nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật việt nam

Một chương trình nghiên cứu các tác nhân dự phòng và chống ung thư từ nguồn thực vật Việt Nam của chúng tôi đã được xây dựng trên cơ sở lựa chọn các nhóm hợp chất có các cấu trúc tiềm nă

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC

TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

chế……… 14

1.1.4.3 Định tính và xác định cấu trúc………16

1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex

Blume)… 19

học……….19

1.2.2 Nơi sống và thu hái……… 19

KHẢO……….47

CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường dưới trọng lực dung môi

13

C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Tranfer): Phổ DEPT

ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi điện tử

FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh

proton

LC (Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng

Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế

TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng

MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ

H×nh 1.1: Cấu trúc minh häa của stilben và lignin

H×nh 1.3: Cây Chẹo l¸ phong ( Engelhardtia spicata Lesh ex Blume, Juglandaceae

)

B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên

Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong

Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) bằng TLC

Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) bằng TLC

Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic

Sơ đồ 3.1: Điều chế các phần chiết hữu cơ từ nguyên liệu thực vật

Sơ đồ 3.2: Phân tách sắc kí phần chiết etyl axetat (EG3)

Sơ đồ 3.3: Phân tách sắc kí phần chiết nước (EG4)

MỞ ĐẦU

Các hợp chất phenolic thực vật như các axit phenolic, các flavonoid và các flavonoid polyme đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm do tính chất chống oxi hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư và các bệnh liên quan đến tim mạch của các hợp chất phenolic Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) đã phần nào lý giải được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm giàu các hoạt chất phenolic thiên nhiên

Các nghiên cứu theo hướng phát hiện các hợp chất có tác dụng dự phòng ung thư (cancer chemoprevention) đã thiết lập được một hướng ứng dụng mới của các hợp chất phenolic Các hợp chất phân tử nhỏ này thường là các chất chống oxi hóa

và có thể làm giảm sự phát triển của bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư qua các cơ chế ngăn chặn sự hư hại ADN hoặc ức chế hoặc đảo ngược quá trình phát triển của các tế bào tiền ác tính đã có sự hư hại ADN Một chương trình nghiên cứu các tác nhân dự phòng và chống ung thư từ nguồn thực vật Việt Nam của chúng tôi đã được xây dựng trên cơ sở lựa chọn các nhóm hợp chất có các cấu trúc tiềm năng; trong chương trình này các hợp chất phenolic có tác dụng dự phòng ung thư đã được phát hiện với tỷ lệ cao Chương trình nghiên cứu này cũng đã xác định một thách thức được đặt ra cho các nhà hóa học các hợp chất thiên nhiên là cần có các qui trình phân lập hiệu quả các nhóm cấu trúc cần thiết từ các nguồn nguyên liệu thực vật, các qui trình này phải dễ được triển khai tiếp cho các qui mô công nghệ phân lập lượng lớn hoạt chất một khi các hoạt chất hữu ích được phát hiện

Các hợp chất phenolic chiếm một vị trí đáng kể trong số các nhóm hợp chất thiên nhiên có tác dụng dự phòng ung thư; chúng có cấu trúc đa dạng và xuất hiện phổ biến trong giới thực vật Việc phân lập các hợp chất này cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học có thể được thực hiện bằng các phương pháp chiết và sắc ký điều chế; tuy nhiên phổ rộng độ tan của các hợp chất này cho thấy mỗi qui trình phân lập nên được giới hạn vào một nhóm hợp chất phenolic Các sàng lọc sắc ký lớp mỏng

sơ bộ đã xác định được nhóm hợp chất phenolic trong các phần chiết từ các loài

cây: Alnus nepalensis D Don (Betulaceae), Betula alnoides Buch Ham ex D Don (Betulaceae) và Engelhardtia spicata Lesch ex Blume (Juglandaceae) Mục tiêu

nghiên cứu của luận văn này là xây dựng một qui trình chiết các phần chiết giàu các hợp chất phenolic và phân lập sắc ký các hợp chất phenolic, sau đó cấu trúc chính xác của các các hợp chất được phân lập sẽ được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại Qui trình này đã được áp dụng thành công để phân lập các hợp chất

phenolic thành phần chính từ lá cây Chẹo lá phong (E spicata Lesch ex Blume)

