Chương 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3. Xác định loài Gnathostoma spp trên người và vật chủ trung gian bằng
3.3.3 Định danh ấu trùng giun Gnathostoma spp bằng sinh học phân tử:
- Khảo sát mức độ biểu hiện vùng gen Cox-1 đặc hiệu Gnathostoma spp
ADN tách chiết được từ mẫu ấu trùng Gnathostoma spp được sử dụng làm khn tổng hợp nhân PCR kích thước 250 bp gen Cox-1 sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%.
M: thang ADN 100 bp
Giếng 1-10: 10 mẫu ấu trùng Giếng 11: chứng H2O
Hình 3.6: Kết quả khảo sát mức độ biểu hiện gen Cox-1 ở mẫu ấu trùng
Gnathostoma spp thu trên lươn bằng điện di agarose 1,5 %
Nhận xét: với cặp mồi gen COX-1, cả 10 mẫu ấu trùng đều xuất hiện dải
băng có kích thước 250 bp, kết quả này cho phép khẳng định 10 ấu trùng này là Gnathostoma spp.
Hình 3.7: Kết quả khảo sát mức độ biểu hiện gen Cox-1 ở mẫu ấu trùng
Gnathostoma spp thu trên lươn bằng điện di agarose 1,5 %
M: thang DNA 100 bp; Giếng 1-10: 10 mẫu ấu trùng thu trên lươn; Giếng 11: chứng H2O
Nhận xét: giếng 1,3,7,8,9,10 có dải băng ở 450 bp kết quả này khẳng định 6
mẫu này là G spinigerum
Hình 3.8: Kết quả khảo sát mức độ biểu diễn gen Cox-1 ở ấu trùng Gnathostoma spp thu trên người bằng điện di agarose 1,5 %
cox-1 (450bp)
M: Thang ADN 100bp; Giếng N1 mẫu ấu trùng thu trên người; Giếng L1 mẫu ấu trùng thu trên lươn; NC: Chứng H2O
Nhận xét: mẫu Gnathostoma spp trên người có dải băng 450 bp, kết quả này
khẳng định mẫu này là G. spinigerum.
3.3.4. Kết quả giải trình tự gen định lồi giun đầu gai Gnathostoma spp bằng gen 5.8S rRNA-ITS2 đặc hiệu
3.3.4.1. Kết quả giải trình tự gen định lồi Gnathostoma thu thập từ lươn
ADN tách chiết được từ mẫu ấu trùng được sử dụng làm khuôn tổng hợp nhân PCR kích thước 600 bp vùng gen 5.8S rRNA-ITS2 đặc hiệu cho
Gnathostoma spp Sản phẩm PCR được điện di trên bản thạch agarose 1,5%.
Hình 3.9: Kết quả khảo sát mức độ biểu hiệnvùng gen 5.8S rRNA-ITS2 ở 10 mẫu ấu trùng Gnathostoma spp bằng điện di agarose 1,5%
M: thang ADN 100 bp, giếng 1-10: 10 mẫu ấu trùng, giếng 11: chứng
Nhận xét: Kết quả giải trình tự gen 5.8S rRNA-ITS2
- Sau khi thực hiện tổng hợp nhân PCR, tiến hành giải trình tự vùng gen 5.8S rRNA-ITS2 của 10 mẫu ấu trùng Gnathostoma spp để xác định loài. Kết quả giải trình tự so sánh bằng phần mềm Bio-edit v.7.2.6 và MEGA6 cho thấy các trình tự nucleotide 5.8S rRNA-ITS2 giống nhau ở cả 6 ấu trùng G. spinigerum đặc hiệu vùng gen Cox-1 ở thí nghiệm
trên.
- Mặt khác dùng chương trình BLAST truy cập ngân hàng gen tìm kiếm những chuỗi tương đồng đã được đăng ký. Kết quả cho thấy đoạn gen 5.8S rRNA-ITS2 của 6 mẫu ấu trùng G. spinigerum hoàn toàn tương
đồng với ITS2 G. spinigerum trên thế giới, 4 mẫu ấu trùng cịn lại có 3 mẫu hồn tồn tương đồng với ITS2 của G. doloresi trên thế giới và 1
mẫu hoàn toàn tương đồng với ITS2 G. hispidum thế giới.
