Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.2.Kết quả PCR thu nhận và dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA
* Kết quả PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA
Kết quả điện di kiểm tra DNA các gen PB2, PB1 và PA, thu nhận từ PCR với các cặp mồi đặc hiệu và cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu, được trình bày ở các hình 3.2 (gen PB2), hình 3.3 (gen PB1) và hình 3.4 (gen PA).
+ Kết quả kiểm tra DNA gen PB2 thu nhận sau PCR:
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy, 4 mẫu DNA gen PB2 thu nhận sau PCR của các biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và DkTG926-2009 (Hình 3.2A), cùng với 2 mẫu của các biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (Hình 3.2B) theo thứ tự,đều cho 1 băng sáng biểu hiện sản phẩm DNA trên hình điện di. Các sản phẩm DNA nói trên đều có độ dài khoảng 2,3 kb khi đối chiếu với marker λ HindIII, tương ứng độ dài DNA gen PB2 dự kiến với cặp mồi KPB2F – KPB2R (Hình 3.2). 2,3kb 2,3kb M 1 2 3 4 M 1 2 A B 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb
Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR
Ghi chú: (A): DNA gen PB2 của 4 biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và
DkTG926-2009, (M: Marker λ HindIII; 1: DkNA72-2007; 2: DkNA114-2007; 3: CkDT382-2008; 4:
DkTG926-2009). (B): DNA gen PB2 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1:
DkQT801-2011 và 2: DkQT802-2011).
+ Kết quả kiểm tra DNA gen PB1 thu nhận sau PCR:
- Kết quả ở hình 3.3A cho thấy, 4 mẫu kiểm tra DNA gen PB1 thu nhận sau PCR của 4 biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008 và
DkTG926-2009 theo thứ tự, đều có 1 băng sáng biểu hiện sản phẩm DNA độ dài khoảng 2,3 kb, tương ứng độ dài gen PB1 dự kiến (Hình 3.3A).
2,3kb 1,7kb 0,8kb M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 A B 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR
Ghi chú: (A): DNA gen PB1 của 4 biến chủng virus DkNA72-2007; DkNA114-2007; CkDT382-2008 và
DkTG926-2009, (M: Marker λ HindIII; 1: DkNA72-2007; 2: DkNA114-2007; 3: CkDT382-2008; 4:
DkTG926-2009). (B): DNA gen PB1 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (DNA đầu
3’- gen PB1, 1: DkQT801-2011; 2: DkQT802-2011; và DNA đầu 5’- gen PB1, 3: DkQT801-2011; 4:
DkQT802-2011).
- Các mẫu kiểm tra DNA đầu 3’- và 5’- gen PB1 lần lượt sau phản ứng PCR với từng cặp mồi KPB1F – PB1R3 và PB1F3 – KPB1R theo thứ tự, của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011, đều cho kết quả 1 sản phẩm DNA biểu hiện là 1 băng sáng trên hình điện di. Các sản phẩm DNA nói trên ở các mẫu tương ứng có độ dài lần lượt là 1,7 kb và 0,8 kb, đúng bằng độ dài của các đoạn DNA đầu 3’- và 5’- gen PB1 dự kiến với 2 cặp mồi thiết kế theo thứ tự (Hình 3.3B). Tổng độ dài hai đoạn sản phẩm DNA đầu 3’- và 5’- gen PB1 khoảng 2,5 kb, ở mỗi biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011.
+ Kết quả kiểm tra DNA gen PA thu nhận sau phản ứng PCR:
Cả 6 mẫu kiểm tra DNA gen PA thu nhận sau phản ứng PCR của 06 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, đều cho một sản phẩm DNA thể hiện là 1 băng sáng trên hình điện di có độ dài khoảng 2,2 kb, tương ứng độ dài gen PA dự kiến với cặp mồi đặc hiệu KPAF – KPAR (Hình 3.4).
Như vậy, DNA các gen PB2, PB1 và PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, đã được thu nhận thành công bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu với từng gen riêng biệt, từ khuôn cDNA hệ gen virus tương ứng.
2,2kb 2,2kb A B M 1 2 3 4 M 1 2 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 trong nghiên cứu thu nhận sau PCR
Ghi chú: (A): DNA gen PA của 4 biến chủng virus DkNA72-2007; DkNA114-2007; CkDT382-2008 và
DkTG926-2009, (M: Marker λ HindIII, 1: DkNA72-2007; 2: DkNA114-2007; 3: CkDT382-2008; 4:
DkTG926-2009). (B): DNA gen PA của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (1:
DkQT801-2011 và 2: DkQT802-2011)
Sản phẩm DNA các gen PB2, PB1 và PA sau khi được tinh sạch được sử dụng làm nguyên liệu cho dòng hóa, lưu trữ DNA nguồn gen trong plasmid tái tổ hợp và giải trình tự các gen nói trên.
