1.2.1 Quá trình tiền xử lý bã đậu
Bã đậu nành thu nhận từ nhà máy sữa đậu nành Vinasoy Bắc Ninh có độ ẩm 85,32 ± 0,02%, hàm lượng protein 3,05 ± 0,02% được bảo quản trong điều kiện lạnh đông. Bã đậu này đã được tiến hành nghiên cứu tiền xử lý trước khi thủy phân được thể hiện ở bảng 1.4 [26].
17 Bảng 1.4 Ảnh hưởng của các chế độ hấp tới lượng vi sinh vật tổng số
của bã đậu nành
Kết quả phân tích ở bảng 1.4 cho thấy bã đậu nguyên liệu (mẫu không hấp) có sẵn một lượng vi sinh vật đáng kể. Khi xử lý bã bằng cách hấp ở 100oC trong 30 phút đã loại được một lượng lớn vi sinh vật tuy nhiên vẫn còn một lượng nhất định trong nguyên liệu. Hấp bã ở 121oC trong 15 phút đã loại được hoàn toàn vi sinh vật [26].
Mặt khác, mẫu bã có xử lý hấp, sau khi thủy phân bằng enzym giải phóng vào dịch lượng protein, peptit mạch ngắn và axit amin, polyphenol tổng số cao hơn so với mẫu thủy phân từ nguyên liệu ban đầu không hấp. Theo đó, mẫu bã đậu hấp ở 121oC trong 15 phút cho hàm lượng protein, peptit và axit amin, polyphenol trong dịch thủy phân cao nhất [26].
Theo trong bài báo của Queiroz Santos và cộng sự (2018), so sánh thành phần giữa đậu nành, bã đậu nành tươi, bã đậu nành được xử lý nhiệt, bã đậu nành tươi và bã đậu nành được xử lý nhiệt được lên men rắn. Kết quả cho thấy, mẫu đã qua xử lý nhiệt sau quá trình lên men bã đậu nành đã góp phần làm tăng tổng hàm lượng phenolic và tăng cao hơn so với mẫu lên men bã tươi. Các hợp chất phenolic ở dạng tự nhiên của chúng được kết hợp hoặc liên kết với đường, và trong quá trình lên men, các enzym từ nấm men sẽ thủy phân phức hợp phenolic thành các phenol hòa tan tự do. Một lời giải thích khả dĩ cho kết quả trên có thể là do quy trình xử lý nhiệt đã thúc đẩy những thay đổi trong cấu trúc của bã đậu nành, và những thay đổi như vậy có thể tạo thuận lợi cho hoạt động của nấm men trên cơ chất polyphenol và dẫn đến sự giải phóng phenolic cao hơn [27].
Do đó nghiên cứu đã chọn tiền xử lý hấp bã đậu bằng hơi bão hòa ở 121oC trong 15 phút giúp diệt vi sinh vật giúp kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu bã đậu; giảm lượng antitrypsin trong bã nguyên liệu; gây trương nở, biến đổi cấu
Mẫu Hàm lượng VSV tổng số (CFU/g bã ướt) Không hấp (2,6 - 2,9) x 105
Hấp 100oC/30’ (0,4 - 1,8) x 102 Hấp 121oC/15’ 0
18 trúc của bã, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân bã đậu bằng enzym và hỗ trợ cho các quá trình chế biến tiếp theo.
1.2.2 Quá trình thủy phân bã đậu nành a. Hệ enzym protease a. Hệ enzym protease
Protease là nhóm enzym xúc tác thủy phân liên kết peptit, là loại liên kết chủ yếu trong phân tử protein và polypeptit. Nhóm enzym protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.
Thủy phân protein trong bã đậu bằng protease là một phương pháp tiềm năng để tái sử dụng bã đậu, tận dụng các chất dinh dưỡng còn giá trị trong phụ phẩm [26]. Theo nhóm tác giả Ngô Minh Ngọc, Quản Lê Hà (2017), sản phẩm thủy phân bã đậu nành bằng endoprotease có hàm lượng chất chống oxy hóa cao hơn thủy phân bằng exoprotease [28]. Với mục đích chuyển hóa nguồn protein bã đậu nành thành các peptit mạch ngắn và các axit amin làm nguồn dinh dưỡng và tăng hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân sử dụng cho quá trình lên men của các nghiên cứu sau, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn chế phẩm Endopeptidase: Alcalase® 2.4L (Novozymes) [26]. Là chế phẩm enzym được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis. Chúng có khả năng phân cắt các liên kết peptit nội phân tử để chuyển protein thành các đoạn peptit. Nhiệt độ tối ưu 30 – 65oC, dải pH hoạt động 7,0 – 9,0 và được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.
