Đặc điểm G. spinigerum G. hispidum G. doloresi
Số hàng gai trên đầu 4 4 4
Số gai trên mỗi hàng > 40 <40 <40
2.2.5.4. Kỹ thuật sinh học phân tử
- Phương pháp tách chiết ADN bằng màng lọc silica (High Pure PCR Template Preparation Kit-Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Đức).
- Dung dịch muối đệm và pH acid, phá vỡ liên kết và bảo vệ đặc tính của Guanidine thiocyanate (GTC) và -mercaptoethanol làm các nuclease,
ribonuclease hiện diện trong tế bào bất hoạt. GTC liên kết với SDS phá vỡ phức hợp nucleoprotein, cho phép ADN được giải phóng vào dung dịch và tách rời protein. Sau khi ly tâm làm sạch các kết tủa protein và các mảnh vụn tế bào, ADN sẽ được kết tủa với ethanol và gắn trên bề mặt các sợi silica của màng lọc.
- Mỗi bộ cột ly trích (Spin Columm Assembly) gồm: màng lọc (Spin Basket), tube thu thập (Colection tube)
- Kết quả tinh sạch kết tủa protein và các mảnh vụn tế bào nhờ màng lọc với lực ly tâm. Phản ứng xảy ra nhanh do sự phá vỡ phân tử nước bởi Chaotropic salt. Vì vậy các nucleic acid hấp thụ vào các silica.
- Các phân tử ADN gắn kết sẽ được làm sạch bằng dung dịch muối đệm. Loại bỏ protein và những phần tế bào cịn sót lại bằng giai đoạn rửa. Cuối cùng ADN được hồ tan bởi nước cất khơng có Nuclease [89].
- Xác định giống Gnathostoma spp vùng gen cox-1 theo Jurairat và cs., 2015 - Đoạn ADN đặc hiệu cho giống Gnathostoma gen đích có kích thước tương ứng 250 bp sử dụng cặp: Mồi xuôi Gn_COI F: 5'-GCC TGC TTT TCG AAT TTT TAG-3' và mồi ngược Gn_COI R: 5'-ACG AAA ATC ATA CTA AGT AGC CAA-3' đặc hiệu Gnathostoma spp của vùng trình tự gen cox1 [70].
- Thành phần phản ứng PCR trong thể tích 50 µl, trong đó có chứa: 5 µl đệm Taq (10X); 9 µl MgCl2 (25 mM); 1 µl mỗi loại dNTP’s (10 mM); 5 µl mỗi loại mồi đặc hiệu; 0,2 µl enzyme Taq polymerase (5 U/µl); 5 µl ADN mẫu pha loãng (20 ng); bổ sung nước khử ion tới thể tích 50 µl theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Promega, Hoa Kỳ).
- Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt: bước 1: 95oC, 3 phút; bước 2: 94oC, 1 phút; bước 3: 55oC, 1 phút; bước 4: 72oC, 1 phút; bước 5: 72oC, 5 phút; từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 39 chu kỳ; bước 6: 4oC, bảo quản mẫu.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide và tinh sạch theo bộ kít của hãng Promega, Mỹ. - Chụp ảnh bằng thiết bị iBrightTM Imaging System FL 1000 (ThermoFisher Scientific, Mỹ) với phần mềm phân tích iBright Analysis Software trên máy.
Định loài G. spinigerum bằng gen cox-1:
- Nhân đoạn ADN đích có kích thước 450 bp bằng mồi xi JB3 F: 5'-TTT TTT GAG CAT CCT GAG GTT TAT-3’ và mồi ngược JB4.5 R: 5'-TAA AGT
AAG AAC ATA CTG AAA ATG-3' đặc hiệu G. spinigerum của vùng trình tự gen cox1 (Charinthon và cs., 2005) [81].
- Thành phần phản ứng nhân lượng PCR trong thể tích 50 µl chứa 5 µl đệm Taq (10X); 9 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl mỗi loại dNTP’s (10 mM), 5 µl mỗi loại mồi đặc hiệu, 0,2 µl enzyme Taq polymerase (5 U/µl), 5µl ADN mẫu pha loãng (20 ng). Bổ sung nước khử ion tới thể tích 50 µl theo hướng dẫn của nhà sản xuất Promega, Mỹ.
- Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau: Bước 1 (95oC, 3 phút), bước 2 (94oC, 1 phút), bước 3 (55oC, 1 phút), bước 4 (72oC, 1 phút), bước 5 (72oC, 5 phút). Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 39 chu kỳ và bước 6 ở điều kiện 4oC, bảo quản mẫu. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,5%, nhuộm bản thạch trong dung dịch Ethidium bromide và tinh sạch theo kít của hãng Promega, Mỹ.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide và tinh sạch theo bộ kít của hãng Promega, Mỹ.
- Chụp ảnh bằng thiết bị iBrightTM Imaging System FL 1000 (ThermoFisher Scientific, Mỹ) với phần mềm phân tích iBright Analysis Software trên máy.
2.2.5.5. Giải trình tự gen
- Khuếch đại gen ADN đích có kích thước 600 bp bằng mồi xuôi NEWS2 F:5'- TGTGTAGATGAAGTACGCAG-3' và mồi ngược ITS2-RIXO R:5'- TTCTATGATTAAATT CCG GGG-3' đặc hiệu cho Gnathostoma spp theo Almeyda-Artigas (2000) [39].
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit Wizard SV Gel and PCR Clean – Up System
(Promega – Mỹ). Đo nồng độ sản phẩm PCR được tinh sạch bằng máy Genova
Nano Spectrophotometer Micro Volume Accessory (Bibby Scientific – Anh). Tính tốn và pha lỗng nồng độ AND phù hợp để giải trình tự. Thực hiện PCR
nhân đoạn AND cần giải trình với bộ sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Hãng ABI – Mỹ).
- Giải trình tự được gửi qua First BASE Laboratories – Axil Scientific, Malaysia tiến hành trên máy ABI 3730 Series Genetic Analyzer. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit v.2.6 (Tom Hall, 2017) phân tích so sánh trình tự gen mẫu Gnathostoma spp trong ngân hàng GENBANK. Sau khi đã tổng hợp các số liệu, đưa vào phần mềm MEGA 6 (Temura, 2013). So sánh trình tự các mẫu trong nghiên cứu với trình tự Gnathostoma spp đã được cơng bố trên ngân hàng gen trên BLAST [44] và dựng cây phân loài mối quan hệ di truyền.
2.2.6. Các chỉ số đánh giá
- Chỉ số hình thể: Chiều dài, chiều rộng, số hàng gai Gnathostoma spp qua kính hiển vi.
- Phân đoạn gen đặc hiệu Gnathostoma spp từng lồi có đoạn gen có độ dài đặc hiệu, kích thước 250bp, 450bp và 600bp [55].
- Hệ số tương đồng trên genbank so với loài Gnathostoma của các nước 99 – 100%.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
- Các chỉ số về hình thái được nhập phần mềm excel win 10, sử dụng phân tích thống kê tính các số trung bình, độ lệch chuẩn (SD), Min, Max.
- Số liệu được nhập vào phần mềm Excel V16.0. Trình tự gen thu được sau giải trình tự, được xử lý bằng phần mềm Bioedit v.2.6 (Tom Hall, 2017) và MEGA 6 (Temura, 2013). So sánh trình tự các mẫu trong nghiên cứu với trình tự
Gnathostoma spp đã được công bố trên ngân hàng gen trên BLAST [44] và
2.3. Sai số và biện pháp hạn chế sai số
- Soạn kỹ bảng câu hỏi, văn phong đơn giản, dễ hiểu, phù hợp với đối tượng tham gia nghiên cứu. Thử nghiệm bảng câu hỏi trước khi đưa vào nghiên cứu. - Cỡ mẫu và cách chọn mẫu phải đúng theo công thức của phương pháp nghiên cứu kinh điển.
- Trước khi tiến hành nghiên cứu, tất cả thành viên tham gia được tập huấn Thực hành lâm sàng tốt (GCPs) theo các bước thực hiện trong đề cương. - Số liệu cần nhập sau khi có các thơng tin của bệnh nhân và lưu giữ các dữ liệu nguồn để khi cần có thể kiểm sốt, đối chiếu lại.