Bảng 3.46: Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa gen 5.8S rRNA- ITS2 của 6 mẫu ấu trùng G. spinigerum và thế giới
Hệ số tương đồng (%) H ệ số s a i kh á c (% ) Mẫu ấu trùng 2 3 7 8 9 10
Mã số gen của Ngân hàng gen thế giới 2 100 99,4 99,7 99,5 98,5 98,2 JN408316 G. spinigerum 3 0,6 100 98,4 98,5 99,0 98,1 JN408316 G. spinigerum 7 0,3 1,6 100 98,9 99,8 98,3 JN408318 G. spinigerum 8 0,5 1,5 1,1 100 98,3 99,7 JN408318 G. spinigerum 9 1,5 1,0 0,2 1.7 100 99,5 AB181155 G.spinigerum 10 1,8 1,9 1,7 0,3 0,5 100 AB181155 G.spinigerum Mẫu ấu trùng 2 3 7 8 9 10
Bảng 3.46: Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa gen 5.8S rRNA- ITS2 của 3 mẫu ấu trùng G. doloresi, 1 mẫu ấu trùng G. hispidum và trên
thế giới Hệ số tương đồng (%) H ệ số s a i kh á c (%
) Mẫu ấu trùng 1 5 6 4 Mã số gen của Ngân hàng gen thế giới
1 100 99,4 99,1 31,7 AB181156 G.doloresi
5 0,6 100 99,6 36,2 AB180100 G.doloresi
6 0,9 0,4 100 33,1 JN408299 G.doloresi
4 68,3 63,8 66,9 100 AB181158 G. hispidum
Hình 3.10: Cây phát sinh lồi xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự vùng gen 5.8S rRNA-ITS2 của 6 mẫu G. spinigerum, 3 mẫu G. doloresi và 1
mẫu G. hispidum
3.3.4.2. Kết quả giải trình tự gen định lồi Gnathostoma thu thập từ bệnh nhân
Sau khi thực hiện tổng hợp nhân lượng PCR, tiến hành giải trình tự vùng gen 5.8S rRNA-ITS2 của mẫu ấu trùng Gnathostoma spp ở người để xác định lồi. Kết quả giải trình tự so sánh bằng phần mềm Bio-edit v.7.2.6 và MEGA6 cho thấy các trình tự nucleotide 5.8S rRNA-ITS2 giống nhau ở trình tự của ấu trùng giun Gnathostoma spp trên người phù hợp, xác định cùng loài G. spinigerum.
Chương 4 BÀN LUẬN BÀN LUẬN
4.1. Mô tả đặc điểm lâm sàng & cận lâm sàng bệnh do Gnathostoma spp
trên người tại phía Nam Việt Nam (2016-2017)
4.1.1. Đặc điểm hành chính
+ Tỷ lệ ca bệnh được phát hiện theo các tỉnh trong nghiên cứu
Trong thời gian gần 2 năm (2016-2017), chúng tôi đã chọn được 112 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu có kết quả xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme (ELISA) dương tính chỉ một lồi G. Spinigerum, tại Phòng khám chuyên khoa ký sinh trùng của Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Cơn trùng Quy Nhơn và phịng khám Đa khoa Trọng Nghĩa thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu nghiên cứu của chúng tơi có các đặc điểm sau:
Nơi cư ngụ:
Kết quả nghiên cứu cho thấy bệnh giun đầu gai được phát hiện ở 28 tỉnh thành (bảng 3.1), từ các tỉnh miền núi cho đến các tỉnh đồng bằng, vùng ven biển trên cả nước. Tỷ lệ số ca nhiễm ở các nơi có sự khác nhau, trong đó bệnh nhân đến từ tỉnh Bình Định chiếm tỷ lệ cao nhất 16,96%, kế đến là 2 tỉnh Đắk Lắk và Gia Lai đều chiếm 10,71%, số bệnh nhân đến từ Quảng Ngãi và thành phố Hồ Chí Minh 6,25%.