b.Hệ enzym thủy phân chất xơ
Cellulase là các enzym thủy phân liên kết β-1,4 trong chuỗi cellulose, giải phóng oligosacarit, cellobiose, và glucose. Chúng được sản xuất bởi nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh, thực vật và động vật. Cellulase là enzym cảm ứng được tổng hợp bởi sự đa dạng lớn của các vi sinh vật bao gồm cả nấm và vi khuẩn trong quá trình phát triển của chúng trên các vật liệu cellulose. Trong số đó, nấm A. niger, A. nidulans, A. oryzae, và A. terreus, đặc biệt là A. niger, được dùng để sản xuất số lượng lớn cellulase được sử dụng thương mại [29].
Nhóm nghiên cứu đã lựa chọn các chế phẩm enzym thương mại:
Viscozyme L là một hỗn hợp đa enzym. Nó chứa một loạt các enzym: cellulase, hemicellulase, arabinase, -glucanase và xylanase (Novozymes 2002).
19 Viscozyme có thể chuyển chất xơ không hòa tan thành dạng oligosaccharit. Khi được sử dụng cho cơ chất được xử lý ở áp suất thủy tĩnh cao (áp suất hơi cao) cũng làm tăng lượng carbohydrate phân tử lượng thấp [30]. Viscozyme L được sản xuất từ Aspergillus aculeatus là một chất lỏng màu nâu sáng với tỉ trọng xấp xỉ 1,21g/ml. Điều kiện hoạt động tối ưu cho Viscozyme L là pH khoảng 3,3-5,5 và nhiệt độ 25-55°C [31].
Pectinex® Ultra SP-L: là chế phẩm enzym thương mại, dạng lỏng màu thẫm được sản xuất từ Aspergillus niger, có nhiều thành phần, có mùi thơm đặc trưng của sản phẩm lên men. Bao gồm hỗn hợp pectinase, hemicellulase và β- glucanase. Pectinase có thể phá vỡ thành tế bào quả và làm giảm độ nhớt của nước ép, giảm thời gian lọc dịch quả. Chế phẩm hoạt động ở nhiệt độ 25-65⁰C, nhiệt độ tối ưu 40-55⁰C, pH hoạt động 3-5.
1.3 Quá trình lên men dịch thủy phân bã đậu nành
1.3.1 Vai trò của nấm men trong quá trình lên men
Trong các loài nấm men thì Saccharomyces cerevisiae có thể được xem là loài nấm men hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm nay và cũng là một trong những loài vi sinh vật nhân thực được sử dụng nhiều nhất. Trong quá trình lên men nấm men Saccharomyces cerevisiae cung cấp một loạt các hoạt chất tạo mùi thơm, rất quan trọng cho hương vị phức tạp của đồ uống lên men, chẳng hạn như bia, rượu vang. Có hai nhóm chính các este hoạt động tạo hương trong đồ uống lên men:
- Nhóm 1 chứa các este axetat (trong đó nhóm axit là axetat và nhóm rượu là etanol hoặc rượu phức có nguồn gốc từ chuyển hóa axit amin), ví dụ như: isoamyl axetat (mùi thơm chuối) và phenyl etyl axetat (mùi hoa hồng, mật ong),...
- Nhóm 2 là các este etylic (trong đó nhóm rượu là etanol và nhóm axit là axit béo chuỗi trung bình [MCFA]), ví dụ như: ethyl hexanoate (mùi hạt hồi), ethyl octanoate (mùi táo chua), và etyl decanoat (mùi hoa hắc),... [32].
Nấm men cung cấp tiềm năng lớn để biến đổi bã đậu nành do hoạt động trao đổi chất mạnh mẽ và sự đa dạng của chúng. Theo nghiên cứu của Queiroz Santos và cộng sự năm 2018, quá trình lên men rắn bã đậu nành bằng nấm men
20
Saccharomyces cerevisiae làm tăng hàm lượng protein trong khi cũng thúc đẩy giảm lượng chất xơ thô do đó tăng khả năng hấp thụ. Các thông số như tổng hàm lượng phenolic và tiềm năng chống oxy hóa cũng được cải thiện, cũng như sự chuyển đổi sinh học của isoflavone β-glucoside thành aglycone thông qua hoạt động của β-glucosidase [27].
Đối với bã đậu nành, nấm men có vai trò rất lớn khi lên men bã đậu vì nó giúp khắc phục các khuyết điểm về mùi của bã đậu, đồng thời tạo ra mùi thơm đặc biệt hơn cho sản phẩm. Không những thế, nấm men còn giúp chuyển hóa tạo ra các chất có lợi từ các tiền chất trong bã đậu.
