Nghiên Cứu Phân Lập Và Tuyển Chọn Giống Vi Sinh Vật Nội Sinh Từ Vùng Sinh Thái Đất Ngập Mặn Phục Vụ Cho Sản Xuất Nông Nghiệp Và Bảo Vệ Môi Trường

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA MÔI TRƯỜNG  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ VÙNG SINH THÁI ĐẤT NGẬP MẶN PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG Người thực Lớp Khóa Ngành Giáo viên hướng dẫn : ĐỖ MINH THU : MTC : 57 : KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG : TS NGUYỄN THỊ MINH Hà Nội - 2016 HỌC VIÊN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA MÔI TRƯỜNG  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ VÙNG SINH THÁI ĐẤT NGẬP MẶN PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP VÀ BẢO VỆ MÔI TRƯỜNG Người thực Lớp Khóa Chuyên ngành Giáo viên hướng dẫn Địa điểm thực tập : ĐỖ MINH THU : MTC : 57 : KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG : TS NGUYỄN THỊ MINH : HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Hà Nội - 2016 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan kết viết hoàn toàn chân thực chưa công bố nghiên cứu trước Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực i LỜI CÁM ƠN Trong trình học tập Học viện Nông nghiệp Việt Nam, giúp đỡ thầy cô, đoàn thể, đặc biệt môn Vi sinh vật – Khoa Môi trường tạo điều kiện, đến nay, em hoàn thành khóa học thực xong khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Nguyễn Thị Minh tận tình hướng dẫn em hoàn thành tốt nghiên cứu Cảm ơn thầy cô, anh chị Phòng thí nghiệm Bộ môn vi sinh – Khoa môi trường phòng thí nghiệm Jica – Khoa Quản lý đất đai tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, thầy cô gia đình giúp đỡ, động viên em suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Đỗ Minh Thu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i Em xin chân thành cảm ơn! i Em xin chân thành cảm ơn! ii Sinh viên thực ii Các chủng đánh giá tính đối kháng theo cặp theo phương pháp đường vuông góc Cross-Streak Các chủng vi sinh vật cấy thành cặp theo đường giao Nếu xuất vòng đối kháng (các chủng mọc cách nhau) chủng đối kháng phối trộn chúng vào chất mang .32 1.Agricultural Policies in Viet Nam 2015 80 http://www.oecd-ilibrary.org/agriculture-and-food/agricultural-policiesin-viet-nam-2015_9789264235151-en 80 thứ 6, 25/3/2016 80 thứ 6, 25/3/2016 85 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản lượng số loại lương thực giới (triệu tấn) .3 Bảng 1.2 Sản lượng gạo năm 2014 số quốc gia (triệu tấn) Bảng 1.3 Sản lượng số loại trồng chủ yếu năm 2015 Bảng 2.1 Thành phần môi trường phân giải xenlulo tinh bột 30 Bảng 2.2 Phương pháp xác định chất lượng dinh dưỡng vi sinh 33 Bảng 2.3 Các tiêu đánh giá đất trồng 33 Bảng 3.1 Diện tích loại đất huyện Giao Thủy 36 Bảng 3.2 Kết phân tích số tiêu đất mặn Giao Thủy 38 Bảng 3.3 Kết phân lập chủng vi sinh vật nội sinh .40 Bảng 3.4 Đánh giá khả phân giải xenlulo, phân giải lân tổng hợp IAA chủng vi sinh vật nội sinh 49 Bảng 3.5 Đánh giá khả chịu nhiệt chủng vi sinh vật 58 Bảng 3.6 Kết vòng phân giải tinh bột 62 Bảng 3.7 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật nội sinh tuyển chọn 69 Bảng 3.8 Chất lượng chế phẩm dinh dưỡng vi sinh 70 