Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2.Thiết kế các trình tự mồi nucleotide sử dụng trong nghiên cứu
+ Thiết kế mồi chuyển cDNA hệ gen của virus cúm A/H5N1: Mỗi phân đoạn gen RNA hệ gen của virus cúm A/H5N1 có chứa một đoạn trình tự dài 12 – 15 nucleotide có tính bảo tồn cao tại đầu 3’- và 5’-. Trình tự này chứa các nucleotide bổ xung với nhau tạo ra vùng tận cùng 3’- và 5’- của cấu trúc xoắn α ở mỗi phân đoạn [1], [2]. Dựa trên đặc tính này nhiều nhóm nghiên cứu đã thiết kế mồi chuyển cDNA, thu nhận thành công đầy đủ độ dài các phân đoạn RNA hệ gen của virus cúm A [108], [109], [110].
Đối với virus cúm A/H5N1 đang lưu hành từ 2003 – 2012, có sự biến đổi mạnh mẽ trong hệ gen, đặc biệt là sự tái tổ hợp 6 phân đoạn gen khung bao gồm các gen PB2, PB1 và PA [4], [66], [76], [77], [78], [82], [88]. Vì vậy, các mồi thiết kế và sử dụng chuyển cDNA hệ gen virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu (Bảng 2.4), gồm:
- Mồi 468F có độ dài 12 nucleotide sử dụng để gia tăng hiệu quả thu nhận cDNA hệ gen của virus cúm A/H5N1, làm nguyên liệu cho phản ứng PCR thu nhận các gen: PB2; PB1 và PA, được thiết kế dựa trên trình tự 12 – 15 nucleotide bảo tồn đầu 3’- và 5’- của các phân đoạn gen này lưu trữ trong Ngân hàng gen.
- Bên cạnh đó, mồi random hexamer cung cấp theo bộ kit chuyển đổi cDNA của hãng Fementas (Bảng 2.4) cũng được sử dụng trong quá trình chuyển cDNA, để lợi dụng tính chất bám xác xuất của mồi này và gia tăng hiệu suất tổng hợp thành công cDNA hệ gen virus cúm A/H5N1. Mồi random hexamer là hỗn hợp các đoạn oligonucleotide gồm 6 nucleotide bất kì sợi đơn, có khả năng bám xác suất đối xứng bổ sung kế tiếp nhau vào sợi RNA với tần suất cao, để tổng hợp chuỗi nucleotide tạo nên hai sợi DNA là sản phẩm cDNA của toàn bộ hệ gen.
Bảng 2.4. Danh sách mồi chuyển cDNA, kiểm tra cDNA hệ gen, thu nhận và giải trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu
Số
TT Tên mồi Trình tự mồi (5’ 3’) Mô tả
Sản phẩm
PCR
1 468F 5’-AGCAAAAGCAGG-3’ Mồi chuyển cDNA cDNA
2 Random Hexamer 5’-NpNpNpNpsNpsN-3’ Mồi chuyển cDNA cDNA
3 H5F1 5’-ACATACTGGAAAGGACACACAACG-3’ Kiểm tra cDNA
4 H5R1 5’-GGCATACTAGAGTTTATCGCCC-3’ Kiểm tra cDNA
Gen H5 ~ 1kb 5 KPB2F 5’-AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTCA-3’ Mồi xuôi 6 KPB2R 5’-AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAACTA-3’ Mồi ngược Gen PB2 ~ 2,3 kb 7 PB2FS 5’-TCCGAGAGAGGCGAAGAGAC-3’ Mồi giải trình tự Gen PB2 8 KPB1F 5’-GCRAAAGCAGGCAAACCATTTGAATG-3’ Mồi xuôi 9 KPB1R 5’-AGTAGAAACAAGGCATTTTTTCATGAA-3’ Mồi ngược Gen PB1 ~ 2,3 kb 10 PB1F3 5’-TGAGCATTGGTGTTACAGTG-3’ Mồi xuôi 5’- PB1 11 PB1R3 5’-AGTAGAAACAAGGCATTTTTT-3’ Mồi ngược 3’- PB1 12 PB1FS 5'-GGACGGCTAATAGATTTCCTCAAG-3' Mồi giải trình tự Gen PB1
13 KPAF 5'-AGCRAAAGCAGGTACTGATYCGAAATG-3' Mồi xuôi
14 KPAR 5'-AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACA-3' Mồi ngược
Gen PA ~ 2,3 kb
15 PAFF 5’-AGAAACATTGTTAGGAGAGC-3’ Mồi giải trình tự Gen PA
16 M13F 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ Mồi giải trình tự
17 M13R 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’ Mồi giải trình tự
Ghi chú: Np: nucleotide triphosphat (NTP) bất kì loại 1 gốc phosphat: N: NTP bất kì chưa loại gốc phosphat; Các chữ cái (A, G, T, C) trong trình tự mồi: Kí tự R: kí hiệu nucleotide hoặc A hoặc G; Kí tự Y: kí hiệu nucleotide hoặc T hoặc C.
