Tiêu chí của dịch bã đậu nành sau quá trình lên men: -Sản phẩm có dạng lỏng, màu trắng đục, đồng đều.
-Mùi thơm hài hòa của sản phẩm lên men, thơm mùi trái cây,… -Vị chua ngọt nhẹ hài hòa tự nhiên.
-Nồng độ rượu: dưới 1,2 %.
-Có một số thành phần dinh dưỡng: Axit amin, chất xơ hòa tan, polyphenol, isoflavone, các chất chống oxi hóa, khoáng chất,...
31
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Bã đậu nành
Bã đậu nành sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ nhà máy sữa đậu nành Vinasoy – Bắc Ninh.
Bã đậu nành sau khi thu nhận từ nhà máy đều được kiểm tra chất lượng bằng cách lấy một lượng nhỏ để phân tích độ ẩm và một số chỉ tiêu vi sinh, hóa lý. Sau đó bã đậu được chia nhỏ vào các túi chịu nhiệt, bảo quản lạnh đông.
Bã đậu trước khi làm thí nghiệm sẽ được rã đông đến nhiệt độ thường và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, tiến hành chuẩn bị dịch thủy phân bã đậu nành.
2.1.2 Các chế phẩm enzym
Alcalase® 2.4L: Là chế phẩm enzym được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, thuộc nhóm endoprotease. Chúng có khả năng phân cắt các liên kết peptit nội phân tử để chuyển protein thành các đoạn peptit. Nhiệt độ tối ưu 30 – 65°C, dải pH hoạt động 7,0 – 9,0 được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC.
Viscozyme® L được sản xuất từ Aspergillus aculeatus là một chất lỏng màu nâu sáng với tỉ trọng xấp xỉ 1,21 g/ml. Gồm các enzym: cellulase, hemicellulase, arabinase, -glucanase và xylanase (Novozymes 2002). Điều kiện hoạt động tối ưu cho Viscozyme® L hoạt động là pH khoảng 3,3 – 5,5 và nhiệt độ 25 – 55°C.
Pectinex® Ultra SP-L là chế phẩm enzyme thương mại, dạng lỏng màu nâu sáng, được sản xuất từ Aspergillus niger, bao gồm hỗn hợp enzym pectinase, hemicellulase và -glucanase. Nhiệt độ tối ưu 40 – 55°C, pH khoảng 3 – 5.
2.1.3 Các chủng nấm men
Nghiên cứu sử dụng 4 chủng nấm men như sau:
Hai chủng nấm men lên men rượu Saccaromyces Cereviseae 7012 và 7028,
lấy từ bộ sưu tập chủng giống của Viện Công nghệ sinh học- công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội;
Chủng nấm men Saccaromyces Cereviseae Safale be 134, được phân lập từ nấm men bia khô. Là loại nấm men bia nổi, có khả năng sinh hương hoa quả dùng trong sản xuất bia ale.
32 Chủng nấm men Saccharomyces boulardii CNCM I-745 được hoạt hóa từ men Bioflora 100mg. S. boulardii CNCM I-745 là nấm men sử dụng làm probiotic trong y học cho con người.
2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Bảng 2.1 Danh mục thiết bị và dụng cụ
STT Thiết bị và dụng cụ STT Thiết bị và dụng cụ
1 Bể ổn nhiệt 11 Buồng đếm Thomas 2 Máy li tâm 12 Tủ sấy 105oC
3 Cân phân tích 13 Tủ hút 4 Máy đo quang 14 Tủ cấy
5 Máy đo pH 15 Tủ nuôi vi sinh vật 6 Máy Vortex 16 Nồi hấp tiệt trùng 7 Máy khuấy từ 17 Các dụng cụ thủy tinh 8 Bếp điện 18 Các dụng cụ cấy vi sinh 9 Bình hút ẩm 19 Ống falcon ly tâm 10 Kính hiển vi 20 Bộ dụng cụ cất cồn 2.2.2 Hóa chất Bảng 2.2 Danh mục hóa chất sử dụng STT Hóa chất sử dụng STT Hóa chất sử dụng 1 Folin- Ciocalteu 2N 12 Na2CO3
2 Albumin huyết thanh bò 13 DPPH 3 DNS (Dinitrosalicylic) 14 Na2SO4
4 Cồn công nghiệp 96% 15 (CH3COO)2Pb 5 Cồn tuyệt đối 99,8% 16 NaOH
6 CuSO4.5H2O 17 Na2C4H4O6.4H2O
7 H2SO4 18 Glucose chuẩn
8 Acetone 19 H3PO4
9 Methanol 20 TCA (CCl3COOH)
10 Vitamine C 21 Axit Gallic
33
2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp vi sinh 2.3.1 Phương pháp vi sinh a. Chuẩn bị môi trường
Môi trường nhân giống cấp I:
- Là môi trường dịch chiết malt, thuận lợi nhất cho sự phát triển của nấm men.