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu
2.4.1. Sự phê duyệt Hội đồng Khoa học và Đạo đức y sinh
- Đề tài thực hiện với đề cương đã được thông qua Hội đồng Khoa học và Đạo đức Y sinh học của Viện Sốt rét-Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương và sự đồng ý lấy mẫu của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn, Phòng khám Đa khoa Trọng Nghĩa thành phố Hồ Chí Minh.
- Tất cả thời điểm, tính an tồn phải luôn đảm bảo cho bệnh nhân.
- Bất kỳ sự thay đổi nào cũng phải xin ý kiến chấp thuận của Hội đồng Đạo đức y sinh học cơ sở đào tạo trước khi thay đổi trong nghiên cứu.
- Nghiên cứu viên chính có trách nhiệm tuân theo các đánh giá của Hội đồng Đạo đức Y sinh học về quá trình thực hiện nghiên cứu.
2.4.2. Cam kết tham gia nghiên cứu thông qua
- Bệnh nhân hoặc người nhà, người giám hộ đồng ý, chấp thuận sau khi nghe rõ quyền lợi và trách nhiệm khi tham gia nghiên cứu, hoặc trong trường hợp khơng biết tiếng có thể tận dụng người địa phương chuyển dịch bằng ngôn ngữ địa phương nghe rõ trước khi tham gia nghiên cứu.
- Tất cả câu hỏi của bệnh nhân hoặc thân nhân đều phải được nhóm nghiên cứu trả lời rõ ràng, cụ thể. Giải thích về lợi ích, quyền lợi và cả nguy cơ có thể xảy ra sau uống thuốc. Ngay cả việc thực hiện xét nghiệm cho các đối tượng trong độ tuổi sinh sản cũng cần sự đồng ý.
2.4.3. Bảo mật thông tin và số liệu
- Tất cả thông tin liên quan đến đối tượng nghiên cứu sẽ được bảo mật và chỉ chia sẻ với các thành viên trong nhóm nghiên cứu.
- Trưởng nhóm nghiên cứu phải đảm bảo cất giữ hồ sơ và sản phẩm nghiên cứu (máu toàn phần và huyết thanh) cẩn trọng.
- Tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y, sinh học như: Trước khi nghiên cứu đối tượng nghiên cứu phải được thơng báo và nói rõ mục đích nghiên cứu, chỉ nghiên cứu ở người tự nguyện.
- Giữ bí mật về tình trạng sức khoẻ của người tham gia nghiên cứu. - Tận tình giúp đỡ, tư vấn, điều trị bệnh cho người tham gia nghiên cứu.
2.4.4. Dịch vụ chăm sóc y tế
- Chăm sóc y tế thơng qua khám, chẩn đốn và điều trị toàn diện trong suốt quá trình nghiên cứu và theo dõi bệnh nhân sau uống thuốc.
- Nếu có vấn đề y tế khác khơng liên quan nhiễm giun Gnathostoma spp, bác sỹ có trách nhiệm chuyển cho bệnh nhân điều trị trong khả năng tốt nhất.
2.4.5. Sự khích lệ và động viên đối tượng tham gia hoàn tất theo dõi
- Tất cả bệnh nhân trong diện nghiên cứu sẽ được xét nghiệm và dùng thuốc theo đề cương phê duyệt.
- Ln ln khuyến khích họ đến điểm nghiên cứu để đạt số mẫu như yêu cầu đề cương và theo dõi đầy đủ.
- Người tham gia nghiên cứu có quyền từ chối tham gia bất cứ lúc nào mà khơng cần phải giải thích lý do.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Mô tả đặc điểm lâm sàng & cận lâm sàng bệnh do Gnathostoma spp
trên người tại phía Nam Việt Nam (2016-2017).