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Các hợp chất phenolic thực vật

1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [6]

Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxy Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như tannin

Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và

vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người

Các hợp chất phenolic là thành phần phổ biến của thức ăn thực vật (trái cây, rau, ngũ cốc, ô liu, các loại đậu, sô-cô-la, vv) và đồ uống (trà, cà phê, bia, rượu, vv), và góp phần tạo nên các đặc tính cảm quan chung của thức ăn thực vật Ví dụ, các hợp chất phenolic làm tăng vị đắng, sự se của trái cây và nước trái cây, bởi vì sự tương tác giữa các hợp chất phenolic, chủ yếu là các procyanidin và glycoprotein trong nước bọt Các anthocyanin, một trong sáu phân nhóm của một nhóm polyphenol thực vật lớn được gọi là các flavonoid, tạo màu da cam, đỏ, xanh

và màu tím của nhiều loại trái cây và rau quả như táo, quả, củ cải và hành tây Các hợp chất phenolic được biết đến như là những hợp chất quan trọng nhất ảnh hưởng đến hương vị và sự khác biệt màu sắc giữa các loại rượu vang trắng, hồng

và đỏ, các hợp chất này phản ứng với oxy và có ảnh hưởng đến việc bảo quản, lên men và cất giữu rượu vang

1.1.2 Phân loại các hợp chất phenolic [6, 10]

Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành 10

nhóm chính được đưa ra trong Bảng 1.1

B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên

Số nguyên

Nguồn gốc thực vật

Benzoquinon

OH

COOH

Táo, mơ, chuối, súp lơ

lê, cà tím

Cà rốt, cần tây, cam chanh, rau mùi tây

mạch đen, lúa mì, lanh

tạo thành từ các axit phenolic

và đường đơn

Lựu, quả mâm xôi

Các hợp chất phenolic thực vật bao gồm các stilben, các lignan (Hình 1.1), các axit phenolic, các flavonoid và các tannin (Hình 1.2)

Hình 1.1: Cấu trúc minh họa của stilben và lignan

H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa của flavonoid, axit phenolic và tannin

Các flavonoid là các polyphenol có nhiều nhất trong thức ăn của chúng ta Một

cấu trúc flavonoid cơ bản là nhân flavan, chứa 15 nguyên tử cacbon được sắp xếp theo ba vòng (C6-C3-C6), được kí hiệu là A, B và C Các flavonoid được chia thành sáu phân nhóm: flavon, flavonol, flavanol, falavanon, isoflavon và anthocyanin theo trạng thái oxy hóa của vòng C trung tâm

Sự thay đổi cấu trúc của chúng trong mỗi nhóm một phần là do mức độ và mô hình hydroxyl hóa, methoxyl hóa, prenyl hóa, hoặc glycosyl hóa

Một số chất flavonoid phổ biến nhất bao gồm quercetin, một flavonol có rất nhiều trong hành tây, bông cải xanh, táo; catechin, một flavonol được tìm thấy trong trà và một số loại trái cây; naringenin, một flavonol có trong quả bưởi; các cyaniding glycoside, anthocyanin có nhiều trong các loại trái cây mọng (nho đen, mâm xôi, blackberry, …) và daidzein, genistein và glycitein, các isoflavon trong đậu tương

Các axit phenolic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm các dẫn xuất của axit

benzoic chẳng hạn như axit gallic và nhóm các dẫn xuất của axit cinnamic như axit coumaric, axit caffeic và axit ferulic Axit caffeic là một axit phenolic phổ biến nhất, chứa trong nhiều loại trái cây và rau quả, thường được este hóa với axit quinic trong axit chlorogenic, là một hợp chất phenolic chủ yếu trong cà phê Một axit phenolic phổ biến khác là axit ferulic, đó là chất có trong ngũ cốc và được este hóa tạo thành các hemicelluose có trong thành tế bào

