CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.2 Phương pháp hóa lí
a. Xác định nồng độ chất hòa tan bằng chiết quang kế
Nguyên tắc:
Khúc xạ kế hoạt động giống như lăng kính, nó phản ứng khác nhau với ánh sáng tùy thuộc vào lượng chất hòa tan có trong mẫu lỏng. Khúc xạ kế cho phép người sử dụng xác định được phần trăm khối lượng chất hòa tan tương đối của một mẫu so với nước cất.
b.Xác định độ axit tổng số của dịch sau lên men [53] Nguyên tắc:
Độ chua của dịch sau lên men được biểu diễn theo độ: Một độ chua là số ml NaOH có nồng độ 0,1N cần thiết để trung hòa axit tự do chứa trong 20 ml dịch. Nếu số ml NaOH quy về 0,1N là bằng 1, thì độ chua là 1.
Tiến hành:
- Lấy 20 ml dịch lọc sau lên men cho vào bình tam giác chứa sẵn 100 ml nước cất.
- Thêm vào 3-4 giọt phenolphtalein 0,1%
- Dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn độ đến khi dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây;
37
c. Xác định độ rượu
Mẫu sau khi chưng cất được xác định hàm lượng ethanol bằng phương pháp hóa học [54].
Sử dụng phương pháp chuẩn độ oxy hóa – khử để xác định nồng độ ethanol trong dung dịch lên men. Ethanol được oxy hóa thành axit ethanoic bằng cách phản ứng với kali dichromate dư trong axit. Lượng dichromate không phản ứng được xác định bằng cách thêm dung dịch kali iodua cũng bị oxy hóa bởi kali dicromat tạo thành iot. Sau đó, iot được chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate chuẩn và kết quả chuẩn độ được sử dụng để tính toán hàm lượng ethanol của dung dịch ban đầu.
2 Cr2O72 ̶ + 16 H+ + 3 C2H5OH → 4 Cr3+ + 11 H2O + 3 CH3COOH Cr2O72- + 14 H+ + 6 I ̶ → 2 Cr3+ + 3 I2 + 7 H2O
2 S2O32 ̶ + I2 → S4O62 ̶ + 2 I ̶
Do trong dung dịch lên men có chứa các chất oxy hóa khác có thể gây cản trở cho việc chuẩn độ, dẫn đến kết quả không chính xác, ta có thể sử dụng mẫu kiểm chứng song song với mẫu chuẩn độ để xác định sự chênh lệch. Mẫu kiểm chứng là mẫu dung dịch lên men đã được đuổi khí CO2 và ethanol bằng cách gia nhiệt đến 80oC trong 20 phút.
Mẫu chuẩn độ được tiến hành phản ứng oxy hóa khử theo các bước sau đây. Cả 2 mẫu sẽ được tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate. Kết quả chênh lệch giữa 2 mẫu chính là kết quả cuối cùng được sử dụng để tính nồng độ cồn trong dung dịch lên men.
Tiến hành:
- Mẫu sau khi chưng cất được tiến hành phản ứng giữa dịch lên men với dịch K2Cr2O7 / H2SO4 với nồng độ lần lượt là 0,01/0,05 M. Để qua đêm trong tủ ấm 30oC cho hơi cồn bay hết và phản ứng xảy ra hoàn toàn.
- Sau phản ứng, thêm 100 ml nước cất và 1 ml KI 1,2 M. Lúc này, dịch trong bình phản ứng chuyển sang màu đỏ nâu.
- Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,03 M cho đến khi dung dịch trong bình chuyển màu vàng. Thêm 1 ml dịch chỉ thị tinh bột nồng độ 1% (w/v), dung dịch sẽ chuyển màu xanh đen. Tiếp tục chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,03 M cho đến khi mất màu xanh đen.
38 - Ghi lại thể tích Na2S2O3 tiêu tốn, thực hiện lặp lại 3 lần với mỗi mẫu. Nồng độ cồn của dịch lên men được tính theo công thức sau:
Trong đó:
+ Độ cồn: nồng độ cồn trong dịch lên men (v/v). + F: hệ số pha loãng.
+ a: thể tích Na2S2O3 tiêu tốn để chuẩn độ mẫu trắng (ml). + b: thể tích Na2S2O3 tiêu tốn để chuẩn độ mẫu phản ứng (ml). + 0,04367: hệ số chuyển đổi được tính theo phương trình phản ứng.
d.Xác định hàm lượng đường khử
Xác định lượng đường khử sử dụng thuốc thử DNS. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định [55].
Tiến hành:
* Dựng đường chuẩn glucose; * Chuẩn bị mẫu phân tích:
- Tiến hành ly tâm và lọc thu dịch trong;
- Kết tủa các tạp chất bằng 1,5 ml chì axetat Pb(C2H2O2)2.3H2O 10%, đợi trong 15 phút.