Bảng 3.9 Một số tiêu sinh trưởng trồng sau thí nghiệm 71 Bảng 3.10 Chất lượng đất trước sau thí nghiệm 71 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hoá hợp chất lân hữu thành muối H3PO4 24 Hình 3.1 Một số chủng vi sinh vật 47 nội sinh phân lập 47 Hình 3.2 Chủng LSH1 .47 Hình 3.3 Một số chủng vi sinh vật nội sinh giữ giống 47 3.3 Kết tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh 48 Hình 3.4 Vòng phân giải xenlulo số chủng vi sinh vật nội sinh 53 Hình 3.5 Vòng phân giải lân số chủng vi sinh vật nội sinh 54 Hình 3.6 Vòng phân giải lân chủng 8TDX 55 Hình 3.7 Một số chủng vi sinh vật nội sinh phân giải IAA cao làm đổi màu thuốc thử 56 Hình 3.8 Tính đối kháng số chủng vi sinh vật nội sinh 64 Hình 3.9 chủng giống vi sinh vật nội sinh tuyển chọn 65 Hình 3.10 Hình thái khuẩn lạc TDG1 66 Hình 3.11 Hình thái tế bào TDG1 66 Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc TDG4 .66 Hình 3.13 Hình thái tế bào TDG4 .66 Hình 3.14 Hình thái khuẩn lạc TDG5 66 Hình 3.15 Hình thái tế bào 3TDG5 66 Hình 3.16 Hình thái khuẩn lạc LSH1 67 Hình 3.17 Hình thái tế bào LSH1 67 Hình 3.18 Hình thái khuẩn lạc LXL3 67 Hình 3.19 Hình thái tế bào LXL3 67 Hình 3.20 Hình thái khuẩn lạc 6TSH3 .67 Hình 3.21 Hình thái tế bào TSH3 67 Hình 3.22 Hình thái khuẩn lạc TDX 68 Hình 3.23 Hình thái tế bào TDX .68 Hình 3.24 Hình thái khuẩn lạc Y ĐT3 68 Hình 3.25 Hình thái tế bào Y ĐT3 68 Hình 3.26 Cây trồng thí nghiệm sau 30 ngày 72 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CT1 CT2 FAO IAA : : : : Công thức Công thức Tổ chức Nông Lương Thế giới Indole-3-acetic acid v OECD : Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, phát triển nông nghiệp theo hướng thâm canh xen canh cao, với việc sử dụng ngày nhiều phân bón thuốc bảo vệ thực vật hóa học Đó số nguyên nhân làm cho đất đai ngày thoái hóa, dinh dưỡng bị cân đối, hệ vi sinh vật đất bị xáo trộn, tồn dư chất độc hại đất ngày cao nguồn bệnh tích lũy đất nhiều dẫn đến phát sinh loại dịch hại nghiêm trọng, khó dự báo trước (Cục Bảo vệ thực vật, 2014) Việc sử dụng chế phẩm sinh học phân hữu vi sinh có tầm quan trọng đặc biệt nước nông nghiệp Việt Nam, góp phần xây dựng nông nghiệp an toàn bền vững Tuy nhiên, tình hình sản xuất phân vi sinh Việt Nam chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất nông nghiệp quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện ổn định Vì vậy, việc nghiên cứu để hoàn thiện nâng cao chất lượng chế phẩm sinh học phân vi sinh cần thiết Vi sinh vật nội sinh vi sinh vật sống mô thực vật tìm thấy vùng rễ, thân, lá, thực vật, vi sinh vật nội sinh xem đối tượng quan trọng phân lập sàng lọc để làm giống cho sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho sản xuất nông nghiệp mà không ảnh hưởng đến môi trường sức khỏe cộng đồng Ở Việt Nam thiếu chủng vi sinh vật nội sinh phát huy tốt hiệu nhiều loại trồng điều kiện sinh thái khác Một số nghiên cứu vi sinh vật nội sinh loài phân lập dòng Burkholderia tropica khóm, vi khuẩn Azospirillium lipoferum Klebsiella pneumonia từ cỏ chăn nuôi, Rhizobium hay nấm rễ Arbuscular Mycorrhizae từ rễ đậu đỗ thảo Tuy nhiên, hầu hết dòng vi sinh vật nội sinh chưa đánh giá đầy đủ chưa ứng dụng thực tiễn Mặt