Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. Bệnh học
1.4.3. Triệu chứng cận lâm sàng
Xét nghiệm huyết học, sinh hóa
+ Xét nghiệm cơng thức máu tồn phần: Xác định trị số tuyệt đối BCAT
+ Tăng BCAT là dấu hiệu quan trọng, có thể là chỉ báo sớm để chẩn đoán và đánh giá hiệu quả điều trị [56] [91].
Bảng 1.3: Giá trị bạch cầu và bạch cầu ái toan [84]
Chỉ số Giá trị thường Tăng bạch cầu
Số lượng bạch cầu 4.000-10.000/ mm3 máu Khi > 10.000/ mm3 máu Bạch cầu ái toan 100-500 BC/ mm3 máu Khi > 500 BC/ mm3 máu
+ Sinh hóa máu: Các xét nghiệm kiểm tra enzym SGOT, SGPT, GGT.
Bảng 1.4: Giá trị enzym gan
(Theo quyết định số 2570/QĐ-BYT Ngày 24/7/2012 của Bộ Y tế)
Chỉ số Giá trị bình thường Tăng
SGOT ≤ 40 UI/L > 40UI/L
SGPT ≤ 40 UI/L > 40UI/L
Xét nghiệm miễn dịch học
Các xét nghiệm huyết thanh học có thể giúp chứng thực chẩn đoán lâm sàng. Tuy nhiên, các xét nghiệm này không cung cấp bằng chứng khoa học cho danh tính của các lồi ký sinh trùng, bởi vì tất cả các lồi Gnathostoma phản ứng chéo huyết thanh với nhau.
Có nhiều kỹ thuật miễn dịch đã được sử dụng để chẩn đoán bệnh nhiễm
Hiện nay, kỹ thuật ELISA là kỹ thuật được dùng phổ biến trong các phòng xét nghiệm để phát hiện kháng thể IgG có trong huyết thanh bệnh nhân giun đầu gai. Kỹ thuật này có ưu điểm là độ nhạy cao, ít tốn kém hóa chất, cho kết quả nhanh, giá thành rẻ; độ đặc hiệu tùy thuộc chất lượng kháng nguyên. Kỹ thuật này dùng men để đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể, từ đó phát hiện sự kết hợp đặc hiệu của chúng.
Các bộ sinh phẩm được điều chế từ những kháng nguyên khác nhau có độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau, từ 56-100% [17] [23]. Một nghiên cứu tại Nhật Bản về phát triển bộ sinh phẩm ELISA sử dụng kháng nguyên làm từ giun trưởng thành Gnathostoma doloresi để chẩn đoán bệnh nhiễm Gnathostoma ở người, cho biết kháng nguyên này kém đặc hiệu hơn kháng nguyên được làm từ ấu trùng giai đoạn 3 của G. spinigerum nhưng có độ nhạy tương tự nhau. Sử dụng kháng nguyên chất tiết của ấu trùng giai đoạn 3 của G. spinigerum sẽ giảm
được các phản ứng chéo với Toxocara canis, Anisakis, Paragonimus westermani và Fasciola sp [102]. Kháng nguyên 21 kDa được điều chế từ G. spinigerum cho kết quả dương tính 100% với huyết thanh từ bệnh nhân bệnh
giun đầu gai và IgG 4 là kháng thể cho phản ứng dễ dàng hơn [63]. IgG 4 có chín dải băng đặc hiệu với trọng lượng phân tử 94, 51, 47, 43, 38, 24, 21, 20 và 15 kDa. Độ nhạy của mỗi dải băng trong số chín dải băng phản ứng nằm trong khoảng 64,3% - 100%. Tất cả các trường hợp kháng nguyên chất tiết thô của ấu trùng giai đoạn 3 của G. spinigerum tương ứng 21 kDa ở người nhiễm
Gnathostoma, với độ nhạy và độ đặc hiệu 100%. Các dải băng protein 20 và 24
kDa là các dải băng chẩn đoán bổ sung để xác nhận chẩn đốn nhiễm ký sinh trùng khác trong đó dải băng 21 kDa mờ nhạt. Nghiên cứu chưa tìm thấy có sự ràng buộc cụ thể của kháng thể IgG 1, IgG 2 hoặc IgG 3 trong các trường hợp mắc bệnh giun đầu gai [41].
+ ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng (mAbs) đã được nghiên cứu sản xuất, tuy nhiên chưa được áp dụng cho việc chẩn đoán bệnh giun đầu gai ở người [105].
Kỹ thuật Western-Blot: Dải băng chẩn đoán cụ thể là thành phần protein có trọng lượng phân tử 21 kDa [40], có độ nhạy 91,7% và độ đặc hiệu 100% so với nhóm chứng người khỏe mạnh [54], kỹ thuật này có độ đặc hiệu cao hơn kỹ thuật ELISA, tuy nhiên giá thành cao, hiện tại ở Việt Nam kỹ thuật này mới đang được nghiên cứu trong phịng thí nghiệm [15].
Xét nghiệm hình thái học
Hình thái học có vai trị để phân loại ký sinh trùng. Hình thái học chủ yếu dựa vào hình thể bên ngoài của ký sinh trùng.