- Thành phần: Dịch malt 10oBx, pH trong khoảng 4,5 - 5
- Dịch chiết malt thu được sau khi điều chỉnh độ Brix và pH được phân phối vào các ống falcon, mỗi ống 10 ml dịch và tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.
Môi trường nhân giống cấp II:
- Là môi trường để nấm men tiếp tục phát triển, đồng thời thích nghi dần với môi trường lên men và giúp kiểm soát mật độ tế bào nấm men trước khi đưa vào lên men.
- Thành phần: Dịch bã đậu nành sau thủy phân có bổ sung thêm 2% đường saccharose, được phân phối vào các ống falcon, mỗi ống 9 ml dịch và hấp tiệt trùng 121oC trong 15 phút.
b. Hình thái của các chủng nấm men
Các chủng nấm men được cấy vào môi trường cấp 1 (dịch chiết malt) trong vòng 24h. Tiến hành quan sát hình dạng của tế bào nấm men trên tiêu bản vi sinh vật sống với kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần.
c. Xác định mật độ tế bào nấm men [53] Nguyên tắc:
- Mật độ tế bào nấm men được xác định thông qua việc đếm số tế bào nấm men trong một thể tích xác định.
- Sử dụng buồng đếm Thomas có 16 ô vuông lớn, trong mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ.
Tiến hành:
- Mẫu được pha loãng đến độ pha loãng thích hợp sao cho khi quan sát ở mỗi ô vuông nhỏ có từ 5-10 tế bào vi sinh vật.
- Thời gian xác định mẫu trong vòng 30 phút. Kết quả được xác định như sau:
34 - Số tế bào trên 1 ml mẫu phân tích: N (TB/ml) =
Với: n: Số tế bào trung bình trên 1 ô lớn v: Thể tích ô lớn v= 1/250 mm3
f: Hệ số pha loãng mẫu
- Đồng thời đếm số tế bào nảy chồi, nếu tế bào nảy chồi có kích thước >1/2 kích thước tế bào mẹ và tách ra thì được tính là 1 tế bào độc lập. % TB nảy chồi =
d.Xác định số tế bào sống chết bằng nhuộm xanh metylen [53] Nguyên tắc:
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. Các tế bào sống có chứa enzym có khả năng chuyển xanh metylen thành chất không màu. Còn các tế bào chết thì enzym không còn hoạt động nên không thể làm mất màu xanh, do đó các tế bào bị nhuộm màu xanh.
Tiến hành:
- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính. - Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.
- Đậy lá kính lên giọt dịch.
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) Kết quả:
% TB sống =
e. Phương pháp xác định mật độ nấm men trong lên men bằng cách đếm khuẩn lạc [53]
- Pha loãng dịch lên men cần kiểm tra đến hệ số pha loãng thích hợp (độ pha loãng là thích hợp khi đếm được từ 15-300 khuẩn lạc trên đĩa thạch).
- Lấy 0,1 ml mẫu hoặc dung dịch đã pha loãng nhỏ lên bề mặt môi trường thạch (môi trường Sabouraud Dextrose Agar có bổ sung agar 2% đã được thanh trùng).
35 - Nuôi ở 30oC trong thời gian 24 - 48 giờ. Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc có trong đĩa thạch.
- Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 hệ số pha loãng liên tiếp để tính mật độ tế bào. Mật độ tế bào nấm men trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu được tính theo công thức:
Trong đó:
+C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa. + n1: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1.
+ n2: số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2. + f1: hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất. + V: thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp peptri (ml).
f. Xác định mật độ tế bào nấm men Saccharomyce boulardii trong dịch sau lên men (khi kết hợp nấm men S. boulardii và nấm men S. cerevisiae)
Trên môi trường YPG (Yeast Peptone Galactose) chỉ chứa đường Galactose, nấm men S. cerevisiae có thể sinh trưởng, phát triển bình thường; nhưng nấm men S. boulardii không sinh trưởng phát triển được. Do nấm men S. boulardii sử dụng không hiệu quả galactose [38].