Các tannin là một nhóm lớn các polyphenol trong khẩu phần ăn của chúng ta

và thường được chia thành hai nhóm: nhóm các tannin thủy phân và nhóm các tannin ngưng tụ Các tannin thủy phân là các hợp chất có chứa nhân của glucose hoặc polyol khác, được este hóa với axit galic tạo thành các gallotannin, hoặc với axit hexahydroxydiphenic tạo thành các gellagitannin Sự đa dạng trong cấu trúc của các hợp chất này là do khả năng hình thành các liên kết oxy Phản ứng oxy hóa giữa các phân tử tạo thành nhiều hợp chất oligomeric có khối lượng phân tử khoảng 2.000 đến 5.000 dalton Các tannin ngưng tụ là các oligome hoặc polymer của flavan-3-ol liên kết

với nhau bằng một liên kết cacbon giữa các flavan Chúng cũng được coi là các proanthocyanidin bởi vì chúng bị phân hủy thành các anthocyanidin thông qua phản ứng oxy hóa, trong điều kiện xúc tác axit, nhiệt độ với các dung dịch rượu Sự đa dạng cấu trúc các tannin là một kết quả của sự biến đổi trong mô hình thủy phân, lập thể tại ba trung tâm lập thể, vị trí và loại liên kết giữa các flavan, cũng như mức

độ và mô hình của sự glycosyl hóa, methoxyl hóa và galloyl hóa

1.1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic

Do sự phân bố rộng rãi, các polyphenol có vai trò đối với sức khỏe của con người nên chế độ ăn uống dinh dưỡng được chú ý trong những năm gần đây Các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu ứng đáng tin cậy của chúng trong việc phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan.Theo các nghiên cứu dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh

lý học cụ thể trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh [6]

Các catechin được tìm thấy nhiều trong hạt nho, trà, ca cao, có tác dụng chống

oxy hóa và có hiệu quả ngăn ngừa ung thư [30]

Các tannin có nhiều trong rượu vang đỏ, trà và các loại hạt làm phát huy các tác

dụng sinh lý, chúng có thể làm giảm áp lực máu, thúc đẩy đông máu, giảm nồng độ lipit trong huyết thanh, điều chỉnh sự đáp ứng miễn dịch và ngăn ngừa hoại tử gan [10, 30]

Các isoflavon, genistein và daidzein (được tìm thấy trong đậu nành và có ảnh

hưởng tốt đến xương ở phụ nữ mãn kinh, cùng với một số tác dụng nội tiết tốt [30]

Các procyanidin có nồng độ cao trong rượu vang đỏ, nho và hạt nho, ca cao,

nam việt quất, táo, có tác dụng chống viêm và có ảnh hưởng rất tốt đến hệ thống mạch máu Chất này cũng được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm để ngăn chặn quá trình oxy hóa của các thành phần trong thực phẩm [30]

Một stilben, resveratrol là một polyphenol đặc biệt, có tiềm năng chống ung thư

và chống lão hóa [30]

Các quercetin (đại diện chính của lớp flavonol, chứa nhiều trong hành tây, táo,

rượu vang đỏ, bông cải xanh, trà) ức chế chất sinh ung thư và có tác dụng chống oxy hóa của huyết tương trong cơ thể [30]

1.1.4 Phương pháp chiết và phân lập các hợp chất phenolic

1.1.4.1 Phương pháp chiết

Chiết là một trong những bước quan trọng nhất trong tiền xử lý mẫu nghiên cứu,

là các quy trình được sử dụng nhiều nhất do sự dễ sử dụng, hiệu quả và khả năng áp dụng rộng [8] Nói chung, hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ phân cực khác nhau, thời gian chiết và nhiệt độ, tỷ lệ mẫu và dung môi cũng như thành phần hóa học và các đặc tính vật lý của các mẫu Độ tan của các phenolic được quyết định bởi bản chất hóa học của mẫu thực vật, cũng như độ phân cực của các dung môi được sử dụng Các nguyên liệu thực vật có thể chứa các hợp chất phenolic từ các hợp chất đơn giản (ví dụ: các axit phenolic, các anthocyanin) đến các chất được polymer hóa cao (ví dụ: các tannin ở các lượng khác nhau) Hơn thế nữa các hợp chất phenolic cũng có thể liên kết với các thành phần thực vật khác như cacbohydrat và các protein