Các tỉnh cịn lại có số bệnh nhân thấp hơn (Lâm Đồng, Ninh Thuận, Kiên Giang, Đồng Tháp, Tây Ninh đều 0,89%, các tỉnh Bạc Liêu, Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Hậu Giang, Kon Tum, Sóc Trăng đều 1,79%, các tỉnh Cà Mau, Đăk Nơng, Khánh Hịa, Quảng Nam, Phú Yên, Trà Vinh, Vĩnh Long đều 2,68%, các tỉnh An Giang, Long an, Tiền Giang đều 3,57%.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy bệnh giun đầu gai không phải là bệnh hiếm gặp mà là bệnh có mặt ở khắp các tỉnh thành ở Việt Nam. Ca đầu tiên được phát hiện năm 1965, bệnh nhân sinh sống ở tây ninh. Từ đó đến nay, các
trường hợp nhiễm Gnathostoma được phát hiện rãi rác tại các phòng khám bệnh của các bệnh viện và trung tâm chẩn đoán y khoa tại thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Cơn trùng Quy Nhơn [8] [18] [23]. Năm 1999 Lê Thị Xuân cùng Nguyễn Quang Vinh và cs đã ghi nhận 15 trường hợp nhiễm
Gnathostoma tại Trung tâm chẩn đoán y khoa MEDIC thành phố Hồ Chí Minh.
Trần Thị Hồng và cs 2004 đã báo cáo 30 trường hợp nhiễm Gnathostoma spp. được chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA từ năm 2002 đến 2003
Những nghiên cứu của một số chuyên gia ghi nhận bệnh có ở nhiều nước trên thế giới như Malaysia, Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Nhật Bản, Philippine, Lào, Đài Loan, Bangladesh, Pakistan và Israel, song cũng chỉ dưới dạng báo cáo ca bệnh hoặc loạt ca bệnh chứ không phổ biến và nhiều như ghi nhận trên y văn ở Thái Lan và Nhật Bản [99], [80]. Các nghiên cứu về dịch tễ học cũng đã chỉ ra nguy cơ lớn nhất tại hai quốc gia này là nhiễm ấu trùng giun đầu gai là do cách chế biến thức ăn và hành vi ăn uống [47], [66]. Một vài nghiên cứu ghi nhận là G. spinigerum được xem như loài chủ yếu gây bệnh
cho người ở các quốc gia khu vực Đông Nam châu Á [27], [36]. Phần lớn bệnh lưu hành ở châu Á và Nam Mỹ, song gần đây hàng năm có nhiều ca bệnh được phát hiện ở châu Âu, Nam Mỹ, châu Phi do q trình du lịch tồn cầu giữa các quốc gia có bệnh lưu hành và khơng lưu hành [64], [69].
Tuổi:
- Bệnh giun đầu gai xảy ra ở mọi lứa tuổi. Trong đó, nhóm tuổi trên 45 chiếm tỷ lệ cao nhất 41,07%, và nhóm tuổi 15 - < 30 chiếm tỷ lệ thấp nhất 5,18% tiếp đến là nhóm tuổi từ 30 - < 45 tuổi 5,89%, nhóm tuổi chưa trưởng thành < 15 chiếm 7,86% sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
- Nếu chỉ chia làm hai nhóm tuổi < 15 và ≥ 15 thì nhóm tuổi ≥ 15 chiếm tỷ lệ cao 82,14% phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Xuân (2005) đa số ở nhóm
- Ở nước ngồi, các nghiên cứu khác như nhóm tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất là trong độ tuổi từ 30 - <45 như: Ando (2005) tuổi thường gặp nhất là 30 – 40, Strady (2009) tuổi trung bình là 38 (27-60 tuổi) [99]; Valai – B (2010) tuổi trung bình là 37 (5 – 79 tuổi) [47]. Nhìn chung bệnh xuất hiện phần lớn ở người lớn tuổi (từ 30 đến 50 tuổi) ở nghiên cứu chúng tôi cũng như ở các nước trên thế giới. Điều này có thể giải thích là người lớn ăn nhiều món đặc biệt như là sushi ở Nhật, Sashimi ở Hàn Quốc, gỏi cá ở Việt Nam.