Trong 24 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường YPG (Yeast Peptone Galactose), nấm men S. boulardii không sinh trưởng, không có khuẩn lạc mọc lên. Do đó, khi chang dịch sau lên men nên môi trường YPG, chúng ta xác định được mật độ tế bào nấm men S. cerevisiae.
Các bước tiến hành:
- Mật độ tế bào hỗn hợp nấm men được xác định thông qua phương pháp xác định mật độ tế bào nấm men bằng cách đếm khuẩn lạc mục 2.3.1e. Ta tính được trung bình số tế bào nấm men có trong dịch sau lên men: X CFU/ml.
- Ước lượng số lượng nấm men trong dịch sau lên men để xác định độ pha loãng thích hợp sao cho trong dịch ở độ pha loãng cuối có mật độ nấm men trong khoảng 300 tế bào/ml dịch. Lấy 2 hoặc 3 độ pha loãng cuối đem đi trang trên đĩa thạch YPG (mỗi độ pha loãng làm 2 hoặc 3 đĩa đối với mối loại môi trường). Nuôi cấy các đĩa đó ở 30°C trong khoảng 24 giờ.
36 Từ số khuẩn trong đĩa thạch YPG ta tính được trung bình số tế bào nấm men S. cerevisiae có trong dịch sau lên men: X1 CFU/ml.
Kết quả:
Mật độ nấm men S. boulardii có trong dịch sau lên men: X 2 = X – X1 (CFU/ml).
g. Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men bằng phương pháp cân bình CO2[53]
Nguyên tắc:
- Dựa trên lượng CO2 thoát ra để đánh giá khả năng lên men của từng chủng giống. Phương pháp này dựa trên sự giảm khối lượng của bình lên men. Nút lên men có chứa axit H2SO4 đặc, trong quá trình lên men, CO2 cùng các chất bay hơi, và hơi nước thoát ra ngoài. Tuy nhiên, hơi nước và các chất bay hơi khác được giữ lại, chỉ có CO2 thoát ra, nên sự giảm khối lượng bình là do CO2.
2.3.2 Phương pháp hóa lí
a. Xác định nồng độ chất hòa tan bằng chiết quang kế
Nguyên tắc:
Khúc xạ kế hoạt động giống như lăng kính, nó phản ứng khác nhau với ánh sáng tùy thuộc vào lượng chất hòa tan có trong mẫu lỏng. Khúc xạ kế cho phép người sử dụng xác định được phần trăm khối lượng chất hòa tan tương đối của một mẫu so với nước cất.
b.Xác định độ axit tổng số của dịch sau lên men [53] Nguyên tắc:
Độ chua của dịch sau lên men được biểu diễn theo độ: Một độ chua là số ml NaOH có nồng độ 0,1N cần thiết để trung hòa axit tự do chứa trong 20 ml dịch. Nếu số ml NaOH quy về 0,1N là bằng 1, thì độ chua là 1.
Tiến hành:
- Lấy 20 ml dịch lọc sau lên men cho vào bình tam giác chứa sẵn 100 ml nước cất.
- Thêm vào 3-4 giọt phenolphtalein 0,1%
- Dùng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn độ đến khi dịch xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây;
37
c. Xác định độ rượu
Mẫu sau khi chưng cất được xác định hàm lượng ethanol bằng phương pháp hóa học [54].
Sử dụng phương pháp chuẩn độ oxy hóa – khử để xác định nồng độ ethanol trong dung dịch lên men. Ethanol được oxy hóa thành axit ethanoic bằng cách phản ứng với kali dichromate dư trong axit. Lượng dichromate không phản ứng được xác định bằng cách thêm dung dịch kali iodua cũng bị oxy hóa bởi kali dicromat tạo thành iot. Sau đó, iot được chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate chuẩn và kết quả chuẩn độ được sử dụng để tính toán hàm lượng ethanol của dung dịch ban đầu.