3.1.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu
Trong thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu nhận được 112 bệnh nhân hội đủ tiêu chuẩn nhận bệnh (66 bệnh nhân tại Viện Sốt rét Ký sinh trùng Côn trùng Quy Nhơn và 46 bệnh nhân tại Phòng khám Đa khoa Trọng Nghĩa thành phố Hồ Chí Minh), phân bố ở 28 tỉnh thành, từ các tỉnh miền núi cho đến các tỉnh đồng bằng và vùng biển như sau:
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo địa chỉ nơi ở (tỉnh/ thành phố) TT
Địa chỉ cư trú, làm việc
(tỉnh, thành phố) Số ca (n) Tỷ lệ (%) 1. Bình Định 19 16,96 2. Đăk Lăk 12 10,71 3. Gia Lai 12 10,71 4. Quảng Ngãi 7 6,25 5. TP. Hồ Chí Minh 7 6,25 6. An Giang 4 3,57 7. Long An 4 3,57 8. Tiền Giang 4 3,57 9. Cà Mau 3 2,68 10. Cần Thơ 3 2,68 11. Đăk Nông 3 2,68 12. Khánh Hòa 3 2,68 13. Phú Yên 3 2,68 14. Quảng Nam 3 2,68 15. Trà Vinh 3 2,68 16. Vĩnh Long 3 2,68
17. Bạc Liêu 2 1,79 18. Bến Tre 2 1,79 19. Bình Dương 2 1,79 20. Đồng Nai 2 1,79 21. Hậu Giang 2 1,79 22. Kon Tum 2 1,79 23. Sóc Trăng 2 1,79 24. Đồng Tháp 1 0,89 25. Kiên Giang 1 0,89 26. Lâm Đồng 1 0,89 27. Ninh Thuận 1 0,89 28. Tây Ninh 1 0,89
Nhận xét: Thống kê thấy tình trạng nhiễm giun Gnathostoma spp. xảy ra ở 28
tỉnh, trong đó bệnh nhân đến từ tỉnh Bình Định chiếm tỷ lệ cao nhất với 19 ca 16,96%, kế đến là 2 tỉnh Đăk Lăk và Gia Lai đều chiếm 12 ca 10,71%, số bệnh nhân đến ghi nhận từ Quảng Ngãi và thành phố Hồ Chí Minh là 7 ca 6,25%. Các tỉnh cịn lại có số bệnh nhân thấp hơn 5 ca (Lâm Đồng, Ninh Thuận, Kiên Giang, Đồng Tháp, Đồng Tây Ninh đều có 1 ca 0,89%, các tỉnh Bạc Liêu, Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Hậu Giang, Kon Tum, Sóc Trăng đều là 2 ca 1,79%, các tỉnh Cà Mau, Đăk Nơng, Khánh Hịa, Quảng Nam, Phú Yên, Trà Vinh, Vĩnh Long đều có 3 ca 2,68%, các tỉnh An Giang, Long an, Tiền Giang đều có 4 ca 3,57%.
Bảng 3.2: Phân bố bệnh nhân theo tuổi (n = 112) Tuổi Số lượng (+) Tỷ lệ (%)
<15 tuổi 20 17,86
15 - < 30 tuổi 17 15,18
Nhận xét: 112 bệnh nhân nghiên cứu, bệnh nhân có tuổi nhỏ nhất là 5 và lớn
nhất là 75 trong đó nhóm tuổi trên 45 chiếm tỷ lệ cao nhất là 41,07%, tuổi từ 15 đến 30 chiếm tỷ lệ thấp nhất là 15,18%.
Hình 3.1: Biểu đồ phân bố bệnh nhân theo giới tính (n= 112)
Nhận xét: Bệnh nhân nữ chiếm 62,5%; nam 37,5%. Tỷ lệ Nữ/Nam là 1,67.
Bảng 3.3: Phân bố bệnh nhân theo tuổi và giới tính (n = 112)
Tuổi Nam Nữ Giá trị p
<15 tuổi 15 (75,00%) 5 (25,00%) < 0,05 15 - < 30 tuổi 5 (33,33%) 10 (66,67%) > 0,05 30 - < 45 tuổi 7 (25,00%) 21 (75,00%) < 0,05 ≥ 45 tuổi 15 (30,61%) 34 (69,39%) < 0,05
Tổng 42 (37,50%) 70 (62,50%)
Nhận xét: Nhóm tuổi dưới 15, nam nhiễm giun đầu gai 75,0% cao hơn nữ
25,0%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Nhóm tuổi từ 30 đến dưới 45, nam nhiễm giun đầu gai 25,0% thấp hơn nữ 75,0%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Nhóm tuổi trên 45, nam nhiễm giun đầu gai 30,61% thấp hơn nữ 69,39%, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
Nữ: 62,50% Nam:
Bảng 3.4: Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp (n = 112)
Nghề nghiệp Số (+) Tỷ lệ (%)
Công nhân viên chức 28 25,00
Nông dân 20 17,86 Kinh doanh/Buôn bán 17 15,18 Sinh viên 15 13,39 Học sinh 13 11,60 Ngư dân 05 4,46 Khác 13 11,60
Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm có sự khác nhau giữa các nghề trong đó cao nhất là công
nhân viên chức 25%, thấp nhất là ngư dân 4,46%.