khác, chế phẩm vi sinh sử dụng Việt Nam thường có tác dụng đơn lẻ việc phòng trừ sâu bệnh, cải tạo đất hay xử lý phế thải,….và tác dụng tổng hợp sản phẩm nước Đất mặn - Salic Fluvisols đất chứa nhiều muối hòa tan (1 – 1,5% hơn) Nhóm đất mặn Việt Nam có diện tích xấp xỉ 1.180.200ha (Viện Nông hóa thổ nhưỡng, 2001), chiếm khoảng 3,57% diện tích tự nhiên nước Nam Định tỉnh chịu tác động mạnh mẽ tượng xâm nhiễm mặn mực nước biển dâng cao, thu hẹp diện tích đất trồng lương thực, thực phẩm Diện tích đất mặn Nam Định 15.615,89 ha, chiếm 12,03% diện tích đơn vị đất 9,54% diện tích tự nhiên tỉnh Đất nhiễm mặn yếu tố gây khó khăn cho sinh trưởng phát triển nhiều loại trồng Tuy nhiên, vùng sinh thái đất mặn Nam Định lại có mức độ đa dạng thành phần loài cao loại trồng sinh vật hình thành đặc tính thích nghi với môi trường mặn (Phạm Văn Phong, 2015) Vì vậy, việc nghiên cứu vi sinh vật nội sinh vùng sinh thái đất mặn cần thiết với mục tiêu phát chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính sinh học cao phục vụ cho sản xuất nông nghiệp bảo vệ môi trường Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh có nguồn gốc địa từ đất mặn có tác dụng phân giải chuyển hóa chất hữu tạo dinh dưỡng dễ tiêu, chống chịu cao với điều kiện bất lợi, hạn chế bệnh hại, tăng cường sinh trưởng phát triển trồng,… phục vụ cho sản xuất nông nghiệp bảo vệ môi trường Thứ 2, 21/3/2016 19 Nguyễn Đình Mạnh, 1996, Hoá chất dùng Nông nghiệp ô nhiễm môi trường, NXB nông nghiệp 20 LV Moxolov,1987, Cơ sở sinh lý việc sử dụng phân khoáng - NXB khoa học kỹ thuật 21 Phạm Bích Ngân Đinh Xuân Thắng, Ảnh hưởng thuốc trừ sâu tới sức khỏe người phun thuốc, Tạp chí Phát Triển Khoa học Công nghệ, tập 9, số - 2006, trang 72 – 80 22 Lương Đức Phẩm Giáo trình Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp NXB Giáo dục Việt Nam, 2011 23 Phạm Văn Phong,Công tác bảo tồn đa dạng sinh học phát triển bền vững hệ sinh thái địa bàn tỉnh Nam Định http://moitruongviet.edu.vn/cong-tac-bao-ton-da-dang-sinh-hoc-va-phattrien-ben-vung-cac-he-sinh-thai-tren-dia-ban-tinh-nam-dinh/ Thứ 3, 22/3/2016 24 Trần Thanh Phong Cao Ngọc Điệp, 2012, Đánh giá khả cố định đạm vi sinh vật nội sinh đến suất, chất lượng trái khóm trồng huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ 25 Tổng cục Thống kê, Thông cáo báo chí tình hình kinh tế- xã hội năm 2015 https://www.gso.gov.vn/default.aspx? tabid=382&idmid=2&ItemID=15503 Thứ 3, 22/3/2016 26 Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuấn, 2003, Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh đơn chủng hay đa chủng ứng dụng cho số trồng, Báo cáo hội nghị CNSH toàn quốc 78 27 Phạm Văn Toản Phạm Bích Hiên, 2014, Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật phân giải lân Việt Nam http://iasvn.org/upload/files/S63W5SP9H4su%20dung%20vi%20sinh %20vat%20phan%20giai.pdf Thứ 3, 22/3/2016 28 Vũ Cao Thái,1999, Kết nghiên cứu khoa học 3, Kỷ niệm 30 năm thành lập Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, trang 64-65 29 Nguyễn Văn Tuyến, 2012, Ảnh hưởng hóa chất bảo vệ thực vật đến vi sinh vật đất trồng chè 79 Tài liệu tham khảo tiếng Anh Agricultural Policies in Viet Nam 2015 