Kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS I. Giới thiệu chung: Coliforms là một loại vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, có khả năng lên men lactose sinh acid là sinh hơi ở 37oC trong 24–48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lượng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ _ BÁO CÁO THỰC TẬP KIỂM NGHIỆM VI SINH Mục lục ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORMS I Giới thiệu chung: Coliforms loại vi khuẩn gram âm, hình que, hiếu khí hay kỵ khí tùy ý, khơng sinh bào tử, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37 oC 24–48 Nhóm Coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột người, động vật Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị số lượng chúng diện mẫu thị khả có diện vi sinh vật gây bệnh khác thực phẩm II Quy trình: Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn: 10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng mẫu dung dịch 10-1 Pha loãng mẫu thành 10-3 10-4 Cấy 1ml mẫu pha loãng 10-3 10-4 vào đĩa petri, cấy đĩa/ nồng độ Đỗ vào 10-15 ml VRB đun tan làm nguội đến 45oC chờ đông đặc đổ thêm khoảng ml lên bề mặt chờ đông đặc Lật ngược ủ 37 ± 0.5oC 24 Chọn đếm khuẩn lạc có màu đen đến đỏ đậm, có quầng tủa muối mật Chọn khuẩn lạc đếm vcấy sang môi trường BGBL Ủ 37 ± 0.5oC 24 Quy trình làm nhóm: Khơng có bước cấy khuẩn lạc sang mơi trường BGBL trở sau (vì khơng xuất khuẩn lạc đĩa) III Kết quả: Độ pha loãng F 10-3 10-4 Số khuẩn lạc N (CFU) 0 0 Vì khơng có khuẩn lạc nên khơng thực bước xác nhận sinh môi trường BGBL tính theo cơng thức: C≤ xR N: số khuẩn lạc (quy ước N=1) R: hệ số tỉ lệ xác nhận sinh ống BGBL (quy ước R=1) n: số đĩa V: thể tích mẫu cấy vào đĩa f: độ pha loãng  C≤ IV 2*1*10-3 + 2*1*10-4 *1 = 455 (CFU/g) Kết luận: - Coliforms tổng số / g mẫu thịt tươi nhỏ 455 CFU/g - Kết luận: Coliforms tổng số 1(g) mẫu nằm khoảng cho phép theo TCVN 10-2 CFU V Biện luận: - Môi trường VRB môi trường tăng sinh chọn lọc Coliforms Trong q trình pha mơi trường khơng hấp vô trùng mà cần phải cân vô trùng - Khuẩn lạc mơi trường VRB có màu đỏ đậm quầng tủa muối mật xung quanh Màu đỏ đậm khẩn lạc Coliforms lên men lactose tạo acid nên làm cho chất thị màu Nutral Red chuyển sang màu đỏ Còn quầng tủa kết tủa muối mật bị acid hóa - Mơi trường BGBL: Muối mật để ức chế vi khuẩn Gram (+), brilliant green dùng để chọn lọc vi khuẩn Gram (-), hình que (Coliforms) - Dùng mơi trường BGBL để xác nhận lại khả sử dung lactose sinh Coliforms, từ khẳng định xuất Coliforms mẫu ĐỊNH TÍNH E coli GIẢ ĐỊNH I Giới thiệu chung: Faecal Coliforms (hay E coli giả định) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh Indol ủ khoảng 24 44,5 oC canh Trypton E coli giả định thành phần hệ vi sinh đường ruột người động vật máu nóng khác sử dụng để thị mức độ vệ sinh trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống để thị ô nhiễm mẫu mơi trường II Quy trình: Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn: 10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng mẫu dung dịch 10-1 Cấy 1g (~10ml 10-1) mẫu vào ống 10ml môi trường Luarylsulphate broth nồng độ đôi (LSB đôi) Ủ 37 ± 0.5oC 24 Quan sát thấy có sinh dùng que cấy vịng cấy sang ống chứa 10ml mơi trường EC broth Ủ 44 ± 0.5oC 24 Quan sát thấy có sinh dùng que cấy vòng cấy sang ống chứa 5ml canh trypton Ủ 44 ± 0.5oC 24 Thử phản ứng indol thuốc thử Kovac quan sát kết Quy trình làm nhóm: Thực bước III Kết quả: - Môi trường LSB EC broth sinh - Phản ứng thử Indol dương tính (xuất vịng màu đỏ mặt dung dịch) IV Kết luận: Phát E coli giả định 1g mẫu V Biện luận: - Vì đặc điểm E coli giả định Colilform, có khả chịu nhiệt sinh Indol nên ta thực theo quy trình với mơi trường: • Mơi trường LSB dùng để xác định Coliforms (vi khuẩn Gram (-) sử dụng lactose) Trong mơi trường LSB có Lauryl Sulfate dùng để ức chế vi sinh vật Coliforms với điều kiện pH ổn định, mơi