Do đó phụ thuộc vào hệ dung môi được sử dụng trong khi chiết, một hỗn hợp các hợp chất phenolic tan trong dung môi sẽ được chiết khỏi nguyên liệu thực vật Hỗn hợp này

có thể chứa các chất phi phenolic như: đường, các tecpen, các chlorophyll, các axit hữu

cơ và các chất béo [11, 25]

1.1.4.1.1 Chiết bằng dung môi

Các phương pháp chiết các hợp chất phenolic đơn giản (axit benzoic, andehit bezoic, axit cinnamic và catechin) từ các nguyên liệu rắn chủ yếu được ngâm chiết với các dung môi hữu cơ Hiệu suất chiết phụ thuộc vào dạng dung môi với các độ phân cực khác nhau, thời gian chiết và các đặc trưng vật lý của mẫu chiết Ánh sáng, không khí và nhiệt độ là các yếu tố thúc đẩy các phản ứng thoái biến

Các dung môi như: etanol, metanol, propanol, aceton, etyl acetat, và sự kết hợp của các dung môi này với tỷ lệ khác nhau của nước cũng được sử dụng để chiết các hợp chất phenolic Nói chung, chiết dung môi được sử dụng ở độ phòng để tránh sự thoái biến của các hợp chất phenolic; nhiều nghiên cứu sử dụng nhiệt độ khoảng 20-

40oC Các hợp chất phenolic bị thủy phân ở nhiệt độ 80-95ºC (sự thủy phân axit) hoặc 45ºC (sự thủy phân bazơ)

Các anthocyanin thường được chiết từ nguyên liệu thực vật với một dung môi hữu cơ được axit hóa, phổ biến nhất là metanol Hệ dung môi này phá hủy các màng tế bào, hòa tan đồng thời cả các anthocyanin và ổn định chúng Tuy nhiên, axit có thể đem lại sự thay đổi dạng gốc của các anthocyanin bằng cách phá vỡ các phức của chúng với các kim loại và các sắc tố [31]

Việc thu hồi các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực vật cũng bị ảnh hưởng bởi thời gian chiết và nhiệt độ, thể hiện tác dụng của sự hòa tan và sự thoái hóa chất phân tích do quá trình oxy hóa Tăng nhiệt độ chiết có thể thúc đẩy quá trình hòa tan chất phân tích bằng cách tăng cả độ tan và tốc độ truyền khối Ngoài ra, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi được giảm xuống ở nhiệt độ cao hơn, giúp các dung môi tiếp cận được các mẫu chiết, cải thiện tỷ lệ chiết Tuy nhiên, các hợp chất phenolic có thể dễ dàng bị thủy phân và oxy hóa Thời gian chiết lâu dài và nhiệt

độ cao làm tăng khả năng của quá trình oxy hóa các hợp chất phenolic, giảm sản lượng phenol trong các chất chiết xuất Ví dụ, thông thường chiết và cô đặc các anthocyanin thường được tiến hành ở nhiệt độ 20-50°C, vì nhiệt độ cao hơn 70oC đã chứng minh là gây ra sự thoái biến nhanh các anthocyanin Vì vậy, các yếu tố này đóng vai trò quan trọng để lựa chọn phương pháp chiết hiệu quả và duy trì sự ổn định của các hợp chất phenolic [11]

1.1.4.1.2 Chiết pha rắn (SPE) [11, 26]

Chiết pha rắn (SPE) là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu trong phân tích ngày càng hữu ích Với SPE, những vấn đề liên quan đến chiết hai pha lỏng (LLE), chẳng hạn như sự

phân tách không hoàn toàn, độ thu hồi thấp, sử dụng và loại bỏ lượng lớn, dung môi hữu cơ đắt tiền có thể tránh được, mặc dù chi phí của các thiết bị cần thiết cho SPE cao hơn so với LLE Kỹ thuật này thường được sử dụng nhất để chuẩn bị các mẫu lỏng và các chất phân tích bay hơi hoặc không bay hơi, nhưng cũng có thể được sử dụng với chất rắn được chiết trước vào các dung môi Các kỹ thuật SPE đa dạng với nhiều loại chất hóa học, các chất hấp phụ, và kích thước, do đó cần thiết để lựa chọn sản phẩm SPE phù hợp cho mỗi ứng dụng và mẫu chiết Phân tích SPE đã được thử nghiệm để xác định các hợp chất phenolic trong nho, rượu vang và các đồ uống Trường hợp chiết các hợp chất phenolic từ các mẫu dầu ô-liu cũng đã được nghiên cứu rộng rãi