AAT=alcohol acyltransferase; ADH=alcohol dehydrogenase; ALDH=aldehyde dehydrogenase; LOX=lipoxygenase; HPOD=hydroperoxyoctadecadienoic acid;
HPOT=hydroperoxyoctadecatrienoicacid [33].
Mùi không mong muốn của bã đậu là do một lượng lớn chất “green leaf volatiles” (GLV), điển hình là aldehyd C6. Khi đậu nành được nghiền, các axit béo không bão hòa tự do bị phân hủy enzym trong một loạt các phản ứng. Đầu tiên, lipoxygenase đậu nành (LOX) xúc tác quá trình lipox hóa của axit béo C18:
Hình 1.3 Các phản ứng của enzym trong nấm men dẫn đến sự tạo thành các este trong bã đậu
21 2 và C18:3 thành axit hydroperoxyoctadecadienoic (HPOD) hoặc axit hydroperoxyoctatrienoic (HPOT), theo thứ tự, tùy thuộc LOX 1,2 hoặc 3. Biến đổi sinh học của bã đậu bằng nấm men là một trong những phương pháp hữu ích để thay đổi mùi của nó. Các enzym trong nấm men và các chất trung gian trao đổi chất có thể phản ứng với các tiền chất hương thơm trong bã đậu để tạo ra nhiều loại chất bay hơi mong muốn. Lipase trong nấm men và trong đậu nành có thể phá vỡ lipit trong bã đậu nành và tăng lượng axit béo tự do, sau đó có thể được chuyển hóa một phần bởi nấm men thông qua con đường oxy hóa để tạo ra methyl ketone, alcohol và lactone. Các aldehyde không mong muốn có thể được oxy hóa bởi ALDH tạo thành axit béo hoặc được giảm bởi nấm men tạo thành alcohol. Mặt khác, proteinase và peptidase trong nấm men có thể phá vỡ protein trong bã đậu. Những acid amin sau đó có thể bị phân huỷ thêm thông qua con đường Ehrlich bởi nấm men để tạo ra alcohol và ester [33].
Trong quá trình lên men, một loạt các phản ứng sinh hóa xảy ra như sự phân hủy polymer không hòa tan thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp hòa tan và các yếu tố phản dinh dưỡng thành các yếu tố thuận lợi. Vai trò của quá trình tự phân giải tế bào tạo ra các chất dinh dưỡng mới, và hoạt động sinh học giúp tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.
Quá trình lên men cải thiện đáng kể khả năng chống oxy hóa của bã đậu nành do các sản phẩm phân hủy của bã đậu bởi nấm men. Sự cải thiện khả năng chống oxy hóa có thể được đóng góp bởi các yếu tố khác nhau. Khi sự gia tăng số lượng các axit amin nhất định có thể tăng cường hoạt động chống oxy hóa. Các axit amin kỵ nước và thơm, chẳng hạn như histidine, tryptophan và phenylalanine, có đặc tính chống oxy hóa (Pownall và cộng sự, 2010). Sự gia tăng hàm lượng axit amin tự do cũng có thể cho thấy việc sản xuất các peptit chuỗi ngắn hơn và sự phân giải protein của protein bã đậu đã được chứng minh là giải phóng các peptit có hoạt tính sinh học hoặc chất chống oxy hóa (JiménezEscrig và cộng sự, 2010; Nishibori và cộng sự, 2017). Và lượng isoflavone aglycone trong bã đậu nành đã tăng lên sau khi lên men. Phần lớn các isoflavone bã đậu nành tồn tại dưới dạng liên hợp glycoside, có thể bị phân cắt bởi β-glucosidase để giải phóng các đối tác aglycone có hoạt tính sinh học cao hơn (Anderson và Wolf, 1995).
22 Như vậy, mặc dù bã đậu nành có giá trị dinh dưỡng cao nhưng kết cấu của nó khá thô vì hàm lượng cellulose cao và các hạt chất xơ lớn. Ngoài ra, nó có chứa các yếu tố antitrypsin, saponin và chống dinh dưỡng như hemagglutinin, không thể dễ dàng tiêu hóa. Nhưng nhờ quá trình lên men không chỉ có lợi cho tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng, mà còn cải thiện hơn nữa giá trị dinh dưỡng của bã đậu nành. Nó có thể loại bỏ mùi đậu, tăng lượng chất xơ hòa tan, axit amin tự do, đường, axit béo, vitamin B12, vitamin B2, và lactoflavin lactochrom thông qua quá trình lên men [34].
