Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Mục tiêu 3: Xác định loài Gnathostoma spp gây bệnh cho người và vật chủ
2.2.5. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.2.5.1. Kỹ thuật ép mô: Dùng để phát hiện ấu trùng Gnathostoma spp trong nội tạng của cá, lươn.
- Nội tạng cá, lươn được rửa sạch, cắt thành mảnh nhỏ, sau đó đặt mảnh mơ giữa 2 miếng kính trong có kích thước 20 x 20 cm, dùng tay ép nhẹ 2 mặt kính lại với nhau, và quan sát mảnh mô được ép mỏng dưới ánh sáng đèn, nếu thấy nang ấu trùng nằm trong miếng mơ, tiến hành phẫu tích dưới hính hiển vi soi nổi Olympus với độ phóng đại 4x, để bóc tách ấu trùng ra.
2.2.5.2. Kỹ thuật tiêu cơ: Dùng để phát hiện ấu trùng Gnathostoma spp trong
cơ của cá và lươn.
- Thịt của cá và lươn đã được cắt nhỏ và ngâm trong dung dịch pepsin - HCl 1% trong 24 giờ để mô bị tiêu hóa và tan rã thành mảnh vụn. Sau đó, chúng tơi ly tâm, thu cặn, quan sát cặn tìm và thu hồi ấu trùng giun dưới kính hiển vi soi nổi Olympus với độ phóng đại 4x [11].
+ Các ấu trùng Gnathostoma spp được thu thập lại, đặt vào trong đĩa petri và dùng kính hiển vi soi nổi loại Olympus để đánh giá kết quả.
+ Mỗi ấu trùng sau khi đo các kích thước để xác định phân loại theo hình thái học được thu vào tuýp riêng, giữ cố định trong cồn ethanol 70%.
2.2.5.3. Xác định lồi bằng hình thái học
Dựa trên các đặc điểm: Kích thước, hình thể, cấu tạo đầu giun [52] [77] [90]
Hình thể và cấu tạo đầu:
- Là giun trịn có rảnh cổ giữa thân và đầu. - Đầu có 4 hàng gai.
Kích thước:
Bảng 2.5: Kích thước ấu trùng Gnathostoma spp [24][77] Kích thước (mm) Kích thước (mm)
Min- Max trung bình
Ấu trùng thu được ở lươn Chiều dài 0,5 - 4 2,25 Chiều rộng 0,16 – 0,23 0,19 Ấu trùng thu được ở người Chiều dài 0,5 - 4 2,25 Chiều rộng 0,16 – 0,23 0,19
Bảng 2.6: Số lượng và hình dạng của gai trên đầu ấu trùng [77] Đặc điểm G. spinigerum G. hispidum G. doloresi Đặc điểm G. spinigerum G. hispidum G. doloresi
Số hàng gai trên đầu 4 4 4
Số gai trên mỗi hàng > 40 <40 <40
2.2.5.4. Kỹ thuật sinh học phân tử
- Phương pháp tách chiết ADN bằng màng lọc silica (High Pure PCR Template Preparation Kit-Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Đức).
- Dung dịch muối đệm và pH acid, phá vỡ liên kết và bảo vệ đặc tính của Guanidine thiocyanate (GTC) và -mercaptoethanol làm các nuclease,
ribonuclease hiện diện trong tế bào bất hoạt. GTC liên kết với SDS phá vỡ phức hợp nucleoprotein, cho phép ADN được giải phóng vào dung dịch và tách rời protein. Sau khi ly tâm làm sạch các kết tủa protein và các mảnh vụn tế bào, ADN sẽ được kết tủa với ethanol và gắn trên bề mặt các sợi silica của màng lọc.
- Mỗi bộ cột ly trích (Spin Columm Assembly) gồm: màng lọc (Spin Basket), tube thu thập (Colection tube)
- Kết quả tinh sạch kết tủa protein và các mảnh vụn tế bào nhờ màng lọc với lực ly tâm. Phản ứng xảy ra nhanh do sự phá vỡ phân tử nước bởi Chaotropic salt. Vì vậy các nucleic acid hấp thụ vào các silica.
- Các phân tử ADN gắn kết sẽ được làm sạch bằng dung dịch muối đệm. Loại bỏ protein và những phần tế bào cịn sót lại bằng giai đoạn rửa. Cuối cùng ADN được hồ tan bởi nước cất khơng có Nuclease [89].