1.1.4.1.3 Chiết chất lỏng siêu tới hạn (SFE) [4, 19, 24]

Thông thường, các hợp chất phenolic được chiết từ các mẫu thực vật bằng phương pháp SPE kết hợp các kỹ thuật khác, chẳng hạn chiết chất lỏng siêu tới hạn (SFE) SFE là một kỹ thuật mới cho ưu điểm hơn so với phương pháp truyền thống, như sử dụng nhiệt độ thấp, giảm tiêu thụ năng lượng và cho chất lượng sản phẩm cao

do không dùng dung môi trong pha hòa tan.Tuy nhiên, kỹ thuật này được áp dụng cho các hợp chất phân cực thấp hoặc trung bình SFE thường được mô tả để chiết các polyphenol, các đặc điểm chính của phương pháp này là cần các tỷ lệ phần trăm cao của các chất biến cải hữu cơ, điều này có nghĩa rằng quá trình này xảy ra trong các điều kiện dưới tới hạn

SFE do đặc điểm đặc biệt của nó, như điều kiện tới hạn (31,1ºC và 73,8 MPa) và sẵn

có Đây là phương pháp không độc hại, không dễ cháy nổ và bền hóa

hợp chất phenolic vì CO2 phân cực thấp hơn so với hầu hết các phenol

Thông thường, quá trình chiết này có các bước sau: mẫu được nạp lên trên chất hấp phụ của cột SPE và các cột này được lắp vào các bộ phận chiết SPE/SFE Các

chất lỏng siêu tới hạn được sử dụng, có thể là cacbon dioxit, phải đi qua các cột SPE được đổ đầy mẫu đã được thủy phân Do đó, các chất phân tích (các hợp chất phenolic)

bị giữ lại toàn lượng bởi một dung môi bẫy (ví dụ: metanol) ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (các dung môi bẫy được làm lạnh tự nhiên trong suốt quá trình chiết bởi sự giãn nở CO2) Cuối cùng, các dịch chiết được cô quay kiệt, hòa tan trong các pha động, và được bơm trực tiếp vào hệ thống HPLC/ESI-MS

1.1.4.1.4 Chiết lỏng dưới áp suất nén (PLE) [15,18]

Chiết lỏng dưới áp suất nén (PLE) sử dụng các dung môi hữu cơ ở các áp suất cao và nhiệt độ trên điểm sôi bình thường của chúng Đây là phương pháp hiện đại mới nhất để phân lập riêng chất phân tích từ các mẫu rắn Nói chung, với LLE, một mẫu rắn được nạp vào bộ phận chiết bằng thép không gỉ và được chiết với một dung môi thích hợp dưới nhiệt độ cao (40-200ºC) và áp lực (5-300 psi) trong một thời gian ngắn (5-15 phút) Các dịch chiết được gộp vào một bình thu mẫu bằng một loại khí nén

Qui trình được mô tả bởi Alonso-Salces và cộng sự, dựa trên sự chiết polyphenol từ các mẫu táo PLE đã được chứng minh là một phương pháp chiết hiệu quả để phân lập các polyphenol và nhiệt độ cao đã được sử dụng để đẩy nhanh quá trình chiết

1.1.4.1.5 Chiết bằng vi sóng (MAE) [5, 27]

Công nghệ vi sóng thường được biết đến với việc sử dụng để xử lý nhiệt Ví dụ,

nó được sử dụng như một quá trình nhiệt cho các sản phẩm trái cây thương phẩm để đạt được sự khử trùng nhanh và êm dịu của các sản phẩm này Đồng thời, vi sóng được

sử dụng để xác định độ ổn định của hàm lượng polyphenol sau xử lý Công nghệ này cũng được sử dụng để tăng quá trình làm khô trong rượu vang và các mẫu nho tươi, cải thiện sự tiền xử lý và là qui trình hữu ích để kiểm tra các hợp chất phenolic

