Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Kỹ thuật dòng hóa DNA
* Mục đích: Thu nhận một số lượng lớn bản sao đoạn/phân đoạn DNA sản phẩm PCR/RT-PCR một cách chính xác làm nguyên liệu cho giải trình trình tự.
* Nguyên lí: Dòng hóa (cloning) DNA là ghép-nối (ligation) một đoạn/phân đoạn DNA ngoại lai (sản phẩm PCR/RT-PCR), trong một vòng DNA được thiết kế sẵn, gọi là plasmid mang (vector dẫn truyền), tạo ra vector tái tổ hợp và chuyển nạp (transformation) vào tế bào chủ thích ứng (thường sử dụng là tế bào vi khuẩn
Escherichia coli thuần chủng, E. coli) tạo dòng tế bào tái tổ hợp [8], [106], [107].
* Kỹ thuật: Trong nghiên cứu thực hiện dòng hóa, lưu giữ DNA các gen PB2,
PB1 và PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 trong plasmid tái tổ hợp, bằng bộ kit tách dòng TA cloning® Kit (Invitrogen, Nhật Bản). Sau đó, thu nhận DNA plasmid tái tổ hợp bằng bộ kit AccuPrep® Plasmid mini Extraction Kit (Bioneer,
Hàn Quốc). Kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp cần thu nhận bằng phản ứng cắt sử dụng enzym giới hạn (restriction enzym) EcoRI. Gồm các bước cụ thể như sau:
+ Ghép-nối đoạn DNA sản phẩm PCR vào plasmid mang
- Plasmid mang sử dụng để “ghép-nối” các đoạn DNA, sản phẩm của phản ứng PCR/RT-PCR, thường sử dụng là vector pCR2.1 hoặc pCR2.1®-TOPO®, được cung cấp theo bộ kit TA cloning® Kit của hãng Invitrogen (Nhật Bản). Đây là loại vector thiết kế có đầu lồi thymin (T) phù hợp gắn với các đoạn DNA đã được gắn thêm adenin (A) ở đầu 3’-, sản phẩm của phản ứng PCR sử dụng enzym Taq–DNA polymerase, theo nguyên tắc bổ sung nhờ enzym nối T4–DNA ligase hoặc enzym topoisomerase tạo nên plasmid tái tổ hợp chứa đoạn DNA ngoại lai (Hình 2.4).
Hình 2.4. Sơ đồ cấu trúc của vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen)
Ghi chú: PCR product: vị trí “ghép–nối” đoạn DNA ngoại lai trong plasmid; T7 promotor: vị trí gen khởi động T7; M13 Forward (-20) primer: vị trí bám mồi giải trình tự M13F; M13 Reverse primer: vị trí bám mồi giải trình tự M13R).
- Vị trí để “ghép-nối” đoạn DNA ngoại lai, sản phẩm PCR, nằm trong trình tự gen lacZ, gen này mã hóa tổng hợp enzym β-galactosidasexúc tác thủy phân X-gal
tạo ra các dẫn chất có màu xanh, khi chuyển nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli và nuôi cấy trong môi trường có chứa X-gal. Các vi khuẩn mang plasmid không chứa đoạn DNA ngoại lai tái tổ hợp, gen lacZ sẽ tổng hợp protein có hoạt tính enzym β- galactosidase, phân hủy X-gal tạo nên khuẩn lạc màu xanh.Trái lại, khi đoạn DNA ngoại lai được gắn vào vị trí “ghép-nối” trong gen lacZ, làm cho gen này không hoạt động hoặc mã hóa tổng hợp protein không có hoạt tính enzym β-galactosidase,
X-gal trong môi trường nuôi cấy không bị phân hủy và khuẩn lạc của các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp sẽ có màu trắng.
- Thành phần phản ứng “ghép-nối” đoạn DNA sản phẩm PCR, vào plasmid pCR®2.1-TOPO® được trình bày ở bảng 2.10.
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép - nối đoạn DNA sản phẩm PCR vào plasmid pCR®2.1-TOPO®
Tên hóa chất Thể tích (µl)
10X Ligation Buffer 1
Vector pCR®2.1-TOPO® (25ng/µl) 1
Enzym T4-ligase(5U/µl) 1
Nước tinh khiết (khử ion) 4
DNA sản phẩm PCR (50ng/µl) 3
Tổng thể tích: 10
- Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 140C trong vòng ít nhất 6 - 8 giờ. Sau đó chuyển nạp vào tế bào khả biến DH5α-T1 và nuôi cấy trên đĩa Petri chứa môi trường thạch LB (Luria-Bertani agar) 1,5 % có chứa kháng sinh và X-gal.
+ Chuyển nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến DH5α-T1:
Tế bào sử dụng để chuyển nạp là tế bào khả biến (competent cells) E.coli
chủng DH5α-T1 hoặc chủng Top10, được cung cấp theo bộ kit TA cloning® Kit (Invitrogen, Nhật Bản). Hệ gen của chủng DH5α-T1 đã được loại bỏ gen mã hóa enzym nuclease, do đó tránh được hiện tượng phân cắt các đoạn DNA ngoại lai. Mặt khác, lớp thành tế bào cũng được biến đổi nhằm tăng khả năng tiếp nhận các DNA plasmid ngoại lai trong quá trình chuyển nạp, hệ enzym trong tế bào E.coli
chủng DH5α - T1 phù hợp với vector tách dòng pCR®2.1-TOPO®, giúp gia tăng khả năng nhân lên của plasmid tái tổ hợp ở trong tế bào. Khi được chuyển nạp vào tế bào, plasmid tái tổ hợp sẽ cùng nhân lên và phân chia cùng với hệ gen tế bào chủ khi tế bào phân chia trong môi trường nuôi cấy.
Chọn lọc và nuôi cấy các dòng vi khuẩn (khuẩn lạc, clone) được thực hiện theo các bước trình bày trong phụ lục 5 (xem phụ lục 5).
+ Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp từ dòng vi khuẩn nuôi cấy:
Chúng tôi sử dụng bộ kit AccuPrep® Plasmid mini Extraction Kit (Bioneer, Hàn Quốc), để tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp từ các dòng vi khuẩn sau chuyển nạp.
- Qui trình tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục 6).
- Kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng cắt sử dụng enzym EcoRI: Do vector pCR®2.1TOPO® được thiết kế có điểm cắt của enzym giới hạn EcoRI (trình tự nucleotide nhận biết điểm cắt là -GGGTTC-) tại hai đầu của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai, nên khi được cắt bằng EcoRI, phân tử DNA plasmid tái tổ hợp được cắt thành hai đoạn hoặc 3 đoạn (trình tự đoạn DNA ngoại lai có chứa điểm cắt của EcoRI). Trong đó, một đoạn DNA có độ dài 3,9 kb của vector pCR®2.1TOPO®, và 1 hoặc 2 đoạn có tổng độ dài tương ứng với độ dài đoạn DNA sản phẩm PCR được gài vào vùng nhân dòng của vector. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI được trình bày trong bảng 2.11.
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Buffer cho EcoRI 2
Enzym EcoRI 1
DNA plasmid tái tổ hợp 1
Nước tinh khiết 16
Tổng thể tích: 20
Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp sau phản ứng cắt bằng EcoRI được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1 %.