- Xác định giống Gnathostoma spp vùng gen cox-1 theo Jurairat và cs., 2015 - Đoạn ADN đặc hiệu cho giống Gnathostoma gen đích có kích thước tương ứng 250 bp sử dụng cặp: Mồi xuôi Gn_COI F: 5'-GCC TGC TTT TCG AAT TTT TAG-3' và mồi ngược Gn_COI R: 5'-ACG AAA ATC ATA CTA AGT AGC CAA-3' đặc hiệu Gnathostoma spp của vùng trình tự gen cox1 [70].
- Thành phần phản ứng PCR trong thể tích 50 µl, trong đó có chứa: 5 µl đệm Taq (10X); 9 µl MgCl2 (25 mM); 1 µl mỗi loại dNTP’s (10 mM); 5 µl mỗi loại mồi đặc hiệu; 0,2 µl enzyme Taq polymerase (5 U/µl); 5 µl ADN mẫu pha loãng (20 ng); bổ sung nước khử ion tới thể tích 50 µl theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Promega, Hoa Kỳ).
- Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt: bước 1: 95oC, 3 phút; bước 2: 94oC, 1 phút; bước 3: 55oC, 1 phút; bước 4: 72oC, 1 phút; bước 5: 72oC, 5 phút; từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 39 chu kỳ; bước 6: 4oC, bảo quản mẫu.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide và tinh sạch theo bộ kít của hãng Promega, Mỹ. - Chụp ảnh bằng thiết bị iBrightTM Imaging System FL 1000 (ThermoFisher Scientific, Mỹ) với phần mềm phân tích iBright Analysis Software trên máy.
Định loài G. spinigerum bằng gen cox-1:
- Nhân đoạn ADN đích có kích thước 450 bp bằng mồi xi JB3 F: 5'-TTT TTT GAG CAT CCT GAG GTT TAT-3’ và mồi ngược JB4.5 R: 5'-TAA AGT
AAG AAC ATA CTG AAA ATG-3' đặc hiệu G. spinigerum của vùng trình tự gen cox1 (Charinthon và cs., 2005) [81].
- Thành phần phản ứng nhân lượng PCR trong thể tích 50 µl chứa 5 µl đệm Taq (10X); 9 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl mỗi loại dNTP’s (10 mM), 5 µl mỗi loại mồi đặc hiệu, 0,2 µl enzyme Taq polymerase (5 U/µl), 5µl ADN mẫu pha lỗng (20 ng). Bổ sung nước khử ion tới thể tích 50 µl theo hướng dẫn của nhà sản xuất Promega, Mỹ.
- Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau: Bước 1 (95oC, 3 phút), bước 2 (94oC, 1 phút), bước 3 (55oC, 1 phút), bước 4 (72oC, 1 phút), bước 5 (72oC, 5 phút). Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 39 chu kỳ và bước 6 ở điều kiện 4oC, bảo quản mẫu. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,5%, nhuộm bản thạch trong dung dịch Ethidium bromide và tinh sạch theo kít của hãng Promega, Mỹ.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide và tinh sạch theo bộ kít của hãng Promega, Mỹ.
- Chụp ảnh bằng thiết bị iBrightTM Imaging System FL 1000 (ThermoFisher Scientific, Mỹ) với phần mềm phân tích iBright Analysis Software trên máy.
2.2.5.5. Giải trình tự gen
- Khuếch đại gen ADN đích có kích thước 600 bp bằng mồi xuôi NEWS2 F:5'- TGTGTAGATGAAGTACGCAG-3' và mồi ngược ITS2-RIXO R:5'- TTCTATGATTAAATT CCG GGG-3' đặc hiệu cho Gnathostoma spp theo Almeyda-Artigas (2000) [39].
- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit Wizard SV Gel and PCR Clean – Up System
(Promega – Mỹ). Đo nồng độ sản phẩm PCR được tinh sạch bằng máy Genova
Nano Spectrophotometer Micro Volume Accessory (Bibby Scientific – Anh). Tính tốn và pha lỗng nồng độ AND phù hợp để giải trình tự. Thực hiện PCR
nhân đoạn AND cần giải trình với bộ sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Hãng ABI – Mỹ).
- Giải trình tự được gửi qua First BASE Laboratories – Axil Scientific, Malaysia tiến hành trên máy ABI 3730 Series Genetic Analyzer. Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit v.2.6 (Tom Hall, 2017) phân tích so sánh trình tự gen mẫu Gnathostoma spp trong ngân hàng GENBANK. Sau khi đã tổng hợp các số liệu, đưa vào phần mềm MEGA 6 (Temura, 2013). So sánh trình tự các mẫu trong nghiên cứu với trình tự Gnathostoma spp đã được cơng bố trên ngân hàng gen trên BLAST [44] và dựng cây phân loài mối quan hệ di truyền.