trường • cịn có lactose để xác nhận khả sinh Coliforms Môi trường EC broth dùng để chọn lọc E coli giả định có khả chịu nhiệt 44oC • Canh trypton dùng để xác nhận E coli có tryptophanase (tryptophanase phân hủy tryptophan có canh trypton) => dùng thuốc thử Kovac’s để nhận biết Cơ chất tham gia phát Indol môi trường nuôi cấy pdimethyaminobanaldehyde Chất phản ứng với Indol tạo thành phức hợp - màu đỏ Trong trình thực tập nhận thấy định lượng Coliforms khơng có khuẩn lạc mọc định tính E coli giả định thấy có xuất lí sau: • Nồng độ cấy để định lượng Coliform nhiều so với E coli giả định Coliforms E coli giả định ml mẫu nồng độ 10-3 10-4 10 ml mẫu nồng độ 10-1 • Do mẫu thịt Satra foods nên bảo quản nhiệt độ lạnh  vi sinh vật sinh trưởng yếu sau cấy thẳng vào mơi trường tăng sinh chọn lọc VRB mà không tăng sinh phục hồi  vi sinh vật chết • Do q trình thao tác sai  ảnh hưởng tới kết ĐỊNH LƯỢNG Staphylococcus aureus I Giới thiệu chung: Staphylococcus aureus (S aureus) hay gọi tụ cầu vàng, vi khuẩn gây ngộ độc từ nhà bếp S aureus vi khuẩn thuộc họ Micrococaceae, Gram (+), hình cầu, cạnh tranh yếu với vi sinh vật khác Trong tự nhiên S aureus thường tìm thấy da, mũi, tóc hay lơng lồi động vật máu nóng S aureus vi sinh vật có khả sản sinh số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy 100oC 30 phút tồn lâu thực phẩm Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4–6 ủ bệnh bộc phát triệu chứng lâm sàng tiêu chảy, nôn mữa triệu chứng kéo dài từ – Những thực phẩm dễ bị nhiễm tụ cầu vàng bao gồm trứng, thịt gia súc, gia cầm, salad (gồm trứng, cá ngừ, thịt gà, khoai tây, mỳ ống), loại bánh nướng có kem sản phẩm từ sữa II Quy trình: Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn: 10g mẫu + 90g dung dịch pha loãng đồng mẫu dung dịch 10-1 pha loãng thành 10-2, 10-3 Trải 0.1 ml dung dịch mẫu pha loãng 10-3 lên đĩa Baird Parker Agar (2 đĩa) Ủ ngược đĩa 37 ± 0.5oC 48 Đếm số khuẩn lạc đặc trưng: trịn, lồi , màu đen có quầng (quầng đục, quầng trong) (N) Dùng que cấy nhọn chuyển khuẩn lạc đếm sang đĩa TSA chia làm Ủ 37 ± 0.5oC qua đêm Dùng que cấy vòng cấy chuyển vào ống chứa 0.3 ml huyết tương Ủ 37 ± 0.5oC theo dõi sau 2,4,6,8 Nếu khơng có biểu ngưng kết ủ tiếp đến 24 Quy trình làm nhóm: Thực bước III Kết quả: Độ pha loãng f 10-3 Số khuẩn lạc N (CFU) >300 Sau thấy ống đông tụ huyết tương  Tỷ lệ xác nhận: R = Số khuẩn lạc đông tụ huyết tương/ Số khuẩn lạc cấy = 5/5 =1 C= xR N: số khuẩn lạc (vì N >300 nên ta lấy N=300) R: hệ số tỉ lệ xác nhận sinh ống BGBL (R=1) n: số đĩa (n=2) V: thể tích mẫu cấy vào đĩa (V=0.1) f: độ pha loãng (f=10-3) 300  C= *1 = 15*105 (CFU/g) 2*0.1*10-3 Kết luận: Có 15*105 CFU S.aureus gam mẫu V Biện luận: Trong môi trường BPA có lithium chloride thành phần chọn lọc S aureus, IV glycine pyruvate thành phần cần thiết cho phát triển S aureus Khuẩn lạc S aureus có đặc điểm trịn, lồi, đen, có quầng nằm vùng mơi trường xung quanh (quầng đục, quầng ngồi trong): • Màu đen S aureus tiết enzyme coagulase khử tellurite dịch trứng thành • tellurium (có màu đen) Quầng đục S aureus tiết enzyme lipase phân giải lipid  tụ xung - quanh khuẩn lạc • Quầng S aureus tiết enzyme lecithinate khử lecithin Môi trường TSA dùng để phục hồi S aureus sau nuôi môi trường chọn lọc - BPA Phản ứng đơng tụ huyết tương tính chất enzyme coagulase có S aureus Khi có diện enzyme cấu tử huyết tương kết hợp thành khối hay cục ĐỊNH TÍNH Salmonella I Giới thiệu chung: Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi khơng tạo bào tử, di động tiên mao, sinh sống đường ruột Hầu hết lồi Salmonella sinh H2S Salmonella không lên men lactose (trừ Salmonella arizona) sucrose lên men dulcitol, mannitol glucose Salmonella tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đứng hàng đầu số vụ ngộ độc vi sinh vật Số lượng Samonella đủ để gây ngộ độc chúng diện triệu tế bào gam thực phẩm Các triệu chứng Salmonella