Chương 4 BÀN LUẬN
4.2.1.Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB
* Về số lượng nucleotide và amino acid:
Kết quả so sánh trình tự gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, với trình tự gen tương ứng của 19 chủng đại diện trong 4 nhóm virus lựa chọn so sánh, phân lập trên nhiều loài vật chủ từ 2003 – 2012, cho thấy:
- Sáu biến chủng virus virus cúm A/H5N1 nghiên cứu có sự bảo tồn về độ dài gen PB2, chứa 2.280 nucleotide mã hóa cho 759 amino acid, không có đột biến thay đổi về số lượng (thêm vào hay xóa đi 01 hoặc nhiều nucleotide) hoặc xuất hiện các bộ mã kết thúc (“STOP” codon), so với trình tự gen tương ứng của 19 chủng đại diện trong 4 nhóm virus lựa chọn so sánh.
- Kết quả trên cũng phù hợp với các nghiên cứu về đột biến ở gen PB2 của virus cúm A/H5N1, phân lập trên nhiều loài vật chủ giai đoạn sau bùng phát dịch cúm gia cầm A/H5N1 năm 2003, tại Việt Nam và trên thế giới đến nay [12], [70], [76], [77], [78], [80].
* Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid:
+ Kết quả so sánh cho thấy, có sự biến đổi mạnh mẽ về thành phần nucleotide gen PB2 (110 vị trí sai khác, tỉ lệ tương đồng đạt 92% - 99%), nhưng lại có sự bảo tồn cao về thành phần amino acid ở protein PB2 suy diễn (chỉ có 19 vị trí thay đổi, tỉ lệ tương đồng đạt 96% - 100%), giữa 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu và 19 chủng đại diện, mang tính chất tương đối tập trung theo 4 nhóm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1 lựa chọn so sánh.
Các vị trí sai khác nucleotide là do đột biến thay thế xảy ra trong trình tự gen PB2, qua quá trình virus cúm A/H5N1 lưu hành gây bệnh ở các loài vật chủ. Các đột biến trong trình tự gen PB2 xảy ra tương đối tập trung theo 4 nhóm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1 so sánh cho thấy, gen PB2 có sự biến đổi hình thành các phân nhóm gen tương ứng với các clade gen H5 kể trên của virus cúm A/H5N1.
Sự bảo tồn về thành phần amino acid trong trình tự protein PB2 là do:
- Các nucleotide có vị trí và vai trò khác nhau trong bộ ba mã hóa amino acid, dẫn đến có sự thay đổi về nucleotide mà không làm thay đổi amino acid được mã hóa tương ứng [8], [106], [107].
- Mặt khác, gen PB2 mã hóa cho protein PB2 polymerase, một đơn vị cấu tạo và chức năng trong phức hợp enzym polymerase của virus cúm A/H5N1. Vì vậy, sự bảo tồn thành phần amino acid giúp ổn định cấu trúc và hoạt tính protein PB2 cũng như phức hợp enzym polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên của virus cúm A/H5N1 trong tế bào cảm thụ ở các loài vật chủ [1], [2], [6], [12], [70].
+ Kết quả phân tích các vị trí đột biến thay thế nucleotide trong trình tự gen PB2 dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự protein PB2 suy diễn, của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, với trình tự gen tương ứng của 19 chủng đại diện trong 4 nhóm virus lựa chọn so sánh, cho thấy:
- Trình tự gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, gồm: DkQT801-2011, DkQT802-2011, DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và DkTG926-2009, lần lượt có sự đồng nhất cao về thành phần nucleotide và amino acid, tỉ lệ tương đồng đạt 96% – 99% và 98% – 100% theo thứ tự, so với trình tự gen PB2 của các chủng đại diện trong 3 nhóm virus clade 2.3.2.1, 2.3.4.3 và 1.1 tương ứng. Trình tự gen PB2 cũng có sự đồng nhất cao về thành phần nucleotide và amino acid, tỉ lệ tương đồng đạt 98% – 99% và 98% – 100%, giữa các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam so với trình tự tương ứng của các chủng phân lập tại Thái Lan trong nhóm virus clade 1. Kết quả này chứng tỏ gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, cũng như các chủng virus phân lập tại Việt Nam các năm 2003 – 2012, có ít biến đổi và có thể có chung nguồn gốc so với gen PB2 của các chủng trong 4 nhóm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1 tương ứng, phân lập tại các quốc gia lân cận (Trung Quốc, Lào, Campuchia và Thái Lan).
- Bên cạnh đó, kết quả phân tích cũng cho thấy, trình tự gen PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh, có sự khác nhau ở một số vị trí nucleotide dẫn đến thay đổi về amino acid, tương ứng theo 4 nhóm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1. Tỉ lệ tương đồng thành phần nucleotide và amino acid trình tự gen PB2, của các chủng giữa 4 nhóm virus kể trên so sánh theo từng đôi một thay đổi theo thứ tự, từ 92% – 94% và 96% – 97% cho đến 96% – 97% và 97% – 98%.
- Hơn nữa, trình tự gen PB2 của các chủng trong 2 nhóm virus clade 2.3.2.1 và 2.3.4.3, có sự sai khác về 6/18 vị trí nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid, tỉ lệ tương đồng chỉ đạt là 92% – 96% và 96% – 98% theo thứ tự, so với trình tự tương ứng của các chủng trong 2 nhóm virus clade 1 và 1.1.