http://www.oecd-ilibrary.org/agriculture-and-food/agriculturalpolicies-in-viet-nam-2015_9789264235151-en thứ 6, 25/3/2016 Ahmad, F., I Ahmad, M S Khan 2005 Indole acetic acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan Turkish Journal of Biology 29: 29 -34 Baldani, J.I., L.V Baldani, L Seldin and J Dobereiner, 1986 Characterization of Herbaspirillum seropedicae ger nov a root associated N2 - fixing bacteria, Int J Syst Bacteriol, 36: 86-93 Barraquio, W.L., L Rerilla and K.J Ladha, 1997 Isolation of Endobacteria from wetland rice Plant and Soil, 194: 15-24 Bergey, 2009, Bergay manual’s of systermatic Bacteriology Second edition William B Whitman Springer, USA, p 19-21 Bilal, R., G Rarul G., A.J Qureshi and A.K Malik, 1987 Isolation and identification of a N2-fixing Zoogloea-forming bacterium from Kallar grass histonplane, J Appl Bacteriol, 62: 289-294 Boddey, R M , O C De Oliveira, S Urquiaga, V M Reis, F L Olivares, V L D Baldani and J Döbereiner 1995 Biological nitrogen fixation associated with sugar cane and rice: contributions and prospects for improvement Plant Soil 174: 195 – 209 Campbell I (1971) Comparison of Serological and Physiological Classification of the Genus Saccharomyces Journal of General Microbiology 3, p 189-198 Cattenlla, A.J., G P Hartel and J.J Fuhrmann, 1999 Screening for plant growth promoting rhizobacteri to promote eary soybean growth Soil Sci 80 Soc Am J, 61: 670-680 10 Cavalcante, V.A and J Döbereiner, 1988 A new acid-tolerant nitrogenfixing bacterium associated with sugarcane, Plant Soil, 108: 23-31 11 Chan, Y., L.W Barraquio and R Knowles, 1994 N2 - fixing Pseudomonads and related soil bacteria FEMS Microbiol Rev, 13: 95118 12 Costacurta, A., V Keijers and J Vanderleyden, 1994 Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene Mol Gen Genet, 243: 463-472 13 Cruz, L.M., M.E Souza , B.O Weber, I.J Baldani, J Dobereiner and O.F Pedrosa, 2001 16S Ribosomal DNA characterization of nitrogenfixing bacteria isolated from Banana (Musa spp.) and Pineapple (Ananas comosus (L.) Merril ), Appl Environ Microbiol, 67(5): 2357-2379 14 Döbereiner, J., 1974 Nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere In The biology of nitrogen fixation, ed A Quispel, Amsterdam, The netherlands: North Holland Publishing Company: 86-120 15 FAOSTAT, http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E, thứ 6, 25/3/2016 16 Germaine, K J , X Liu, G Garcia-Cabellos, J P Hogan, D Ryan, and D N Dowling 2006 Bacterial endophyte- enhanced phytoremediation of the organochlorine herbicide 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid FEMS Microbiol Ecol 57: 302 – 310 17 Glickmann, E., L Gardan, S Jacquet and Y Desseaux, 1998 Auxin Production is a common feature of most pathovars of Pseudomonas syringae Molecular Plant-of mineral phosphates: historical perspective and future prospects Microbe Interaction, 11: 156-162 81 18 Goris, J., D.P Vos, H.J Park, E Falsen and P Vandamme, 2004 Classification of the PCB and biphenyl-degrading strain LB400 and relative as Burkholderia xennovorans sp.nov., Int J Evol Microbiol, 54: 1677-1681 19 Hallmann, J 2001 Plant Interactions with Endophytic Bacteria In: Jeger, M.J and N.J Spence (Eds.) Biotic Interactions in Plant-Pathogen Associations CAB International, USA., pp: 87 - 119 20 Huang, J., X Sheng, L He 2010 Biodiversity of phosphate-dissolving and plant growth-promoting endophytic bacteria of two crops Acta Microbiologica Sinica, 50(6): 710 – 716 21 Hwangbo, H., D.R Park, W.Y Kim, S.Y Rim, H.K Park, H.T Kim, S.J Suh and Y K Kim, 2003 2-ketogluconic acid production and phosphate solubilization by Enterobacter intermedium, Cur Microbiol, 47: 87-92 22 Iniguez, A.L., Y Dong and E.W Triplett, 2004 Nitrogen fixation in wheat provided by Klebsilla pneumoniae 342 Mol Plant Microbe Interact, 17: 1078-1085 23 Khan, Z and L.S Doty, 2009 Characterization of bacterial endophytes of sweet potato plants Plant Soil DOI 10.1007 24 Kloepper, J.W., R Lifshitz and M.R Zablotowicz, 1989 Free-living bacterial inocula for enhancing crop productivity Trends Biotechnology, 7: 39-43 25 Koga, J., T Adachi, H Hidaka 1991 Molecular cloning of the gene for indolepyruvate decarboxylase from Enterobacter cloacae Mol Gen Genet, 226(1-2): 10 - 26 Koga, J., T Adachi and H Hidaka, 1991 Molecular cloning of the gene for indolepyruvate decarboxylase from Enterobacteria cloacae, Mol Gen Gent, 226: 10-16 82 27 Madhaiyan, M., S.V Saravannan, S.D Jovi, H Lee, R Thenmozhi, K Hair and T Sa, 2004 Occurrence of Gluconacetobacter diazotrophicus in tropical and subtropical plants of Western Ghats, India, Microbiological research, 159: 233-243 28 Malik, K.A., S Mehanaz and G Rad, 1997 Association of nitrogenfixing, plant growth promoting rhizobacteria with Kallar grass and rice, Plant and soil, 194: 37-44 29 Mounlin, L., A Munive, B Dreyfus and C Biovin-Masson, 2001 Nodulation of legumes by members of the-ß-subclass of proteobacteria, Nature, 411: 948-950 30 Muthukumarasamy R , I Cleenwerck, G Revathi, M Vadivelu, D Janssens, B Hoste, K U Gum, K Park, C Y Son, T Sa and J CaballeroMellado 2005 Natural association of Gluconoacetobacter diazotrophicus and diazotrophic Acetobacter peroxydans with wetland rice Syst Appl Microbiol 28: 277 - 286 31 Muthukumarasamy, R I., G Revathi and P Loganathan, 2002 Effect of inorganic N on the population in vitro colonization and morphology of Acetobacter diazotrophicus, Plant and Soil, 234: 91-102 32 Murphy, L., Sanders, L., Gordon, B and Tindall, T (2013), “improving fertilizer photphorus use efficiency with Avail polymer technology”, National workshop on improving the efficiency of management and use fertilizer in Vietnam, Cantho 5/3/2013 33 Nelson, L M 2004 Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): Prospects for new inoculants Online Crop Management DOI: 10.1094/CM-2004-0301-05-RV 34 Okon, Y and A.C Labandera-Gonzalez, 1994 Agonomic applicationstion of Azospirillum an evaluation of 20 years worldwide field inoculation, Soils Biol Biochem, 26: 1591-1601 83 35 Okon Y and Y Kapulnik 1986 Development and function ofAzospirillum-inoculated roots Plant and Soil 90: 3-16 36 Persello Cartieaux, F., L Nussaume and C Robaglia 2003 Tales from the underground: molecular plant–rhizobia interactions Plant, Cell and Environment 26: 189–199 37 Peter Kampfer, Reiner M Kroppensted and Wolfgang Dott E (1991) A