Gần đây, phương pháp chiết bằng vi sóng (MAE), còn được gọi là quá trình vi sóng hỗ trợ (MAP), đã được áp dụng trong việc phát triển các phương pháp chiết các

hợp chất hữu cơ từ đất, trầm tích, hạt giống, và các mẫu thực phẩm Các nghiên cứu này cho thấy chiết hiệu quả hơn khi năng lượng lò vi sóng được sử dụng Nghiên cứu của Sutivisedsak và cộng sự, đã chứng minh tiện ích của vi sóng trong xác định hàm lượng phenolic trong tám loại đậu thông thường, sử dụng phương pháp đo màu Folin-Ciocalteau

1.1.4.1.6 Chiết siêu âm (UAE) [8, 18, 32]

Bức xạ siêu âm là một trợ giúp mạnh mẽ các bước khác nhau của quá trình phân tích Năng lượng này giúp nhiều trong việc xử lí các mẫu rắn vì nó làm dễ dàng và tăng tốc độ các quá trình chiết các hợp chất hữu cơ và vô cơ, đồng nhất và nhiều ứng dụng khác Ví dụ, các hệ thống chiết siêu âm đã được sử dụng rộng rãi để chiết xuất capsaicinoid trong ớt nóng

Chiết bằng siêu âm (UAE) được cho là một trong các kỹ thuật chiết đơn giản bởi

vì nó dễ thực hiện bằng các thiết bị thông thường trong phòng thí nghiệm Trong phương pháp này, mẫu được nghiền nát trộn với dung môi thích hợp và được đặt vào bể siêu âm, nơi mà nhiệt độ và thời gian chiết định

Các ứng dụng của chiết siêu âm (UAE) trong công nghệ chế biến thực phẩm dễ cho việc chiết các thành phần từ các nguyên liệu thực vật Hiệu suất cao đạt được trong các qui trình UAE là quan tâm lớn nhất từ khía cạnh công nghiệp, do công nghệ UAE chỉ là một bước thêm vào qui trình đã có với sự thay đổi tối thiểu, sử dụng được chiết nước, giảm lượng dung môi sử dụng và rút ngắn thời gian chiết Sử dụng siêu âm cho các nguyên liệu chiết thô đắt tiền là sự thay thế kinh tế các phương pháp chiết truyền thống, là một yêu cầu phát triển của công nghiệp Siêu âm có thể tăng cường quá trình chiết hiện có và cho phép chiết được các polyphenol và carotenoid trong cả hai hệ thống chiết dịch nước và dung môi Các thử nghiệm chiết hỗ trợ siêu âm đã chứng minh là cải tiến được hiệu suất chiết từ 6 đến 35%

1.1.4.2 Phương pháp phân lập và tinh chế

Các phần chiết thực vật thô thường chứa một lượng lớn các hợp chất cacbohydrat hoặc nguyên liệu lipoid và hàm lượng của các hợp chất phenolic trong phần chiết thực vật thô có thể thấp Để cô đặc và có được phân đoạn giàu polyphenol, qui trình bao gồm: chiết lần lượt hoặc phân bố hai pha lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) dựa trên độ phân cực và axit thường được sử dụng Nói chung, việc loại bỏ nguyên liệu lipoid có thể đạt được bằng cách rửa phần chiết thô với các dung môi không phân cực như hexan, diclometan, hoặc cloroform