Các kết quả phân tích ở trên góp phần chứng tỏ rằng, gen PB2 có sự biến đổi chia tách thành 4 phân nhóm gen thuộc 2 nhóm gen, tương ứng với 4 clade 2.3.2.1, 2.3.4.3, 1, 1.1 thuộc 2 nhóm gen H5 clade 2 và clade 1, trong hệ gen của virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới từ 2003 đến nay. Kết quả phân tích cũng cho thấy, gen PB2 của nhóm virus clade 2.3.2.1 lưu hành trong các năm 2009 – 2012, có thể có chung nguồn gốc với gen tương ứng của nhóm virus clade 2.3.4.3 lưu hành giai đoạn 2007 – 2008. Trong khi, gen PB2 của nhóm virus clade 1.1 lưu hành trong các năm 2007 – 2012, có thể có chung nguồn gốc với gen tương ứng của nhóm virus clade 1 lưu hành giai đoạn 2003 – 2005.
- Mặt khác, 18 vị trí thay đổi về amino acid được phân bố ở cả vùng C-tận và N-tận, tương ứng với các vùng cấu trúc liên kết với protein PB1 và biểu hiện hoạt tính enzym trên trình tự protein PB2, của các chủng trong 4 nhóm virus clade 2.3.2.1, 2.3.4.3, 1 và 1.1. Các vị trí thay đổi amino acid đều không đúng là các vị trí amino acid, được chứng minh ảnh hưởng đến thay đổi cấu trúc và hoạt tính của protein PB2 polymerase, theo hướng liên quan đến thay đổi độc lực và khả năng thích nghi nhân lên của virus cúm A/H5N1 ở tế bào cảm thụ của người và động vật có vú. Tuy nhiên, các vị trí thay đổi amino acid này cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng liên kết với protein PB1, hoạt tính và khả năng tương tác với các dạng cấu trúc tín hiệu định vị nhân (importin-α) trên màng nhân tế bào cảm thụ, của protein PB2 polymerase ở các chủng trong 4 nhóm virus nói trên.
+ Sự thay đổi amino acid E627K trong protein PB2 liên quan đến thay đổi khả năng thích nghi nhân lên, của virus cúm A ở nhiệt độ cơ thể giữa gia cầm và người. Đây là một trong những yếu tố biến đổi di truyền có vai trò quan trọng, góp phần giúp virus cúm A vượt qua rào cản loài, chuyển nhiễm và thích nghi lây truyền từ gia cầm sang người, được phát hiện ở 3 phân type virus cúm A/H1N1, A/H2N2 và A/H3N1, nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm A ở người trước đây [40] [45], [52], [55], [91]. Đột biến này cũng đã được chứng minh làm gia tăng khả năng nhân lên của virus cúm A/H5N1, trong các mô hình thực nghiệm ở chuột và tế bào của động vật có vú [22], [51], [56], [57], [58], [96], [99]. Phân tích amino acid tại vị trí 627 của protein PB2, giữa 25 chủng trong 4 nhóm virus lựa chọn so sánh cho thấy, có sự bảo tồn gluctamic acid tại vị trí 627 (E627) trong protein PB2, của 06 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu cùng với các chủng phân lập từ người và gia cầm trong 2 nhóm virus clade 2.3.2.1 và 1.1. Đặc biệt, đã có sự thay đổi từ glutamic acid thành lysin tại vị trí 627 (E627K) trong protein PB2, của 3 chủng virus clade 2.3.4.3 và 4 chủng virus clade 1, phân lập từ người bệnh tại Việt Nam và Thái Lan các năm 2003 – 2007. Kết quả trên phù hợp với các kết quả giám sát đột biến thay đổi amino acid tại vị trí 627 trong protein PB2, của 4 nhóm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3, 2.3.2.1 lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới, đã công bố trước đây của các tác giả: Lê Quỳnh Mai (2011) [80], Cao Thị Bảo Vân và cs. (2005) [104], Chen và cs. (2004, 2006) [66], [67], Nguyen T và cs. (2012) [77], Nguyen TD và cs. (2008) [78], Wan
và cs. (2008) [76].
- Bên cạnh đó, kết quả này cho thấy gen PB2 của một số chủng trong 2 nhóm virus clade 1 và 2.3.4.3, đã có sự biến đổi liên quan đến thích ứng nhân lên của virus ở nhiệt độ cơ thể người. Tuy nhiên, tỉ lệ tương đồng cao về thành phần nucleotide và amino acid gen PB2, giữa các chủng virus phân lập từ người bệnh so với các chủng phân lập từ gia cầm bệnh trong 4 nhóm virus clade 1, 1.1, 2.3.4.3 và 2.3.2.1, chứng tỏ các chủng virus gây bệnh trên người là do xâm nhiễm trực tiếp từ gia cầm bệnh. Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu phân tích gen H5 đã được công bố, liên quan đến khả năng thích nghi xâm nhiễm tế bào cảm thụ của người ở các chủng trong 4 nhóm virus kể trên [4], [76], [77], [78], [80], [81], [86].
4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1