numerical classification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological tests Journal of General Microbiology, 137, p 1831-1891 38 Pillay, V.K and J Norwak, 1997 Inoculum density, temperature, and genotype effects on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato (Lycospersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a Pseudomonas bacterium Can J Microbiol, 43: 354-361 39 Reinhold, B., T Hurek, N Ernst-Georg and F Istvan 1986 Close association of Azospirillum and diazotrophic rods with different root zones of Kallar grass Appl Environ Microbiol 52(3): 520 – 526 40 Ryan, R P., K Germaine, A Franks, D.J Ryan, D N Dowling 2008 Bacterial endophytes: recent developments and applications FEMS Microbiol Lett., 278(1): - 41 Scarpella, E., S Rueb and H A Meijer, 2003 The Radicleless gene is required for vascular pattern formation in rice, Development, 130: 645- 658 42 Sergeeva, E., A Liaimer and B Bergman, 2002 Evidence for production of the phytohormone indole-3-acetic acid by cyanobacteria Planta, 215: 229-238 43 Seshadri, S., R Muthurumarasimha, C Laksminarasimha and S Ignacirunthu, 2000 Solubilization of inorganic by Azospirillum halopraeferans, Current science, 79: 565-567 84 44 Seshadri, S., R Muthurumarasimha, C Laksminarasimha and S Ignacirunthu, 2000 Solubilization of inorganic by Azospirillum halopraeferans, Current science, 79: 565-567 45 Siciliano, S D., N Fortin, A Mihoc, G Wisse, S Labelle, D Beaumier, D Outlettete, R Roy, L G Whyte, M K Banks, P Schwab, K Lee and C W Greer 2001 Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination Appl Environ Microbiol 67: 2469 - 2475 46 Somers, E., D Ptacek, P Gysegom, M Srinivasan and J Vanderleyden 2005 Azospirillum brasilense produces the auxin-like phenylacetic by using the key enzyme for indole-3-acetic acid biosynthesis Appl Environ Microbiol 7l: 1803 - 1810 47 Szabolls, I (1979) Rewiew of reseach on salt affected soils natural resources reseach XV UNESCO, Paris 48 Teruo Higa Technology of Effective Microorganisms : Concept and Phisiology Royal Agricultural College, Cirencester, UK 2002 49 The OECD-FAO Agricultural Outlook 2013-2022 http://www.fao.org/news/story/en/item/177396/icode/ thứ 6, 25/3/2016 50 Theologies, A and M P Ray, 1982 Early auxin-regulated polyadenylylated messenger-RNA sequences in pea stem tissue Biological Sciences, 79: 418-421 51 Van, T.V., P Mavingui, O Berge and T Heulin, 1994 Promotion de croissance du riz incocule par une bacteria fixatrice dazote, Burkhoderia vietnamensis, isolated in soil acid Viet Nam, Agronomie, 14: 697-707 52 Vande, B.A., M Lambrecht, K Eggermont and J Vanderley, 1999 Auxinsupregulate expression of the indole-3-pyruvate decarboxylase gene in Azospirillum brasilense J Bacteriol, 181: 1338-1342 85 53 Zinniel, K.D., P Lambrecht, B N Hais, Z Feng, D Kuczmarski, P Higley, C Ishimaru, Arunakumari, R G Barletta and K A Vidaver, 2002 Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants Appl Environ Microbiol, 59: 2198- 2208 86 PHỤ LỤC Phục lục Thành phần môi trường Tryptone glucose yeast agar Tryptose Cao nấm men Glucose Thạch Nước cất 5g 2,5g 1g 15g 1l 87 Phụ lục Thành phần môi trường