* Kết quả dòng hóa DNA các gen PB2, PB1 và PA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp các gen PB2, PB1 và PA thu nhận sau dòng hóa của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, được kiểm tra bằng phản ứng cắt DNA sử dụng enzym EcoRI. Sản phẩm sau phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI, được điện di trên thạch agarose 1% và trình bày ở các hình 3.5 (gen PB2), hình 3.6 (gen PB1) và hình 3.7 (gen PA).
+ Kết quả thu nhận DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen PB2:
- Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen PB2 cho kết quả dương tính, khi có 3 sản phẩm DNA biểu hiện là 3 băng sáng có độ dài khác nhau đối chiếu với marker λ HindIII trên hình điện di, do trong gen PB2 có chứa 1 vị trí điểm cắt của enzym EcoRI bên cạnh 2 vị trí được thiết kế trên DNA plasmid pCR2.1®-TOPO®. Trong đó, 1 băng sáng có độ dài 3,9 kb là của DNA plasmid pCR2.1®-TOPO®, 2 băng sáng còn lại lần lượt là 1,2 kb và 1,1 kb cho tổng độ dài 2,3 kb, tương ứng độ dài của đoạn DNA gen PB2 thu nhận sau phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
- Kết quả trong hình 3.5 cho thấy, có các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp dương tính chứa DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus nghiên cứu, gồm: DkNA72-2007
(mẫu 1, hình 3.5A) và DkNA114-2007 (mẫu 2, hình 3.5A), CkDT382-2008 (mẫu 2, hình 3.5B), DkTG926-2009 (các mẫu 1 và 2, hình 3.5B); DkQT801-2011 (các mẫu 3 và 4, hình 3.5C) và DkQT802-2011 (các mẫu 5 và 6, hình 3.5C). 3,9kb 1,2kb 1,1kb 3,9kb 1,2kb 1,1kb 3,9kb 1,2kb 1,1kb B A M 1 2 3 M 1 2 3 4 5 6 C M 1 2 3 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb
Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI
Ghi chú: (A): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của DkNA72-2007 và DkNA114-2007, (M:
Marker λHindIII; 1: DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của DkNA72-2007; 2 và 3: DkNA114-2007). (B): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của CkDT382-2008 (1, 2 và 3: mẫu 1, 2 và 3). (C): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của DkTG926-2009; DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1 và 2: DkTG926- 2009; 3 và 4: DkQT801-2011; 5 và 6: DkQT802-2011).
+ Kết quả thu nhận DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen PB1:
Gen PB1 có chứa 2 vị trí điểm cắt của enzym EcoRI, nên các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp dương tính chứa gen PB1 đủ độ dài, sẽ có 4 băng sáng biểu hiện sản phẩm DNA độ dài khác nhau trên hình điện di. Trong đó, 1 băng sáng có độ dài 3,9 kb của DNA plasmid, 3 băng sáng còn lại lần lượt là 1,6 kb; 0,5 kb và 0,2 kb cho tổng độ dài 2,3 kb, tương ứng đoạn DNA gen PB1 đủ độ dài thu nhận sau phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
- Kết quả điện di ở hình 3.6 cho thấy, có các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp dương tính chứa gen PB1 đủ độ dài, của 4 biến chủng virus DkNA72-2007 (mẫu 2, hình 3.6A), DkNA114-2007 (các mẫu 5 và 6, hình 3.6A), CkDT382-2008 (các mẫu 1, 2 và 3, hình 3.6B) và DkTG926-2009 (các mẫu 4 và 5, hình 3.6B).
- Bốn mẫu DNA plasmid tái tổ hợp đoạn DNA đầu 3’- gen PB1 (1,7 kb), của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 (mẫu 1, 2) và DkQT802-2011 (mẫu 3, 4), đều cho kết quả dương tính với 2 sản phẩm DNA biểu hiện là 2 băng sáng trên hình điện di. Trong đó, 1 băng sáng có độ dài 3,9 kb là của DNA plasmid và 1 băng sáng 1,6 kb
tương ứng độ dài đoạn DNA đầu 3’- gen PB1, do có 1 đoạn DNA 0,1 kb không được thấy trên hình điện di (Hình 3.6C).
