nghiên cứu phân lập các hợp chất phenolic từ một số thực vật việt nam

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ QUỲNH HOA NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT PHENOLIC TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 1 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU………………………………………………………………………………1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN…………………………………………………………….3 1.1 Các hợp chất phenolic thực vật ……………………………………………… 3 1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật………………………………3 1.1.2 Phân loại các hợp chất phenolic…………………………………………….3 1.1.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic…………………………….9 1.1.4 Phƣơng pháp chiết và phân lập các hợp chất phenolic………………….10 1.1.4.1 Phƣơng pháp chiết…………………………………………………….11 1.1.4.2 Phƣơng pháp phân lập và tinh chế………………………………… 14 1.1.4.3 Định tính và xác định cấu trúc………………………………………16 1.2 Giới thiệu về cây Chẹo lá phong (Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume)… 19 1.2.1 Đặc điểm thực vật học…………………………………………………….19 Nguyn Th Qunh Hoa Lun vn thc s khoa hc 2 1.2.2 Ni sng v thu hỏi 19 1.2.3 Cụng dng ca cõy Cho lỏ phong 19 1.1.4 Mt s nghiờn cu v thnh phn húa hc v hot tớnh sinh hc ca chi Engelhardtia (Juglandaceae).21 Ch-ơng 2 : NHIM V V PHNG PHP NGHIấN CU23 2.1 Nhiệm vụ của Luận văn 23 2.2 Ph-ơng pháp nghiên cứu.24 2.2.1 Các ph-ơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 24 2.2.2 Các ph-ơng pháp xác định cấu trúc 24 Chng 3 : KT QU V THO LUN 26 3.1 i tng nghiờn cu 26 3.2 Quy trỡnh chit cỏc phn chit t lỏ cõy Cho lỏ phong 26 3.3 Phõn tỏch phn chit etyl axetat (EG3).29 3.4 Phõn tỏch phn chit nc (EG4) 31 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 3 3.5 Cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập………………………………………….33 Chƣơng 4: THỰC NGHIỆM……………………………………………………….38 4.1 Thiết bị và hóa chất…………………………………………………………… 38 4.2 Nguyên liệu thực vật…………………………………………………………….39 4.3 Điều chế các phần chiết từ cây Chẹo lá phong……………………………… 39 4.4 Phân tích và phân tách phần chiết etyl axetat (EG3)……………………… 40 4.4.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết etyl axetat (EG3)……………… 40 4.4.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (EG3)………………………………….40 4.5 Phân tách sắc kí cột phần chiết nƣớc (EG4)………………………………… 41 4.5.1 Phân tích sắc ký lớp mỏng phần chiết nƣớc (EG4)…………………… 41 4.5.2 Phân tách phần chiết nƣớc (EG4)……………………………………… 42 4.6 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đƣợc phân lập…………… 43 KẾT LUẬN………………………………………………………………………….46 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….47 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 4 CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN CC (Column Chromatography): Sắc ký cột thường dưới trọng lực dung môi 13 C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT (Distortionless Enhancement by Polarition Tranfer): Phổ DEPT ESI-MS (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry): Phổ khối lượng phun bụi điện tử FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh 1 H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton LC (Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng Mini-C (Mini-column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 5 MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ H×nh 1.1: Cấu trúc minh häa của stilben và lignin H×nh 1.2: Cấu trúc minh häa của flavonoid, axit phenolic và tannin H×nh 1.3: Cây Chẹo l¸ phong ( Engelhardtia spicata