Bảng 3.5: Phân bố bệnh nhân theo trình độ học vấn (n = 112) Trình độ học vấn Số lượng (+) Tỷ lệ (%)
Mù chữ 03 2,68
Tiểu học 23 20,54
Trung học cơ sở 32 28,57
Trung học phổ thông 25 22,32
Trên trung học phổ thông 29 25,89
Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm có sự khác nhau giữa các trình độ học vấn. Cao nhất là
trung học cơ sở 28,57%, thấp nhất là mù chữ 2,68%.
Bảng 3.6: Phân bố bệnh nhân theo dân tộc (n = 112)
Dân tộc Số lượng (+) Tỷ lệ (%)
Kinh 107 95,54
Khác(Êđê, Jrai, Tày, Khờ me) 5 4,46
3.1.2. Các yếu tố nguy cơ
Bảng 3.7: Phân bố bệnh nhân theo yếu tố nguy cơ (n = 112)
TT Yếu tố nguy cơ Số lượng (+) Tỷ lệ (%)
1 Ăn cá sống hay tái (hải sản và nước ngọt) 80 71,43
2 Thịt ếch um, xào chưa chín hoặc gỏi 73 65,18
3 Ăn rau sống đơn thuần hoặc xà lách trộn 72 64,29
4 Ăn ốc dạng hấp hoặc thái lát trộn 69 61,61
5 Ăn lươn sống hay tái 49 43,75
6 Ăn hải sản dạng xà lách trộn còn sống 43 38,39 7 Ăn thịt rắn (làm gỏi, uống huyết rắn) 36 32,14
8 Tôm, cá thái mỏng chấm với mù tạt 31 27,68
9 Vẹm, sò huyết ăn với mù tạt 23 20,54
10 Uống nước sông, giếng chưa đun sôi 15 13,39
Nhận xét: Trong số 112 bệnh nhân nghiên cứu, bốn nhóm yếu tố nguy cơ chiếm
tỷ lệ cao nhất là Ăn cá sống hay tái (hải sản và nước ngọt) 71,43%, Thịt ếch um, xào chưa chín hoặc gỏi 65,18%, Ăn rau sống đơn thuần hoặc xà lách trộn 64,29%, Ăn ốc dạng hấp hoặc thái lát trộn 61,61%. Nhóm uống nước sơng, giếng chưa đun sơi chiếm tỷ lệ thấp nhất 13,39%.
3.1.3. Đặc điểm lâm sàng
Trong nghiên cứu này phân mốc thời gian biểu hiện bệnh trước nhập viện là < 7 ngày, 7 - < 15 ngày, 15 - < 30 ngày, 30 - < 45 ngày và ≥ 45 ngày. Kết quả như sau:
Bảng 3.8: Phân bố số ngày biểu hiện bệnh trước khi nhập viện (n = 112) TT Số ngày biểu hiện bệnh
trước khi vào viện
Số lượng (+) Tỷ lệ (%) 1 < 7 ngày 3 2,68 2 7 - < 15 ngày 13 11,61 3 15 - < 30 ngày 35 31,25 4 30 - < 45 ngày 35 31,25 5 ≥ 45 ngày 26 23,21
Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm có sự khác nhau về số ngày biểu hiện bệnh trước khi vào
viện, chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm từ 15 đến 30 ngày và nhóm từ 30 đến 45 ngày 31,25%, tỷ lệ thấp nhất là nhóm đến khám sớm trước 7 ngày 2,68%.
Hình 3.2: Biểu đồ thể trạng bệnh nhân (n = 112)