3,9kb 1,6kb 0,5kb 0,2kb 3,9kb 0, 5kb 1,6kb 0, 2kb 3,9kb 0, 5kb 1,6kb 0, 2kb M 1 2 3 4 5 6 C D A B M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 3,9kb 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb
Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI.
Ghi chú: (A): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 đủđộ dài của DkNA72-2007 và DkNA114-2007,
(M: Marker λHindIII; 1,2,3: DkNA72-2007; 4, 5 và 6: DkNA114-2007). (B): Các mẫu DNA plasmid tái tổ
hợp gen PB1 của CkDT382-2008 và DkTG926-2009, (1, 2 và 3: CkDT382-2008; 4, 5 và 6: DkTG926-2009).
(C): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp DNA đầu 3’- gen PB1 của DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1 và
2: DkQT801-2011; 3 và 4: DkQT802-2011). (D): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp DNA đầu 5’- gen PB1
của DkQT801-2011 và DkQT802-2011, (1, 2: DkQT801-2011; 3, 4: DkQT802-2011).
- Tương tự, 4 mẫu DNA plasmid tái tổ hợp đoạn DNA đầu 5’- gen PB1 (0,8 kb), của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 (mẫu 1, 2) và DkQT802-2011 (mẫu 3, 4), cũng cho kết quả dương tính với 3 sản phẩm DNA biểu hiện là 3 băng sáng có độ dài khác nhau trên hình điện di. Trong đó, 1 băng sáng 3,9 kb là của DNA plasmid cùng với 2 băng sáng có độ dài lần lượt khoảng 0,5 kb và 0,2 kb, cho tổng độ dài là 0,7 kb tương ứng với độ dài sản phẩm DNA đầu 5’- gen PB1, do có 1 đoạn DNA 0,1 kb không được thấy trên hình điện di (Hình 3.6D). Tổng độ dài các đoạn DNA đầu 3’- và DNA đầu 5’- của gen PB1, được gài trong DNA plamid tái tổ hợp khoảng 2,5 kb, phù hợp với tổng độ dài DNA gen PB1 thu nhận từ 2 cặp mồi thiết kế.
+ Kết quả kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp chứa DNA gen PA:
- Tương tự như gen PB1, gen PA cũng có chứa 2 vị trí điểm cắt của enzym
EcoRI, nên các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp dương tính chứa gen PA, sẽ có 4 băng sáng biểu hiện 4 sản phẩm DNA độ dài khác nhau trên hình điện di. Trong đó, 1 băng sáng 3,9 kb là DNA plasmid, 3 băng sáng còn lại có độ dài lần lượt là 1,6 kb, 0,4 kb và 0,2 kb cho tổng độ dài 2,3 kb, bằng độ dài đoạn DNA gen PA thu nhận với cặp mồi đặc hiệu. 3,9kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 1,6kb 0,4kb 0,2kb 3,9kb 1,6kb 0,4kb 0,2kb A B 2,3 kb 2,0 kb 0,5 kb 4,0 kb
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI.
Ghi chú: (A): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 4 biến chủng virus DkNA72-2007, DkNA114-
2007, CkDT382-2008 và DkTG926-2009 (M: Marker λHindIII, 1 và 2: DkNA72-2007; 3 và 4: DkNA114-
2007; 5 và 6: CkDT382-2008; 7 và 8: DkTG926-2009). (B): Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 2
biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 (1,2, 3: DkQT801-2011 và 4, 5, 6: DkQT802-2011). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kết quả trong hình 3.7 cho thấy, có các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp dương tính chứa DNA gen PA của 6 biến chủng virus nghiên cứu, bao gồm: DkNA72-2007 (mẫu 1, hình 3.7A), DkNA114-2007 (mẫu 4, hình 3.7A), CkDT382-2008 (các mẫu 5 và 6, hình 3.7A) và DkTG926-2009 (các mẫu 7 và 8, hình 3.7A), DkQT801-2011 (mẫu 2, hình 3.7B) và DkQT802-2011 (mẫu 4, hình 3.7B).
Như vậy, DNA sản phẩm PCR của các gen PB2, PB1 và PA trong hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu, gồm: DkNA72-2007, DkNA114-2007, CkDT382-2008, DkTG926-2009, DkQT801-2011 và DkQT802-2011, đã được gài thành công trong plasmid tái tổ hợp.
Các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp dương tính chứa các gen PB2, PB1 và PA kể trên, được bảo quản ở nhiệt độ -200C và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự các gen tương ứng.