phân lập vi sinh vật nội sinh STT Tên môi trường YMA CA LB Thành phần Manitol K2HPO4 NaCl MgSO4.7H2O Cao nấm men Thạch Congo đỏ 1% pH = 6,8 C6H5Na3O7 CH3COONa Glucose K2HPO4 (NH4)H2PO4 MgSO4 NaCl Brom thymol blue Thạch Cao nấm men Peptone NaCl Thạch pH=7 88 Khối lượng (g/l nước cất) 10 0.5 0.1 0.2 1.0 20 2.5ml 0.2 1 0.2 0.08 20 10 10 20 STT Tên môi trường MPA Gause NA Hansen LGI Thành phần Cao thịt Peptone NaCl Thạch Tinh bột KNO3 K2HPO4 MgSO4 NaCl FeSO4 Thạch Peptone Cao thịt bò Cao nấm men NaCl Thạch pH=7 Glucose KH2PO4 MgSO4.7H2O Peptone Thạch pH=6 Sucrose K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O Na2MoO4.2H2O Bromthymol blue 0.5% pH = 89 Khối lượng (g/l nước cất) 5 20 0.5 0.5 0.5 0.01 20 5 20 50 3 10 20 10 0.2 0.6 0.2 0.02 0.002 5ml Phục lục Thành phần môi trường Pikovaskya Glucose Ca3(PO4)2 (NH4)2SO4 NaCl MgSO4 KCl Cao nấm men MnSO4 FeSO4 Nước cất 1g 0.5g 0.05g 0.02g 0.01g 0.02g 0.05g 0.0002g 0.0002g 100 ml pH= Phụ lục Thành phần thuốc thử Salkowski: FeCl3 0.5M 15ml H2SO4 98% 300ml Nước cất 500ml Thuốc thử sau pha xong cần bảo quan bình tối 90 Phục lục BALANCED ANOVA FOR VARIATE SL FILE THUMT 20/ 5/16 7: :PAGE VARIATE V003 SL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 1530.64 1530.64 958.64 0.000 NL 1.36307 340768 0.21 0.917 * RESIDUAL 6.38669 1.59667 * TOTAL (CORRECTED) 1538.39 170.932 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAO FILE THUMT 20/ 5/16 7: :PAGE VARIATE V004 CAO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 109.151 109.151 620.72 0.000 NL 5.28875 1.32219 7.52 0.040 * RESIDUAL 703382 175846 * TOTAL (CORRECTED) 115.143 12.7937 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE THUMT 20/ 5/16 7: :PAGE VARIATE V005 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT 16.6978 16.6978 929.06 0.000 NL 2.71474 678684 37.76 0.004 * RESIDUAL 718915E-01 179729E-01 * TOTAL (CORRECTED) 19.4844 2.16494 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NS FILE THUMT 20/ 5/16 7: :PAGE VARIATE V006 NS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= 91 CT 2511.27 2511.27 ****** 0.000 NL 1.52830 382076 0.22 0.911 * RESIDUAL 6.82834 1.70708 * TOTAL (CORRECTED) 2519.63 279.959 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THUMT 20/ 5/16 7: :PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT NOS SL CAO SOLA NS 14.0662 6.70040 5.02420 35.7680 38.8100 13.3080 7.60860 67.4620 0.565097 0.187534 0.599548E-01 0.584309 2.21506 0.735094 0.235010 SE(N= 5) 5%LSD 4DF 2.29036 MEANS FOR EFFECT NL NL NOS SL CAO SOLA NS 27.0820 9.45000 6.72450 51.1050 2 26.3400 10.2610 6.64700 51.6450 26.0755 8.89000 5.62450 51.5600 26.1130 10.5805 6.84150 52.3050 26.5800 10.8395 5.74450 51.4600 0.893496 0.296518 3.50231 1.16229 SE(N= 2) 5%LSD 4DF 0.947968E-01 0.923873 0.371583 3.62138 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THUMT 20/ 5/16 7: :PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 10) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS C OF V |CT % |NL | | | | | | | | | SL 10 26.438 13.074 1.2636 4.8 0.0002 0.9168 CAO 10 10.004 3.5768 0.41934 4.2 0.0002 0.0403 SOLA 10 6.3164 1.4714 0.13406 2.1 0.0002 0.0035 NS 10 51.615 16.732 1.3066 2.5 0.0001 0.9108 92