Giới tính:
- Trong số 112 ca xác định bệnh giun đầu gai, số bệnh nhân nữ 62,5% cao hơn so với nam giới 37,5%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với (p<0,05). Tỷ lệ này phù hợp của Strady (2009) nữ cao hơn nam 1,6 lần [99], nhưng có sự khác biệt so với nghiên cứu của Lê Thị Xuân (2005) [19] và Ando (2005) là nam cao hơn nữ. Sự khác biệt với các tác giả này có thể do cách ăn uống của mỗi dân tộc hay nghề nghiệp.
Phân bố theo nghề nghiệp
- Phân bố bệnh nhân bệnh giun đầu gai theo nghề nghiệp cho thấy công nhân viên chức chiếm tỷ lệ cao nhất 25%, thấp nhất là ngư dân 4,46% sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p >0,05). Kết quả này phù hợp với tác giả Nguyễn Văn Chương và cs. (2013) công nhân viên chức chiếm tỷ lệ cao nhất 37,21% nhóm học sinh chiếm tỷ lệ thấp nhất 16,28% [28]. Bệnh giun đầu gai lây nhiễm vào người qua đường tiêu hóa, nhóm cơng nhân viên chức thường ăn uống hàng quán nhiều hơn nhóm học sinh, thường chỉ ăn cơm nhà, nên sự khác biệt này là phù hợp.
Phân bố theo trình độ học vấn
Bệnh nhân bệnh giun đầu gai có trình độ học vấn khác nhau, trong đó nhóm bệnh nhân có trình độ học vấn trên phổ thơng trung học 25,89%, nhóm bệnh nhân có trình độ học vấn phổ thơng trung học 22,32%, nhóm có trình độ
học vấn phổ thơng cơ sở 28,57% chiếm cao nhất, nhóm bệnh nhân có trình độ học vấn tiểu học 20,54% và chỉ 2,68% mù chữ, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p <0,05). Bệnh giun đầu gai là lây qua đường tiêu hóa bệnh xảy ra ở mọi tầng lớp tuy nhiên yếu tố nguy cơ của bệnh này là ăn thủy sản sống hoặc tái, như các món sushi ở Nhật, Sashimi ở Hàn Quốc, gỏi cá ở Việt Nam. Những đối tượng thường xuyên ăn ngoài sẽ có nguy cơ nhiều nhiễm bệnh này, nên đối tượng mù chữ ít nhiều cũng ảnh hưởng bởi điều kiện sống, nên tỷ lệ nhiễm thấp ở đối tượng này là phù hợp.
Phân bố theo dân tộc
Trong số các bệnh nhân tham gia nghiên cứu, phân tích theo các nhóm dân tộc có mặt tại Việt Nam cho thấy dân tộc Kinh chiếm tỷ lệ 95,54%, nhóm các dân tộc khác chiếm tỷ lệ 4,46%. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Sự khác biệt về tỷ lệ trên các bệnh nhân đến khám thuộc các nhóm dân tộc khác nhau có thể liên quan đến thói quen ăn uống, vấn đề này cần nghiên cứu thêm có thể do thói quen ăn uống hay do điều kiện kinh tế mà tỷ lệ bệnh giun đầu gai ở nhóm Dân tộc Kinh 95,54% cao hơn rất nhiều so với nhóm dân tộc khác, nghiên cuus này phù hợp với tác giả Nguyễn Văn Chương, bệnh nhân đa số là dân tộc Kinh 94,19% [28].
4.1.2. Đặc điểm lâm sàng và các yếu tố nguy cơ
- Phân bố theo yếu tố nguy cơ
Các yếu tố nguy cơ bệnh giun đầu gai trên các bệnh nhân là đều có tiếp xúc với ít nhất 1 trong 10 nhóm thức ăn, trong đó, các nhóm bệnh nhân đã từng ăn: cá nước ngọt dạng gỏi, tái, sống 71,43%, thịt ếch um, xào chưa chín hoặc gỏi 65,18%, ăn rau sống đơn thuần hoặc salad trộn 64,29%, ăn ốc dạng hấp hoặc thái lát mỏng trộn rau 61,61%, ăn lươn đồng hoặc lươn nuôi dạng gỏi sống hoặc tái 43,75%, ăn các loại hải sản khác nhau dạng xà lách trộn còn sống
rau cải, mù tạt 27,68%, ăn các loại vẹm xanh, sò huyết ăn với mù tạt 20,54%, đặc biệt có thói quen uống nước sơng, nước giếng chưa đun sơi có tỷ lệ thấp nhất 13,39%.