Định lồi bằng hình thái học: định lồi dựa vào đặc điểm kích thước, hình thái, cấu tạo của Gnathostoma. Đặc điểm để phân biệt những ấu trùng giai đoạn 3 của các loài Gnathostoma spp dựa vào số hàng gai trên hành đầu, số gai trên mỗi hàng, cấu tạo gai trên cơ thể và khả năng thích nghi trên từng loại vật chủ [57] [77].
Xét nghiệm Sinh học phân tử:
Sinh học phân tử (molecular biology), hiểu theo nghĩa gốc, là nghiên cứu sinh học ở mức độ phân tử (ADN, RNA, protein). Từ thập kỹ 70 - 80 của thế kỷ 20, hàng loạt kỹ thuật của sinh học phân tử ra đời giúp các nhà khoa học có thể tách, cắt, nối, chép (nhân bản), chuyển và biểu hiện gene theo mong muốn. Có nhiều khái niệm đồng nghĩa được sử dụng để mơ tả các kỹ thuật đó: Cơng nghệ ADN tái tổ hợp (recombinant ADN technology), kỹ thuật gene (gene engineering), kỹ thuật di truyền (genetic engineering, genetic manipulation)... Gần đây các kỹ thuật phân tử rất có ý nghĩa để xác định chính xác đến lồi
Gnathostoma spp [39] [70].
khác nhau trong đó có Ký sinh trùng y học cụ thể kỹ thuật này rất có ý nghĩa để xác định chính xác đến lồi Gnathostoma spp [39] [70].
Trong 10 năm gần đây, phương pháp sinh học phân tử dựa vào kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị di truyền hệ gene ADN và hệ gene ty thể đang được ứng dụng rộng rãi và có độ tin cậy cao, đặc biệt được coi là rất có hiệu quả trong giám định pháp y và phân loại ký sinh trùng.[10]
Nucleic acid [10]:
+ Các nucleic acid (ADN và ARN) đóng vai trị là vật chất di truyền ở các sinh vật. Ở các sinh vật nhân chuẩn (eukaryote) vật chất di truyền là ADN, vật chất di truyền chủ yếu nằm trong hệ gene có trong nhân, ngồi ra cịn được tìm thấy cả trong tế bào chất. Các vật ký sinh trùng y học đều là các eukaryote.
+ Gene là một đoạn trình tự ADN (hoặc ARN) quyết định việc tổng hợp polypeptide. Gene nằm ở một vị trí nhất định trong hệ gene (genome) hoặc hệ ty thể (mitochodrial genome). Nhiều khi chúng ta đồng nhất gene với ADN.
+ Hệ gene (Genome): Genome thường được hiểu là tổng số các đoạn ADN nằm trong nhân của tế bào nhân chuẩn: đó là các nhiễm sắc thể (chromosome) do ADN dạng xoắn kép kết hợp với protein tạo nên.
+ Trình tự ADN trong genome có thể bảo thủ (conserved) hoặc biến đổi (variable). Tùy theo sự bảo thủ mà trình tự bảo thủ có thể đặc trưng cho lồi, chi/giống, họ,... có ý nghĩa trong định lồi ký sinh trùng. Một trong những trình tự ADN hay được sử dụng trong phân loại là gene mã hóa cho RNA của ribosome (rRNA)
5’ NTS ETS ITS-1 ITS-2 3
Hình 1.9: Sơ đồ một nhóm gen mã hóa rRNA ở eukaryote [10]
+ Giữa các đơn vị gene có các đoạn ITS-1 và ITS-2. Ở đầu 5’ của phân tử rRNA được phiên mã có một ETS. Nói chung, các đơn vị gene bảo thủ hơn các đoạn ITS, các ITS lại bảo thủ hơn đoạn ETS
+ Hệ gene ty thể: có số lượng gene ít hơn trong genome, trình tự ADN cũng có đoạn bảo thủ và đoạn biến đổi nên cũng được ứng dụng trong định loại. Do tỷ lệ đột biến của gene ty thể giữa các thế hệ trong cùng loài là khá cao nên gene ty thể thường được dùng để xác định mối quan hệ (tiến hóa) giữa các cá thể hoặc nhóm cá thể trong cùng một lồi hoặc giữa các lồi có quan hệ trương đối gần gũi.
o Với sự tiến bộ của khoa học, hiện ADN của hệ gene ty thể đang được khai thác ngày càng phổ biến trong lĩnh vực chẩn đoán và phân loại, do hệ gene ty thể là dạng đơn bội, di truyền theo dịng mẹ khơng tái tổ hợp và có tỷ lệ biến đổi nucleotit cao hơn hệ gene nhân 10 – 15 lần. Những ưu điểm này làm cho việc phân tích quan hệ họ hàng và tiến hóa sinh vật, trong đó có ký sinh trùng ở mức độ phân tử sử dụng hệ gene ty thể trở nên đơn giản và chính xác. Tuy nhiên, hệ gene ty thể khó sử dụng trong xác định lồi. Hệ gene ty thể đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc di truyền và được xem là chỉ thị phân tử trong xây dựng cây phân loài của Gnathostoma
spp, đóng vai trị quan trọng trong nghiên cứu các loài tuyến trùng phức tạp hoặc chưa rõ ràng, trong tất cả 12 lồi trong giống Gnathostoma, chỉ có ba bộ gen ty thể của 3 loài G. spinigerum, G. doloresi và G. nipponicum đã được giải trình tự hoàn chỉnh [74], [100].
23S 5.8S