon thuộc về phần đường, 6 nguyên tử cacbon thơm và một nguyên tử cacbon hydroximetylen δC 71.83 thuộc về aglycon. Từ các dữ kiện trên cho phép dự đoán hợp chất 2 có dạng benzyl glycoside. Sự xuất hiện của tín hiệu cacbon anome tại δC 111.11, một cacbinol cacbon bậc 4 δC 80.61 và một hydroximetylen cacbon δC 75.02 cho thấy sự tồn tại của đơn vị đường apiose trong phân tử hợp chất 2. Các tín hiệu cộng hưởng tại δC 103.26, 75.13, 78.09, 71.83, 77.03, 68.71 cho phép dự đoán đơn vị đường còn lại là glucose. Sự chuyển dịch của tín hiệu C-6’ (δC 68.71) của glucose về vùng trường thấp cho phép dự đoán đơn vị đường apiose liên kết với glucose tại C-6’. Hơn nữa, sự có mặt của đường apiose và glucose trong hợp chất 2 một lần nữa được khẳng định bằng phương pháp thủy phân trong môi trường acid, phân tích TLC (CHCl3:CH3OH:H2O, 3:2:0.3) và so sánh với đường chuẩn (Glucose Rf 0.29, Apiose Rf 0.48).
Cuối cùng, khi so sánh các kết quả phân tích phổ 1H và C-NMR của hợp chất 2 và hợp chất benzyl O-β-D-apiofuranosyl(1''→6')-β-D-
glucopyranoside cho thấy các tín hiệu cộng hưởng trên 1H, và 13C-NMR của hợp chất 2 giống với hợp chất benzyl O-β-D-apiofuranosyl(1''→6')-β-D-
glucopyranoside đã thông báo [15]. Như vậy cấu trúc hóa học của hợp chất 2 được xác định là benzyl O-β-D-apiofuranosyl(1''→6')-β-D-glucopyranoside
hay Icariside F2 có công thức phân tử là C18H26O10 (M=402). (Hình 4.2.c)
Bảng 4.2. Kết quả phổ NMR của hợp chất 2
No. #,dδC [15] a,bδC a,cδH (mult., J in Hz)
1 138.9 139.07 - 2 128.7 129.43 7.41 (d, 6.8) 3 128.7 129.39 7.34 (t, 6.8) 4 127.9 128.3 7.25 (t, 6.8) 5 128.7 129.39 7.34 (t, 6.8) 6 128.7 129.43 7.41 (d, 6.8) 7 71.0 71.83 4.63 (d, 11.6) 4.87* 7-O-Glc 1ʹ 103.7 103.26 4.31 (d, 7.6) 2ʹ 75.1 75.13 3.22-3.38* 3ʹ 78.6 78.09 3.22-3.38* 4ʹ 72.0 71.83 3.22-3.38* 5ʹ 77.3 77.03 3.22-3.38* 6ʹ 69.1 68.71 4.00 * 3.61* 6ʹ-O-Api 1ʹʹ 111.2 111.11 5.03 (d, 2.4) 2ʹʹ 78.0 78.06 3.92 (d, 2.4) 3ʹʹ 80.6 80.61 - 4ʹʹ 75.1 75.02 3.97 (d, 9.6) 3.76 (d, 9.6) 5ʹʹ 65.7 65.59 3.58 (2H, s)