- Loại bỏ chì dư bằng 1,5 ml Na2SO2 bão hòa để yên hỗn hợp 15 phút. - Định mức dịch lên 100ml.
- Li tâm, lọc để loại bỏ kết tủa thu được dịch trong.
- Các dịch lọc được pha loãng đến nồng độ thích hợp trước khi thực hiện các phản ứng tạo màu với thuốc thử;
- Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm; Kết quả:
Từ giá trị mật độ quang đo được, tra đồ thị chuẩn giữa hàm lượng glucose và mật độ quang suy ra hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích: X(mg/ml) đường khử trong dịch đường pha loãng nhân với hệ số pha loãng n (nếu pha loãng)
39
e. Xác định hàm lượng protein hòa tan
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry [56]. Nguyên tắc:
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử Folin. Cường độ màu của hỗn hợp tỷ lệ với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Biết được mật độ quang của protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa vào đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Tiến hành:
* Xây dựng đường chuẩn BSA;
* Mẫu phân tích:
- Tiến hành ly tâm và lọc thu dịch trong;
- Các dịch lọc được pha loãng đến nồng độ thích hợp trước khi thực hiện các phản ứng tạo màu với thuốc thử;
- Đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm; Kết quả:
Từ giá trị mật độ quang đo được và đường chuẩn BSA, bằng phương pháp nội suy ta tính được lượng protein hòa tan có trong mẫu phân tích.
f. Phương pháp xác định hàm lượng axit amin và peptit mạch ngắn tan trong TCA
Nguyên tắc:
Các protein có khối lượng phân tử lớn thường bị kết tủa bởi dung dịch tricloaceti (TCA) 20% ở tỷ lệ 1:1. Phần dịch trong không bị kết tủa bởi TCA gồm các peptit có khối lượng phân tử thấp (từ 330-380 dalton) và các axit amin. Chúng được ly tâm tách riêng khỏi phần protein kết tủa và được xác định hàm lượng bằng thuốc thử Folin Ciocalteur theo Lowry.
Tiến hành:
- Tiến hành ly tâm và lọc thu dịch trong;
- Lấy dịch phân tích và TCA 20% với tỉ lệ là 1:1; - Lắc đều, để yên 30 phút sau đó ly tâm thu dịch trong;
40
g. Xác định hiệu suất thủy phân protein
Hiệu suất thủy phân được xác định qua lượng peptit mạch ngắn và axit amin được tạo thành bởi sự phân cắt của enzym lên các phân tử protein không tan trong TCA và được xác định theo công thức sau:
DH% = ([peptit+aa] sau thủy phân ̶ [peptit+aa] trước thủy phân) × 100/ ([protein không tan trong TCA] trước thủy phân)
Trong đó: Hàm lượng peptit và axit amin trước và sau thủy phân được xác định theo mục 2.3.2f. Hàm lượng protein không tan trong TCA được xác định bằng hiệu của protein tổng có trong nguyên liệu khi chiết tối đa với NaOH 0,1N theo 2.3.2e trừ đi lượng peptit và axit amin của dịch trước thủy phân.
h. Xác định hàm lượng polyphenol
Nguyên tắc:
Các polyphenol trong dịch được xác định bằng phương pháp đo màu, dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thuốc thử này chứa chất oxi hóa là axit phospho- vonframic, trong quá trình khử, các nhóm hydroxy phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm. Phản ứng này là do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molypden [57].
Hóa chất:
- Dung dịch gallic 2g/l: cân 0,11 gam axit gallic.H2O cho vào cốc sạch khô, thêm khoảng 10ml nước cất vào, khuấy tan sau đó chuyển vào bình định mức 50ml. Tiếp theo hút 5ml cồn tuyệt đối cho tiếp vào bình định mức. Rồi thêm nước cất vào định mức chính xác 50ml;
- Dung dịch Folin-Ciocalteu 10%; - Dung dịch Na2CO3 7,5%.
Tiến hành:
* Dựng đường chuẩn axit gallic
Pha loãng các dãy nồng độ sau:
KC I II III IV V
Dung dịch axit gallic 2,5g/l (ml)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Nước cất (ml) 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5
41 -Chuẩn bị dãy ống falcon mới, thực hiện:
KC I II III IV V
Dung dịch axit gallic Ci (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Dung dịch Folin 10% (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
- Voltex, để yên 3 phút;
- Thêm 0,8 ml dung dịch Na2CO3 7,5%; - Vortex để tối 1h, đo OD 765 nm; * Chuẩn bị mẫu phân tích:
- Tiến hành ly tâm và lọc thu dịch trong;
- Lấy mẫu + cồn tuyệt đối với tỉ lệ 1: 1, để trong 24h ở nhiệt độ thường; - Lọc bỏ kết tủa, phần dịch trong thu được làm tương tự như khi dựng đường chuẩn axit gallic;
- Đo OD ở bước sóng 765 nm.
