Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Mục tiêu 3: Xác định loài Gnathostoma spp gây bệnh cho người và vật chủ
2.2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: tháng 6/2016 – 5/2017. - Địa điểm nghiên cứu:
+ Thu mẫu ấu trùng Gnathostoma spp trên người: tại 2 phòng khám của mục tiêu 1.
+ Thu mẫu giun/ấu trùng Gnathostoma spp ở cá, lươn: tại Bộ môn Ký sinh trùng ĐHYD TPHCM.
+ Xét nghiệm định loài ấu trùng Gnathostoma spp trên vật chủ trung gian (lươn và cá) bằng hình thái học và sinh học phân tử tại Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh và trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch thành phố Hồ Chí Minh.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả: Mô tả cắt ngang tỷ lệ cá, lươn nhiễm Gnathostoma spp và hình thái học ấu trùng Gnathostoma.
- Nghiên cứu tại phịng xét nghiệm: Mơ tả hình thái và định danh ấu trùng
Gnathostoma bằng hình thái học và sinh học phân tử. 2.2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
n=Z21/2 (1 2) p p Trong đó:
n: Cỡ mẫu tối thiểu;
p: Tỷ lệ nhiễm G. spinigerum trong điều tra trên số lươn của Lê Thị Xuân cùng cộng sự năm 2000 là 11% [20], lấy p = 0,11.
Z1-/2: Hệ số tin cậy, ứng với độ tin cậy 95% thì Z1-/2 = 1,96; ε: Sai số tương đối mong muốn chọn ε = 10,0% tức là ε = 0,1 Với công thức này, cỡ mẫu được tính tốn là 3105 con.
- Trên người: toàn bộ ấu trùng thu được.
2.2.3.3. Phương pháp chọn mẫu
- Cá lóc và lươn đồng được thu mua tại chợ N, thành phố Hồ Chí Minh, được chuyển về phịng thí nghiệm để tìm ấu trùng Gnathostoma spp, tất cả ấu trùng được thu sẽ được bảo quản trong cồn 70 để định danh.
2.2.3.4. Phương pháp định danh
- Phương pháp hình thái: Tất cả ấu trùng thu được trên lươn, cá và người. - phương pháp sinh học phân tử: 10 ấu trùng được chọn ngẫu nhiên trong số những ấu trùng thu được ở lươn và cá, tất cả ấu trùng thu được ở người.
2.2.4. Nội dung nghiên cứu
- Mơ tả các đặc điểm hình thái học: kích thước, hình thể và cấu tạo. - Xác định loài Gnathostoma spp bằng phương pháp sinh học phân tử trên cơ sở gen đích Cox-1 và xác định lồi bằng giải trình tự gen 5.8S rRNA-ITS2 . - So sánh sự tương đồng phân tử với đoạn gen chuẩn trên Genbank và lập cây phả hệ.