2 Cr2O72 ̶ + 16 H+ + 3 C2H5OH → 4 Cr3+ + 11 H2O + 3 CH3COOH Cr2O72- + 14 H+ + 6 I ̶ → 2 Cr3+ + 3 I2 + 7 H2O
2 S2O32 ̶ + I2 → S4O62 ̶ + 2 I ̶
Do trong dung dịch lên men có chứa các chất oxy hóa khác có thể gây cản trở cho việc chuẩn độ, dẫn đến kết quả không chính xác, ta có thể sử dụng mẫu kiểm chứng song song với mẫu chuẩn độ để xác định sự chênh lệch. Mẫu kiểm chứng là mẫu dung dịch lên men đã được đuổi khí CO2 và ethanol bằng cách gia nhiệt đến 80oC trong 20 phút.
Mẫu chuẩn độ được tiến hành phản ứng oxy hóa khử theo các bước sau đây. Cả 2 mẫu sẽ được tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfate. Kết quả chênh lệch giữa 2 mẫu chính là kết quả cuối cùng được sử dụng để tính nồng độ cồn trong dung dịch lên men.
Tiến hành:
- Mẫu sau khi chưng cất được tiến hành phản ứng giữa dịch lên men với dịch K2Cr2O7 / H2SO4 với nồng độ lần lượt là 0,01/0,05 M. Để qua đêm trong tủ ấm 30oC cho hơi cồn bay hết và phản ứng xảy ra hoàn toàn.
- Sau phản ứng, thêm 100 ml nước cất và 1 ml KI 1,2 M. Lúc này, dịch trong bình phản ứng chuyển sang màu đỏ nâu.
- Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,03 M cho đến khi dung dịch trong bình chuyển màu vàng. Thêm 1 ml dịch chỉ thị tinh bột nồng độ 1% (w/v), dung dịch sẽ chuyển màu xanh đen. Tiếp tục chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,03 M cho đến khi mất màu xanh đen.
38 - Ghi lại thể tích Na2S2O3 tiêu tốn, thực hiện lặp lại 3 lần với mỗi mẫu. Nồng độ cồn của dịch lên men được tính theo công thức sau:
Trong đó:
+ Độ cồn: nồng độ cồn trong dịch lên men (v/v). + F: hệ số pha loãng.
+ a: thể tích Na2S2O3 tiêu tốn để chuẩn độ mẫu trắng (ml). + b: thể tích Na2S2O3 tiêu tốn để chuẩn độ mẫu phản ứng (ml). + 0,04367: hệ số chuyển đổi được tính theo phương trình phản ứng.
d.Xác định hàm lượng đường khử
Xác định lượng đường khử sử dụng thuốc thử DNS. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định [55].
Tiến hành:
* Dựng đường chuẩn glucose; * Chuẩn bị mẫu phân tích:
- Tiến hành ly tâm và lọc thu dịch trong;
- Kết tủa các tạp chất bằng 1,5 ml chì axetat Pb(C2H2O2)2.3H2O 10%, đợi trong 15 phút.
- Loại bỏ chì dư bằng 1,5 ml Na2SO2 bão hòa để yên hỗn hợp 15 phút. - Định mức dịch lên 100ml.
- Li tâm, lọc để loại bỏ kết tủa thu được dịch trong.
- Các dịch lọc được pha loãng đến nồng độ thích hợp trước khi thực hiện các phản ứng tạo màu với thuốc thử;
- Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm; Kết quả:
Từ giá trị mật độ quang đo được, tra đồ thị chuẩn giữa hàm lượng glucose và mật độ quang suy ra hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích: X(mg/ml) đường khử trong dịch đường pha loãng nhân với hệ số pha loãng n (nếu pha loãng)
39
e. Xác định hàm lượng protein hòa tan
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Lowry [56]. Nguyên tắc:
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử Folin. Cường độ màu của hỗn hợp tỷ lệ với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Biết được mật độ quang của protein nghiên cứu với thuốc thử folin, dựa vào đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử này ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Tiến hành:
* Xây dựng đường chuẩn BSA;
* Mẫu phân tích:
- Tiến hành ly tâm và lọc thu dịch trong;
- Các dịch lọc được pha loãng đến nồng độ thích hợp trước khi thực hiện các phản ứng tạo màu với thuốc thử;
- Đo độ hấp thụ tại bước sóng 750nm; Kết quả:
Từ giá trị mật độ quang đo được và đường chuẩn BSA, bằng phương pháp nội suy ta tính được lượng protein hòa tan có trong mẫu phân tích.
f. Phương pháp xác định hàm lượng axit amin và peptit mạch ngắn tan trong TCA
Nguyên tắc:
Các protein có khối lượng phân tử lớn thường bị kết tủa bởi dung dịch