gây thường tiêu chảy, ói mửa, buồn nơn Thời gian ủ bệnh triệu chứng biểu thường sau 12–36 kể từ tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Triệu chứng kéo dài 2-7 ngày Các loại thực phẩm có nguy nhiễm Salmonella thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng loại sản phẩm trứng, thủy sản II Quy trình: Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn Lương, phường Tân Hưng, Quận 7) Quy trình chuẩn: 10 Lysine Decarbo-xylase Broth (LDC) (+) Manitol Phenol Red brothDùng que cấy thẳng cấy mẫu vào KIA Urea Broth Canh trypton Ủ 37 ± 0.5oC 24 quan sát C 11 Quy trình làm nhóm: làm tới bước phân lập XLD (vì khơng có khuẩn lạc nên khơng thể thử nghiệm sinh hóa) III Kết quả:  Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc RV: - Đối chứng: Ống nghiệm đục - Mẫu: Ống nghiệm đục  Phân lập môi trường XLD: - Đối chứng: Có khuẩn lạc đặc trưng - Mẫu: Khơng có khuẩn lạc đặc trưng  Thử nghiệm sinh hóa: Vì khơng có khuẩn lạc đặc trưng XLD nên ta khơng thể tiến hành thử nghiệm sinh hóa IV Kết luận: Khơng có Salmonella 25g mẫu thịt lợn V Biện luận: Môi trường tăng sinh chọn lọc RV có malachite green oxalat chất chọn lọc dùng để ức chế vi sinh vật khác Salmonella với điều kiện áp suất thẩm thấu cao, - pH nhiệt độ (42oC) Môi trường XLD dùng để phân lập Salmonella với đặc điểm nhận diện khuẩn lạc - suốt, có khơng có tâm đen Sở dĩ môi trường RV màu đục cấy mơi trường XLD lại khơng có khuẩn lạc trình thao tác sai  kết bị sai số lượng Salmonella - RV  khơng xuất khuẩn lạc Thử nghiệm sinh hóa nhằm khẳng định xác có Salmonella, đó: • Ở thạch nghiêng KIA, đặc điểm mặt thạch màu đỏ, màu vàng Sở dĩ có tượng mơi trường KIA có 0.1% glucose, 1% lactose pepton Đầu tiên Salmonella lên men glucose trước tạo acid  làm màu chất thị Phenol red chuyển thành màu vàng (Salmonella không sử dụng lactose), hết glucose Salmonella chuyển sang dùng pepton điều kiện hiếu khí  tạo mơi trường base mặt thạch  chất thị chuyển thành màu đỏ, đỏ đậm • Thử nghiệm manitol (dương tính): Vi khuẩn Salmonella có khả lên men đường manitol sinh acid  làm cho chất thị Phenol red chuyển từ màu đỏ sang vàng • Thử nghiệm urea (âm tính): Khi có chất urea mơi trường, enzyme urease vi sinh vật tiết để phân giải urea tạo NH  làm cho môi trường 12 hóa kiềm chuyển sang màu đỏ Vì Salmonella khơng có enzyme nên khơng thể phân giải urea mơi trường giữ ngun màu • Thử nghiệm lysin (dương tính): Trong mơi trường LDC có glucose lysin nên có Salmonella vi sinh vật ưu tiên sử dụng glucose trước tạo môi trường acid chuyển từ màu tím sang màu vàng, sau hết glucose, Salmonella chuyển sang sử dụng lysin cách tiết enzyme decarboxylase  loại bỏ nhóm carboxyl  mơi trường trở nên kìm chuyển từ vàng sang tím (dương tính) Cịn khơng có Salmonella vi sinh vật khác sử dụng glucose nên làm mơi trường chuyển sang màu vàng (âm tính) • Thử nghiệm Indol (âm tính): Canh trypton dùng để xác nhận có tryptophanase (tryptophanase phân hủy tryptophan có canh trypton) => dùng thuốc thử Kovac’s để nhận biết Cơ chất tham gia phát Indol mơi trường ni cấy p-dimethyaminobanaldehyde Chất phản ứng với Indol tạo thành phức hợp màu đỏ Vì Salmonella khơng có enzyme tryptophanase nên âm tính với thuốc thử Kovac’s 13 ... ruột người, động vật Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị số lượng chúng diện mẫu thị khả có diện vi sinh vật gây bệnh khác thực phẩm II Quy trình: Mẫu thực phẩm: Thịt lợn nạt Satra foods (Lê Văn... tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Triệu chứng kéo dài 2-7 ngày Các loại thực phẩm có nguy nhiễm Salmonella thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng loại sản phẩm trứng, thủy sản II Quy trình: Mẫu thực phẩm: ... động vật máu nóng S aureus vi sinh vật có khả sản sinh số loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân hủy 100oC 30 phút tồn lâu thực phẩm Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này,