Lesh ex. Blume, Juglandaceae ) B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên Bảng 4.1: Hiệu suất điều chế các phần chiết từ lá cây Chẹo lá phong Bảng 4.2: Phân tích phần chiết etyl axetat (EG3) bằng TLC Bảng 4.3: Phân tích phần chiết nước (EG4) bằng TLC Sơ đồ 1.1: Quy trình chung phân lập các hợp chất phenolic Sơ đồ 3.1: Điều chế các phần chiết hữu cơ từ nguyên liệu thực vật Sơ đồ 3.2: Phân tách sắc kí phần chiết etyl axetat (EG3) Sơ đồ 3.3: Phân tách sắc kí phần chiết nước (EG4) Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 6 MỞ ĐẦU Các hợp chất phenolic thực vật như các axit phenolic, các flavonoid và các flavonoid polyme đang ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm do tính chất chống oxi hóa, tác dụng phòng ngừa ung thư và các bệnh liên quan đến tim mạch của các hợp chất phenolic. Các nghiên cứu (hóa học, dược lý học, lâm sàng) đã phần nào lý giải được mối liên quan giữa sức khỏe con người và việc tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm giàu các hoạt chất phenolic thiên nhiên. Các nghiên cứu theo hướng phát hiện các hợp chất có tác dụng dự phòng ung thư (cancer chemoprevention) đã thiết lập được một hướng ứng dụng mới của các hợp chất phenolic. Các hợp chất phân tử nhỏ này thường là các chất chống oxi hóa và có thể làm giảm sự phát triển của bệnh ung thư bằng cách ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư qua các cơ chế ngăn chặn sự hư hại ADN hoặc ức chế hoặc đảo ngược quá trình phát triển của các tế bào tiền ác tính đã có sự hư hại ADN. Một chương trình nghiên cứu các tác nhân dự phòng và chống ung thư từ nguồn thực vật Việt Nam của chúng tôi đã được xây dựng trên cơ sở lựa chọn các nhóm hợp chất có các cấu trúc tiềm năng; trong chương trình này các hợp chất phenolic có tác dụng dự phòng ung thư đã được phát hiện với tỷ lệ cao. Chương trình nghiên cứu này cũng đã xác định một thách thức được đặt ra cho các nhà hóa học các hợp chất thiên nhiên là cần có các qui trình phân lập hiệu quả các nhóm cấu trúc cần thiết từ các nguồn nguyên liệu thực vật, các qui trình này phải dễ được triển khai tiếp cho các qui mô công nghệ phân lập lượng lớn hoạt chất một khi các hoạt chất hữu ích được phát hiện. Các hợp chất phenolic chiếm một vị trí đáng kể trong số các nhóm hợp chất thiên nhiên có tác dụng dự phòng ung thư; chúng có cấu trúc đa dạng và xuất hiện phổ biến trong giới thực vật. Việc phân lập các hợp chất này cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học có thể được thực hiện bằng các phương pháp chiết và sắc ký điều chế; tuy nhiên phổ rộng độ tan của các hợp chất này cho thấy mỗi qui trình phân lập nên được giới hạn vào một nhóm hợp chất phenolic. Các sàng lọc sắc ký lớp mỏng Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 7 sơ bộ đã xác định được nhóm hợp chất phenolic trong các phần chiết từ các loài cây: Alnus nepalensis D. Don (Betulaceae), Betula alnoides Buch. Ham. ex D. Don (Betulaceae) và Engelhardtia spicata Lesch. ex. Blume (Juglandaceae). Mục tiêu nghiên cứu của luận văn này là xây dựng một qui trình chiết các phần chiết giàu các hợp chất phenolic và phân lập sắc ký các hợp chất phenolic, sau đó cấu trúc chính xác của các các hợp chất được phân lập sẽ được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại. Qui trình này đã được áp dụng thành công để phân lập các hợp chất phenolic thành phần chính từ lá cây Chẹo lá phong (E. spicata Lesch. ex. Blume). Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 8 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất phenolic thực vật 1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [6] Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxy. Chúng được phân bố rộng rãi trong giới thực vật và là các sản phẩm trao đổi chất phong phú của thực vật. Hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được tìm thấy, từ các phân tử đơn giản như các axit phenolic đến các chất polyme như tannin. Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt, cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật. Chúng có ở khắp các bộ phận của cây và vì vậy, chúng cũng là một phần không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Các hợp chất phenolic là thành phần phổ biến của thức ăn thực vật (trái cây, rau, ngũ cốc, ô liu, các loại đậu, sô-cô-la, vv) và đồ uống (trà, cà phê, bia, rượu, vv), và góp phần tạo nên các đặc tính cảm quan chung của thức ăn thực vật. Ví dụ, các hợp chất phenolic làm tăng vị đắng, sự se của trái cây và nước trái cây, bởi vì sự tương tác giữa các hợp chất phenolic, chủ yếu là các procyanidin và glycoprotein trong nước bọt. Các anthocyanin, một trong sáu phân nhóm của một nhóm polyphenol thực vật lớn được gọi là các flavonoid, tạo màu da cam, đỏ, xanh và màu tím của nhiều loại trái cây và rau quả như táo, quả, củ cải và hành tây. Các hợp chất phenolic được biết đến như là những hợp chất quan trọng nhất ảnh hưởng đến hương vị và sự khác biệt màu sắc giữa các loại rượu vang trắng, hồng và đỏ, các hợp chất này phản ứng với oxy và có ảnh hưởng đến việc bảo quản, lên men và cất giữu rượu vang. 1.1.2 Phân loại các hợp chất phenolic [6, 10] Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Luận văn thạc sĩ khoa học 9 Các hợp chất phenolic có cấu trúc rất đa dạng và có thể được chia thành 10 nhóm chính được đưa ra trong Bảng 1.1. B¶ng 1.1: Phân loại các hợp chất phenolic thiên nhiên Số nguyên tử cacbon Nhóm Cấu trúc cơ bản Nguồn gốc thực vật C 6 Phenol đơn giản Benzoquinon OH O O C 6 -C 1 Axit benzoic COOH Cranberry, ngũ cốc C 6 -C 2 Acetophenon Axit phenylaxetic CH 3 O COOH Táo, mơ, chuối, súp lơ C 6 -C 3 Axit cinnamic Phenylpropen Coumarin COOH CH 2 O O Cà rốt, cam, quýt,cà chua, rau bina, đào, ngũ cốc, lê, cà tím Cà rốt, cần tây, cam chanh, rau mùi tây [...]... isoflavon trong u tng Cỏc axit phenolic cú th c chia thnh hai nhúm: nhúm cỏc dn xut ca axit benzoic chng hn nh axit gallic v nhúm cỏc dn xut ca axit cinnamic nh axit coumaric, axit caffeic v axit ferulic Axit caffeic l mt axit phenolic ph bin nht, cha trong nhiu loi trỏi cõy v rau qu, thng c este húa vi axit quinic trong axit chlorogenic, l mt hp cht phenolic ch yu trong c phờ Mt axit phenolic ph bin khỏc l... ny ó c phỏt hin cú cha cỏc hp cht phenolic trong mt nghiờn cu sng lc sc ký cỏc loi thc vt Vit Nam bc u ỏnh giỏ kh nng s dng cỏc hp cht phenolic ca loi cõy ny mc tiờu ca lun vn ny l nghiờn cu phõn lp cỏc hp cht phenolic cú trong lỏ cõy Cho lỏ phong Lun vn ny cú cỏc nhim v sau: 35 Nguyn Th Qunh Hoa Lun vn thc s khoa hc 1) Xõy dng quy trỡnh chit v phõn lp cỏc hp cht phenolic phõn cc t lỏ cõy Cho lỏ phong;... s dng phõn tỏch cỏc hp cht phõn cc trong phn chit nc theo c ch sc ký phõn b 4) Sc ký ct (CC) trờn pha Sephadex LH-20 c s dng phõn tỏch cỏc hp cht phenolic theo c ch sc ký loi tr theo kớch thc phõn t 5) Ph-ơng pháp kết tinh để phân lập và tinh chế các chất rắn 2.2.2 Cỏc phng phỏp xỏc nh cu trỳc 35 Nguyn Th Qunh Hoa Lun vn thc s khoa hc Cu trỳc ca cỏc hp cht c phõn lp c xỏc nh bng cỏch kt hp cỏc phng... cỏc