Trong quá trình phân lập và tinh chế SPE được sử dụng để loại bỏ các hợp chất không phenolic như các đường và axit hữu cơ SPE đang trở thành phổ biến vì là kỹ thuật nhanh, nhạy và kinh tế và vì các cột và đĩa SPE với các chất hấp phụ khác nhau

có thể được sử dụng Ngoài ra, kỹ thuật này có thể được tự động hóa Các cột C18 đã được sử dụng rộng rãi nhất trong phân tách các hợp chất phenolic Sau khi các mẫu dung dịch được đưa qua các cột C18 đã được ổn định trước, các cột được rửa bằng nước axit để loại bỏ các đường, axit hữu cơ và các thành phần tan trong nước khác Các polyphenol sau đó được rửa giải bằng metanol tuyệt đối hoặc dung dịch nước aceton Phân tách tiếp các hợp chất phenolic đạt được bằng cách điều chỉnh pH của mẫu cũng như độ pH và độ phân cực của các hệ dung môi Ví dụ, Pinelo và cộng sự đã điều chỉnh độ pH của mẫu rượu vang loại ancol đến pH 7.0 và rửa giải hỗn hợp các axit phenolic với nước trong phân đoạn đầu [28] Theo bước này, cột C18 được rửa axit với dung dịch HCl 0,01M và các phenol không polyme như các catechin, anthocyanin, và flavonol được rửa giải với etyl acetat Cuối cùng, một hỗn hợp aceton, nước và metanol được sử dụng để rửa giải các phenol dạng polyme

Các chất hấp phụ khác như Amberlite XAD-2, XAD-7, XAD-16, Oasis HLB [16,

20, 34] cũng đã được sử dụng để tinh chế các hợp chất phenolic trong các phần chiết thô hay của các mẫu rượu vang Sự so sánh một vài cột SPE bao gồm Amberlite, C8 silica gel, copolyme HLB, PH, ENV và MCX C18 silica gel để phân lập các hợp chất phenolic trong rượu vang ở nồng độ thấp cho thấy rằng phương pháp SPE với cột HLB

có độ nhạy cao hơn, độ thu hồi và khả năng nạp mẫu cao hơn cột C18 và cột HLB có thể là một sự thay thế tốt cho cột C18 để phân lập các hợp chất phenolic của rượu vang Sắc ký cột cũng đã được sử dụng để phân tách các phần chiết phenolic Mặc

dù phương pháp này thường tốn nhiều công sức và tiêu thụ dung môi nhưng nó tạo lượng lớn các phân đoạn tiếp theo cho sự phân lập và xác định các chất tinh khiết Các chất hấp phụ cột thường sử dụng là RP-C18, Toyopearl, LH-20 và với mức độ ít hơn nhựa polyamit [29] Etanol, metanol, aceton và nước là các dung môi rửa giải thường được sử dụng Đặc biệt, sự phân lập các proanthocyanidin (tannin ngưng tụ) thường xuyên được thực hiện bằng cột sắc ký Sephadex LH-20 [3, 12] Phần chiết thô được đưa lên và rửa giải bằng metanol hoặc etanol, chất không tannin sau đó rửa giải với aceton nước hoặc rượu-nước để nhận được các proanthocyanidin Sử dụng cột sắc ký LH-20, methanol thường được dùng hơn etanol để rửa giải các chất không tannin Hệ dung môi aceton-nước tốt hơn so với hệ dung môi etanol-nước để rửa giải các procyanidin từ cột, đặc biệt là các procyanidin dạng polyme Trong một số trường hợp,

hệ thống HPLC điều chế cũng đã được sử dụng để tinh chế mẫu polyphenol [2, 9]

1.1.4.3 Phân tích và xác định cấu trúc

Các polyphenol cho sự hấp thụ ở vùng UV và UV/VIS Do đó các phương tiện phổ biến nhất để phát hiện các hợp chất phenolic được ghép nối với sắc ký lỏng (LC)

là các đetectơ UV/VIS, PDA và UV-huỳnh quang PDA là phương pháp phổ biến nhất

vì nó cho phép quét phổ UV/VIS của tất cả các chất tan đi qua đetectơ, cung cấp thông tin của các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp như các phần chiết thực vật thô Các phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các hợp chất phenolic bao gồm: kỹ thuật điện hóa (ECD), điện lượng kế, PDA và phát hiện chuỗi điện tử (EAD) được kết nối online, kỹ thuật phát hiện phản ứng hóa học, phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Các kỹ thuật điện di bao gồm điện di mao quản (CE), vùng điện di mao quản (CZE), sắc ký điện động Mixen kết hợp với phổ UV và ít hơn sự nhận

dạng EC và MS cũng được sử dụng để phân tích các hợp chất phenolic [14]