1.3.2 Nấm men Saccharomyces cerevisiae
a. Đặc điểm
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một loài vi sinh vật thuộc chi
Saccharomyces lớp Ascomycetes ngành nấm (Eumycophyta). Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu, và bia.
Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-6 đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng axit amin và muối amon như nguồn nitơ.
b.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và lên men của Saccharomyces cerevisiae
Đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae, điều kiện môi trường ảnh hưởng khá lớn tới tốc độ tăng sinh khối của nấm men, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28÷32oC. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác nếu có điều kiện làm làm lạnh dịch đường tới 20÷22oC sẽ hạn chế được phát triển của tạp khuẩn. Trong điều kiện lên men rượu, pH lên men tối ưu để tạo alcol ethylic là 4,5÷5,0. Khi gây men giống người ta điều chỉnh pH tới 3,8÷4,0 để hạn chế nhiễm tạp [35].
Oxy là thành phần quan trọng trong gian đoạn phát triển sinh khối của tế bào nấm men. Vì lên men là quá trình yếm khí, nhưng lên men trong giai đoạn đầu nhất thiết phải cho dịch lên men tiếp xúc với oxy để cho nấm men sinh
23 trưởng và phát triển. Khi dịch lên men đã đạt số lượng tế bào nấm men, thì hạn chế để dịch lên men tiếp xúc với oxy nhằm cho nấm men tiến hành quá trình chuyển hóa đường thành rượu và CO2 [36].
Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm tốt hơn. Nếu số lượng nấm men quá ít thì tốc độ lên men chậm, phải kéo dài thời gian lên men. Vì thế, hiệu quả của quá trình lên men không cao.
1.3.3 Nấm men Saccharomyces boulardii
a. Đặc điểm
Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi được sử dụng với lượng vừa đủ sẽ có tác dụng có lợi cho vật chủ. Hầu hết là vi khuẩn, được biết đến nhiều nhất là các chủng Lactobacillus spp. và Bifidobacterium spp. Tuy nhiên, có một vi sinh vật không phải vi khuẩn được phân loại là tác nhân probiotic: đó là nấm men
Saccharomyces boulardii (S. boulardii). Gần đây, Khatri và cs (2017) cho thấy rằng các đặc điểm bộ gen và phân loại của S. boulardii gần với các chủng rượu vang thuộc loài S. cerevisiae [37].
Khuẩn lạc nấm men S. boulardii có hình tròn, có màu trắng đục, bề mặt nhẵn, tế bào có hình trứng hoặc hình ô-van. Thành tế bào của S. boulardii dày hơn so với các loại nấm men khác.
Có nghiên cứu chỉ ra rằng, đột biến trong gen PGM2 có thể liên quan đến việc nấm men này sử dụng không hiệu quả galactose. S. boulardii cũng không thể sử dụng palatinose, có thể liên quan đến sự vắng mặt của 3 gen mã hóa isomaltase (IMA2,IMA3 và IMA4), tham gia vào quá trình hấp thu và chuyển hóa palatinose [38].
b. Đặc tính probiotic
Một số đặc tính probiotic của S. boulardii bao gồm khả năng chống stress do thay đổi điều kiện mô phỏng pH đường tiêu hóa và có thể được giải thích bằng các đặc tính của thành tế bào này (Hudson et al. 2016). Ngoài ra, S. boulardii có sức chịu đựng tuyệt vời với nhiệt độ cơ thể 37°C (Czerucka et al. 2007), tiếp xúc với axit dạ dày và mật (Ivanova và cộng sự 2012), bám dính tốt vào thành dạ dày (Diosma và cộng sự 2014), và do đó, có khả năng tồn tại cao
24 (Bastos và cộng sự 2014), có thể đạt nồng độ rất cao trong đường tiêu hóa trong một thời gian rất ngắn.
Theo Hiệp hội Khoa học Quốc tế về Probiotics và Prebiotics chỉ ra rằng S. boulardii khi được sử dụng đầy đủ về lượng sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho người dùng. Nó làm giảm sự xâm nhập của mầm bệnh thông qua việc giữ lại hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện hệ thống miễn dịch, tăng cường sự phát triển của vi khuẩn có lợi và thúc đẩy sản xuất các enzym như lactase và maltase [39].
Cơ chế hoạt động về sự trao đổi chất của S. boulardii ở người có liên quan đến các đặc tính kháng khuẩn, hoạt động dinh dưỡng và điều hòa miễn dịch. Một số cơ chế mà S. boulardii thực hiện đó là giải phóng polyamine kích thích