Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.7.Giải trình tự DNA
* Mục đích: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu
nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu.
Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật xác định trình tự dideoxy chain termination method (kỹ thuật enzym) của Sanger, được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử hiện nay [8], [106], [107].
* Nguyên lí: Kỹ thuật xác định trình tự DNA dideoxy chain termination method, sử dụng các nucleotide không chứa nhóm 3’-OH tự do (dideoxy nucleotide
triphosphat, dd-NTPs), để dừng ngẫu nhiên phản ứng tổng hợp tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide [8], [107].
* Kỹ thuật: Trong nghiên cứu, tiến hành giải trình tự đoạn DNA các gen: PB2,
PB1 và PA của virus cúm A/H5N1, từ mẫu DNA plasmid tái tổ hợp chứa các gen trên, tại Phòng thí nghiệm trọng điểm của Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, kết hợp gửi mẫu giải trình tự so sánh đối chiếu tại Phòng thí nghiệm của hãng Bioneer (Hàn Quốc).
Mỗi gen PB2, PB1 hay PA do có kích thước lớn (2,3 kb), được thực hiện giải trình tự bằng 3 phản ứng.
Mỗi phản ứng giải trình tự ở trên chỉ sử dụng một trong các mồi: . Mồi xuôi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ hoặc . Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’, hoặc . Mồi giữa giải trình tự đặc hiệu với từng gen (Bảng 2.2).
- Sử dụng bộ kit giải trình tự Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Thành phần của phản ứng giải trình tự được trình bày ở bảng 2.12.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Big Dye 3.1 1
DNA plasmid tái tổ hợp (~50ng/µl) 3 Mồi giải trình tự (1pMol/µl) 3,2
Nước tinh khiết 3,8
Enhance (hóa chất kích hoạt) 2X 10
Tổng thể tích 20
- Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR trong giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA, của 6 biến chủng virus nghiên cứu, được trình bày ở bảng 2.13.
Bảng 2.13. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR trong giải trình tự DNA các gen PB2 PB1 và PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
920C 05 phút 1
960C 30 giây
500C 05 giây
600C 06 phút
30 40C Nhiệt độ bảo quản sản phẩm
- Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình tự bằng bộ kit: DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN Inc., Mỹ) (xem phụ lục 7).
Sản phẩm sau khi tinh sạch được đông khô và đọc trình tự trên máy tự động ABI-3100 Avant Genetics Analyzer (Mỹ), có tại Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.8. Xử lí, kiểm chứng, thu nhận trình tự nucleotide và amino acid của các gen nghiên cứu