Sơ đồ quy trình phân lập và phân tích các hợp chất phenolic từ nguyên liệu thực

vật được trình bày trong Sơ đồ 1.1

Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic

Làm khô không khí, làm khô đông lạnh Xay

Nghiền Đồng nhất

Xử lý thô

Ngâm chiết Chiết MAE UAE PFE (PLE/ASE, SWE, SFE)

Chiết

SPE Sắc ký cột

CCC

Phân lập

Tinh chế

Các thử nghiệm quang phổ kế: FD, F-C, … GL/LC/điện di với phân tích công cụ (UV/VIS, FLU, PDA, EAD, điện lượng kế, ECD, MS, NMR)

Phân tích

1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex Blume)

Chẹo lá phong còn có tên là Chẹo bông, tên khoa học là Engelhardtia spicata

Lesch ex Blume, thuộc họ Hồ đào (Juglandaceae)

Chẹo lá phong là cây gỗ lớn cao 10-20 m; cành non có lông hung Lá mang 9-17

lá chét dài 11,5-22 cm, rộng 5-6 cm, không cân xứng, mép nguyên, gân phụ 13-15 cặp lồi trên cả hai mặt Hoa đơn tính cùng gốc; cụm hoa dài 11-15 cm; hoa đực có 6-

13 nhị; hoa cái có 4 lá đài, vòi có 2-4 đầu nhuỵ Chùm mang quả dài 15-30 cm; quả

bế cao 3mm, dầy lông phún; cánh với 3 thuỳ dài 2,5-4,5 cm

Chẹo lá phong sống chủ yếu ở phía nam châu Á từ bắc Ấn Độ, đến Inđonexia, Philipin và Việt Nam Cây mọc ở rừng thứ sinh và rừng thông ở độ cao 1000-2000 m khắp nước ta

Ở nước ta cũng như ở Ấn Độ, người ta dùng vỏ để duốc cá Ở Ấn Độ, nhựa vỏ quả cũng được sử dụng trong Y học dân gian

Hình 1.3: Cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesch ex Blume, Juglandaceae )

1.2.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi

2-hydroxymetyl-1,4-naphtoquinon (8), 5,8-dihydroxy-4-methoxy-1-tetralon (9), sitostenon (10), docosyl trans-ferulat (11), tricosyl trans-ferulat (12), tetracosyl trans- ferulat (13), hexacosyl trans-ferulat (14), axit 3-epi-betulinic (15), acetovanillon

β-(16), vanillin (17), 4-hydroxybenzanđehit (18), 2,6-dimetoxy-1,4-benzoquinon (19), 1-methoxynaphtalen (20), 2-(4-hydroxyphenyl) etanol (21), axit cinnamic (22), axit 3,4,5-trimethoxybenzoic (23), axit vanilic (24) đã được phân lập từ rễ cây

Engelhardia roxburghiana Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất

này đã chứng tỏ tác dụng kháng lao của (−)-4-hydroxy-1-tetralon, 3-methoxyjuglon

engelhardion và engelharquinon (1) đối với Mycobacterium tuberculosis 90-221387

1 2

O O

OCH3

OCH3

O

O H

CH3

C

H3

3 4

Cây Engelhardtia chrysolyris Hance có lá khô được sử dụng trong Y học cổ

và taxifolin đã được phân lập từ cây thuốc này [13]: Một nghiên cứu khác đã phân lập

được 2 axit tritecpenoid, axit betulinic và axit ursolic từ cây Engelhardtia serrata Bl

bằng sự phân lập định hướng hoạt tính gây độc tế bào và gây apoptosis trên dòng tế bào K562 [22]

Một số hợp chất đã được thông báo từ cây Chẹo lá phong (Engelhardia spicata

Lesch ex Blume, Juglandaceae) là β-sitosterol, axit 9Z,12Z-octadecadienoic,

-glucopyranosid, axit gallic, D-glucose và myo- hoặc muco-inositol (Gyanda K và

cộng sự, số liệu chưa công bố).

Cho đến nay chưa có các nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ lá cây

Chẹo lá phong (Engelhardia spicata Lesch ex Blume, Juglandaceae) của Việt Nam