- Từ giá trị mật độ quang đo được và đường chuẩn axit Gallic, bằng phương pháp nội suy ta tính được lượng polyphenol có trong mẫu phân tích.
i.Xác định hàm lượng chất chống oxy hóa
Nguyên tắc:
Các chất kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydro, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ OD càng thấp chứng tỏ bắt gốc tự do DPPH càng cao.
Quá trình hấp thụ ánh sáng của DPPH tương đối ổn định với điều kiện pH thay đổi nhưng không được kiềm quá, người ta xác định rằng quá trình hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 5,17 nm phụ thuộc vào pH trong khoảng 5,0-6,5. Và để cho kết quả tốt nhất thì nên sử dụng đệm axetat [58].
42 Các chất chống oxy hóa phản ứng với DPPH và khử nó thành DPPH-H và kết quả là làm giảm độ hấp thụ của nó. Mức độ chuyển màu cho thấy khả năng quét của các hợp chất chống oxy trong khả năng cho hidro.
Tiến hành:
Chuẩn bị dịch gốc DPPH 0,1mM trong methanol: cân 3,94mg DPPH (0.0039 gam) pha trong 100ml methanol;
Đường chuẩn vitamin C phân tích định lượng [59]. * Dựng đường chuẩn vitamin C:
- Cân 0,0050 gam vitamin C, chuyển vào bình định mức 50ml (chú ý bọc kín bình tránh ánh sáng) ta được dung dịch vitamin C nồng độ 100 μg/ml;
- Lấy dung dịch vitamin C 100 μg/ml + methanol tuyệt đối tỉ lệ 1:3, được dung dịch vitamin C 25 μg/ml, sau đó pha loãng dung dịch vitamin C 25 μg/ml theo bảng sau: Falcon 1 2 3 4 5 6 7 Dung dịch vitamin C 25 μg/ml (ml) 0 0,125 0,25 0,375 0,5 0,625 0,75 Methanol (ml) 1 0,875 0,75 0,625 0,5 0,375 0,25 Nồng độ vitamin C (μg/ml) 0 3,125 6,25 9,375 12,5 15,625 18,75 - Thêm 2ml DPPH 0,1mM vào lần lượt các ống falcon, để tối 30 phút. - Đo độ hấp thụ ở bước sóng 517nm.
- Tính phần trăm quét gốc theo công thức: POXH (%) = .100%
Trong đó: POXH: hoạt tính làm mất màu DPPH (%) R1: Kết quả đo OD của mẫu đối chứng R2: Kết quả đo OD của mẫu phân tích
Chuẩn bị mẫu phân tích:
- Trước khi tiến hành phản ứng DPPH, dịch phân tích cần phải nằm trong pH phản ứng và cần được làm trong.
43 - Đối với mẫu chưa lên men: Dùng axit H3PO4 10% để điều chỉnh pH của dịch về bằng pH của mẫu lên men. Sau đó, kết tủa 1:1 trong methanol để loại cặn protein, li tâm thu dịch trong.
- Đối với mẫu sau lên men: Không cần điều chỉnh pH. Kết tủa trong methanol 1:1, sau đó li tâm thu dịch trong.
- Phần dịch trong thu được thực hiện tương tự, thay 1ml vitamin C bằng 1ml dịch mẫu phân tích;
Từ phần trăm quét gốc tự do, căn cứ đường chuẩn vitamin C, xác định được lượng chất chống oxy hóa trong dịch phân tích tương đương với nồng độ bao nhiêu μg vitamin C/ml.
j. Xác định thành phần các isoflavone
Thành phần các isoflavone của mẫu phân tích được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Sử dụng hệ thống HPLC Allicance của Waters (Mỹ), với cột Agilent HC-C18(2) 150 × 4,6 mm hoặc tương đương.
Các điều kiện HPLC như sau: - Nhiệt độ cột: 35oC;
- Detector PDA ở bước sóng 260 nm;
- Dung môi pha động là A- axit acetic 0,1%; B- axit acetic/ acetonitrile 20/80;
- Tốc độ dòng là 1,0 ml/phút.
- Gradient nồng độ pha: A 88%, B 12% tới A 60%, B 40% và kết thúc là A 88%, B 12%.
Hàm lượng isoflavone được định lượng bằng diện tích các pic.
k. Phân tích các thành phần dễ bay hơi
Mẫu phân tích được chiết bằng etylaxetat tỷ lệ 1:1; sau đó ly tâm thu dịch trong. Dịch này tiếp tục được lọc qua màng 0,2 µm và đem phân tích bằng cách sử dụng máy sắc ký khí khối phổ SCION 456-GC, sử dụng nguồn ion hóa bằng va chạm điện tử (Electron impact, El) hoạt động ở 70eV.