- Cặp mồi H5F1 – H5R1 được thiết kế đặc hiệu thu nhận một đoạn DNA kích thước khoảng 0,8 kb chứa vùng mã hóa chuỗi nối HA1 và HA2 trong gen H5, được sử dụng kiểm tra kết quả chuyển đổi cDNA hệ gen virus. Qua đó, kết quả kiểm tra cDNA cũng sơ bộ xác định được phân type HA(H5) của các chủng virus A/H5N1 trong nghiên cứu, đảm bảo làm khuôn cho phản ứng PCR thu nhận các phân đoạn RNA gen PB2, PB1 và PA với các cặp mồi đặc hiệu.
Các mồi chuyển cDNA không sử dụng được cho phản ứng PCR thu nhận đầy đủ độ dài, của các phân đoạn gen riêng biệt trong hệ gen virus cúm A/H5N1, do tính chất hoạt động không đặc hiệu của mồi và đặc tính của phản ứng PCR trong quá trình nhân bản DNA [109], [110].
+ Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu thu nhận gen PB2, PB1 và PA:
Các cặp mồi đặc hiệu thu nhận từng phân đoạn RNA gen PB2, PB1 và PA trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu (Bảng 2.4), được thiết kế dựa trên 60 – 100 trình tự của mỗi gen tương ứng, lưu trữ trong Ngân hàng gen các năm 2006 – 2010.
Trình tự nucleotide của các cặp mồi đặc hiệu kể trên được thu nhận bằng chương trình thiết kế mồi MacVector 8.2, và đối chiếu với chương trình “Primer design” có trong Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Primer.cgi). Các mồi sử dụng trong nghiên cứu sau thiết kế được tổng hợp bởi Phòng thí nghiệm của Công ty Bioneer (Hàn Quốc).
- Các cặp mồi đặc hiệu thiết kế với mồi xuôi chứa trình tự gồm 12 nucleotide đầu tiên của mồi 468F, mồi ngược có trình tự từ 10 – 12 nucleotide bổ xung với phần trình tự bảo tồn đầu 3’- phân đoạn RNA của mỗi gen tương ứng. Do đó, bảo đảm thu nhận toàn bộ độ dài DNA các gen cần nghiên cứu, cũng như hiệu quả bám mồi trên cDNA và giữ đúng khung đọc của gen khi được gài vào plasmid tách dòng. - Sản phẩm DNA các gen PB2, PB1 và PA thu nhận sau phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu, có độ dài lần lượt là: gen PB2 (KPB2F – KPB2R) và gen PB1 (KPB1F – KPB1R) khoảng 2.300 bp (2,3 kb), đầu 3’- gen PB1 (KPB1F – PB1R3) khoảng 1.700 bp (1,7 kb), đầu 5’- gen PB1 (PB1F3 – KPB1R) khoảng 700 bp (0,7 kb) và gen PA (KPAF – KPAR) khoảng 2.200 bp (2,2 kb).
- Do các gen PB2, PB1 và PA đều có độ dài lớn (khoảng 2,2 – 2,3 kb), chúng tôi thiết kế thêm các mồi giữa sử dụng trong phản ứng PCR giải trình tự, theo phương pháp giải trình tự “lao mồi” từng đoạn, để bảo đảm thu nhận được toàn bộ trình tự nucleotide của các gen này (Bảng 2.4) [8].
Vị trí bám của mồi chuyển cDNA hệ gen và các mồi đặc hiệu trên các gen riêng biệt cần nghiên cứu, được mô tả như hình 2.2.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});