Dựa vào số liệu thống kê ta thấy tỷ lệ bệnh giun đầu gai ở nhóm người ăn cá sống hay tái (thủy sản và nước ngọt) chiếm tỷ lệ cao nhất. Kết quả này cũng phù hợp với nguyên nhân bệnh giun đầu gai là sau khi ăn phải thủy sản sống có chứa nang ấu trùng của chủng giun tròn G. spinigerum.
Nghiên cứu của Nguyễn Văn Chương (2013) cho thấy có mối liên quan giữa ăn thịt thủy sản nấu khơng chín có chứa ấu trùng Gnathostoma spp với bệnh giun đầu gai [29]. Theo nghiên cứu của Vailai -B có đến 90% bệnh giun đầu gai có tiền sử ăn thịt nấu chưa chín [47].
So sánh với các nghiên cứu của Huỳnh Hồng Quang và cs (2012) [9] có khảo sát một số yếu tố nguy cơ giống trong nghiên cứu này như: Thịt rắn làm gỏi, uống huyết rắn tươi pha ít rượu 2,59% thấp hơn so với nghiên cứu này 32,14%, làm thịt ếch um, xào chua ngọt, chưa đủ chín hoặc gỏi thịt ếch 27,27% thấp hơn nghiên cứu này 65,18%, ăn các động vật có vỏ như vẹm, sị huyết chấm mù tạt với tái chanh, xì dầu 6,49% thấp hơn nghiên cứu này 20,54%, hoặc ăn tôm, cá thái lát mỏng chấm mù tạt 41,56% cao hơn nghiên cứu này 27,68%, uống nước chưa đun sôi từ các sông, giếng chưa nấu sôi với tỷ lệ đáng kể 10,39% thấp hơn nghiên cứu này 13,39%.
Lý giải sự khác nhau này có thể do từng thời điểm bệnh nhân đến khám bệnh và ăn thức ăn theo mùa và sở thích của từng cá nhân và từng vùng miền khác nhau và trong nghiên cứu này chúng tôi chưa nghiên cứu sâu về sự tương quan giữa các yếu tố nguy cơ nhiễm bệnh và thời gian từ lúc ăn đến lúc khởi phát bệnh. Nên chúng tôi chỉ ghi nhận đây là các vật chủ trung gian thứ 2 của ấu trùng G. spinigerum. Điều này cho thấy ít nhiều họ đã có tiền sử phơi nhiễm với các mầm bệnh, nhất là ấu trùng giai đoạn 3 của G. spinigerum có mặt trong các
phần thớ thịt (filet) cịn sống hoặc xử lý chưa chín (dạng xào qua loa, bóp tái chanh hoặc ăn sống với xì dầu mù tạt). Khả năng ấu trùng giai đoạn 3 của
G.spinigerum có thể vào cơ thể người qua đường tiêu hóa và gây bệnh.
Về số ngày biểu hiện bệnh trước khi nhập viện
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ bệnh nhân từ khi có triệu chứng đến khi đi khám bệnh, chiếm tỷ lệ cao nhất là nhóm từ 15 – 30 ngày và nhóm 30 – 45 ngày 31,25%, tỷ lệ thấp nhất làm nhóm đến khám sớm trước 7 ngày, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Khoảng cách thời gian kể từ khi biểu hiện triệu chứng đến khi được chẩn đoán xác định bệnh giun đầu gai dao động khác nhau từ dưới một tuần đến trên sáu tuần có thể do nhiều bệnh nhân khi có các triệu chứng của giun đầu gai khơng điển hình vì các triệu chứng trên các cơ quan do loài ký sinh trùng này thường tương tự hoặc giống như các bệnh lý da liễu, hoặc nội khoa tổng quát và hoặc chuyên khoa mắt, nên họ đã đi khám và điều trị nhiều cơ sở y tế cơng và y tế tư nhân trước đó có thể chưa được nghĩ đến, nhận ra và điều trị bằng các phác đồ thuốc khác nhau. Hơn nữa diễn tiến