nghiờn cu phõn lp cỏc hp cht phenolic t lỏ cõy Cho lỏ phong (Engelhardia spicata Lesch ex Blume, Juglandaceae) ca Vit Nam 35 Nguyn Th Qunh Hoa Lun vn thc s khoa hc Chng 2 NHIM V V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 Nhim v ca Lun vn Cỏc hp cht phenolic c phõn b rng rói trong gii thc vt Chỳng cú nhiu b phn ca cõy v l mt phn khụng th thiu trong ch n ung ca con ngi Cỏc hp cht phenolic gúp phn vo cht lng dinh... khụng ng nht c Lu, qu to thnh t cỏc axit phenolic mõm xụi v ng n (C6-C3)n Lignin Cỏc polime thm liờn kt Cỏc hp cht phenolic thc vt bao gm cỏc stilben, cỏc lignan (Hỡnh 1.1), cỏc axit phenolic, cỏc flavonoid v cỏc tannin (Hỡnh 1.2) Hỡnh 1.1: Cu trỳc minh ha ca stilben v lignan 11 Nguyn Th Qunh Hoa Lun vn thc s khoa hc Hình 1.2: Cu trỳc minh họa ca flavonoid, axit phenolic v tannin 7 Nguyn Th Qunh Hoa Lun... dng Cỏc nguyờn liu thc vt cú th cha cỏc hp cht phenolic t cỏc hp cht n gin (vớ d: cỏc axit phenolic, cỏc anthocyanin) n cỏc cht c polymer húa cao (vớ d: cỏc tannin cỏc lng khỏc nhau) Hn th na cỏc hp cht phenolic cng cú th liờn kt vi cỏc thnh phn thc vt khỏc nh cacbohydrat v cỏc protein Do ú ph thuc vo h dung mụi c s dng trong khi chit, mt hn hp cỏc hp cht phenolic tan trong dung mụi s c chit khi nguyờn... mụi hu c cú phõn cc tng dn Theo phng phỏp chit dung mụi ny, sau khi hp cht phenolic c chit t nguyờn liu thc vt vo metanol, chit hai pha lng s tỏch cỏc hp cht lipoid, khụng phi phenolic vo cỏc dung mụi hu c n-hexan v iclometan, phn chit etyl axetat cha cỏc hp cht phenolic cú phõn cc trung bỡnh v phn chit nc cha cỏc hp cht phenolic phõn cc cao hn Cỏc hp cht ny l i tng nghiờn cu phõn lp ca lun vn ny... etanol, metanol, propanol, aceton, etyl acetat, v s kt hp ca cỏc dung mụi ny vi t l khỏc nhau ca nc cng c s dng chit cỏc hp cht phenolic Núi chung, chit dung mụi c s dng phũng trỏnh s thoỏi bin ca cỏc hp cht phenolic; nhiu nghiờn cu s dng nhit khong 2040oC Cỏc hp cht phenolic b thy phõn nhit 80-95C (s thy phõn axit) hoc 45C (s thy phõn baz) Cỏc anthocyanin thng c chit t nguyờn liu thc vt vi mt... ú cn thit la chn sn phm SPE phự hp cho mi ng dng v mu chit Phõn tớch SPE ó c th nghim xỏc nh cỏc hp cht phenolic trong nho, ru vang v cỏc ung Trng hp chit cỏc hp cht phenolic t cỏc mu du ụ-liu cng ó c nghiờn cu rng rói 1.1.4.1.3 Chit cht lng siờu ti hn (SFE) [4, 19, 24] Thụng thng, cỏc hp cht phenolic c chit t cỏc mu thc vt bng phng phỏp SPE kt hp cỏc k thut khỏc, chng hn chit cht lng siờu ti hn... hp cỏc hp cht phenolic tan trong dung mụi s c chit khi nguyờn liu thc vt Hn hp ny cú th cha cỏc cht phi phenolic nh: ng, cỏc tecpen, cỏc chlorophyll, cỏc axit hu c v cỏc cht bộo [11, 25] 1.1.4.1.1 Chit bng dung mụi Cỏc phng phỏp chit cỏc hp cht phenolic n gin (axit benzoic, andehit bezoic, axit cinnamic v catechin) t cỏc nguyờn liu rn ch yu c ngõm chit vi cỏc dung mụi hu c Hiu sut chit ph thuc vo dng . TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất phenolic thực vật 1.1.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic thực vật [6] Các hợp chất phenolic là các hợp chất có một hoặc nhiều vòng thơm với một hoặc nhiều. nghiên cứu của luận văn này là xây dựng một qui trình chiết các phần chiết giàu các hợp chất phenolic và phân lập sắc ký các hợp chất phenolic, sau đó cấu trúc chính xác của các các hợp chất. các hợp chất phenolic từ các hợp chất đơn giản (ví dụ: các axit phenolic, các anthocyanin) đến các chất được polymer hóa cao (ví dụ: các tannin ở các lượng khác nhau). Hơn thế nữa các hợp chất