Bố trí thí nghiệm

2.4.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme chuyển hóa bã đậu nành thu dịch thủy phân để lên men tạo đồuống

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bã đến quá trình thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L

Tiến hành thủy phân bã đậu nành (hấp ở 121oC trong 15 phút) với các nồng độ bã 3%, 4% và 5% (tính theo chất khô) bằng chế phẩm enzyme Alcalase® 2.4L (32,5 U/g chất khô) ở điều kiện pH 7 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N); nhiệt độ 50oC; trong thời gian 1 giờ.

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bã đến quá trình thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L kết hợp Viscozyme® L

Tiến hành thủy phân bã đậu nành (hấp ở 121oC trong 15 phút) với các nồng độ bã 4% và 5% (tính theo chất khô) bằng chế phẩm enzyme Alcalase® 2.4L (32,5 U/g chất khô) ở điều kiện pH 7 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N); nhiệt độ 50oC; trong thời gian 1 giờ. Sau đó chỉnh xuống pH 4,5 (dùng H3PO4 10%); bổ sung Viscozyme® L (3% enzym/ chất khô); thủy phân trong thời gian 3 giờ.

c. Thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L kết hợp Viscozyme®

L và Pectinex® Ultra SP-L

Tiến hành thủy phân bã đậu nành (hấp ở 121oC trong 15 phút) bằng Alcalase® 2.4L (32,5 U/g chất khô) ở điều kiện pH 7 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N); nhiệt độ 50oC; nồng độ bã 5% (tính theo chất khô) trong thời gian 1 giờ. Sau đó chỉnh xuống pH 4,5 (dùng H3PO4 10%), bổ sung Viscozyme® L và Pectinex® Ultra SP-L (3% enzym/ chất khô); thủy phân trong thời gian 3 giờ.

2.4.2Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men thích hợp lên men dịch thủy phân bã đậu nành

47 - Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành;

- Khả năng lên men của chủng nấm men, dịch lên men có hương vị tốt, khả năng chuyển hóa các tiền chất trong bã đậu tạo ra các chất có lợi, có hoạt tính chống oxi hóa cao…

a. Nghiên cứu hình thái của các chủng nấm men

- Các chủng nấm men sử dụng trong nghiên cứu được hoạt hóa, phân lập và cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng, bảo quản lạnh.

- Các chủng này được cấy vào môi trường cấp 1 (dịch chiết malt), nuôi ở 30oC trong vòng 24h. Tiến hành quan sát hình dạng của tế bào nấm men trên tiêu bản vi sinh vật sống với kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần.

b. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành

- Các chủng nấm men sau khi hoạt hóa 24h trong môi trường nhân giống cấp 1, được chuyển sang môi trường nhân giống cấp 2 và nuôi ở 30oC;

- Sau đó định kỳ lấy mẫu tiến hành xác định mật độ tế bào tại các thời điểm 0h, 2h, 4h, 6h, …. để theo dõi khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng của mỗi chủng nấm men trên dịch thủy phân bã đậu nành.

c. Nghiên cứu khả năng lên men của các chủng nấm men

- Tiến hành cấp chủng giống từ cấp 2 vào dịch thủy phân bã đậu nành, với cùng tỉ lệ giống cấp của mỗi chủng và lên men trong cùng một điều kiện;

- Sử dụng nút axit cho mỗi bình lên men, theo dõi khả năng lên men thông qua lượng CO2 thoát ra theo thời gian ở mỗi bình.

- Phân tích các chỉ tiêu sau quá trình lên men:

+ Hàm lượng đường khử còn lại, protein hòa tan, axit amin và peptit mạch ngắn, polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa, ….

+ Tính chất cảm quan, …

- Từ đó đưa ra kết quả so sánh khả năng lên men của các chủng trong dịch thủy phân bã đậu nành.

2.4.3 Nghiên cứu điều kiện lên men của chủng nấm men đã chọn trên dịch thủy phân bã đậu nành dịch thủy phân bã đậu nành

Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình lên men đối với chủng nấm men đã chọn dựa trên việc đánh giá các chỉ tiêu: mật độ tế bào; nồng độ rượu; độ chua, pH, hàm lượng đường khử còn lại; hàm lượng chất khô hòa tan; hàm lượng protein hòa tan, axit amin và peptit mạch ngắn, hoạt tính chống oxy hóa, tính chất cảm quan, …

a. Điều kiện pH dịch trước lên men

Thí nghiệm được tiến hành với các điều kiện cố định bao gồm: -Mật độ giống ban đầu khoảng: 106 – 5.106 CFU/ml;

-Nhiệt độ lên men 30oC;

-Hàm lượng đường bổ sung 2% (g/v); -Thời gian lên men 24 giờ;

Do pH của dịch bã đậu nành sau quá trình thủy phân là 4,2. Đây là pH nằm trong khoảng pH thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae thích nghi và lên men tốt. Nên tiến hành khảo sát tại các pH: 3,5; 4; 4,2; 4,5.

Sau lên men, phân tích các chỉ tiêu: + Lượng C02 thoát ra;

+ Mật độ tế bào nấm men trong dịch sau lên men;

+ Hàm lượng đường khử còn lại, hàm lượng protein hòa tan, axit amin và peptit mạch ngắn, polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa, độ chua, nồng độ rượu, Bx, pH…

Khi thay đổi pH của dịch trước lên men, sau quá trình lên men các thông số của dịch sẽ thay đổi khác nhau. Dựa vào các chỉ tiêu của dịch sau lên men, ta sẽ chọn giá trị pH mà tại đó nấm men sinh trưởng phát triển tốt, dịch lên men có hương vị tốt, khả năng chuyển hóa các tiền chất trong bã đậu tạo ra các chất có lợi, có hoạt tính chống oxi hóa cao…

b.Điều kiện nhiệt độ

Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện cố định bao gồm: -Mật độ giống ban đầu khoảng 106 – 5.106 CFU/ml; -pH của dịch trước lên men (pH đã chọn ở mục 2.4.2a); -Hàm lượng đường bổ sung 2% (g/v);

49 -Thời gian lên men 24 giờ;

Thay đổi nhiệt độ lên men: 20, 25, 30, 35oC;

Sau lên men, phân tích các chỉ tiêu tương tự như trên. Dựa vào các chỉ tiêu và tiêu chí của các mẫu sau lên men tương ứng, chọn điều kiện nhiệt độ thích hợp.

c. Hàm lượng đường saccarose bổ sung

Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện cố định bao gồm: -Mật độ giống ban đầu khoảng 106 – 5.106 CFU/ml; -pH của dịch trước lên men (pH đã chọn ở mục 2.4.2a); -Nhiệt độ lên men (nhiệt độ đã chọn được ở mục 2.4.2b); -Thời gian lên men 24 giờ;

Mục đích giúp tăng khả năng lên men nhưng cần khống chế lượng rượu tạo thành, nên tiến hành khảo sát lượng đường saccarose bổ sung: 0%, 1%, 2%, 3%;

Sau lên men, phân tích các chỉ tiêu tương tự như trên. Dựa vào các chỉ tiêu và tiêu chí của các mẫu sau lên men tương ứng, chọn lượng đường saccarose bổ sung phù hợp.

d. Mật độ giống ban đầu

Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện cố định bao gồm: -pH của dịch trước lên men (pH đã chọn được ở mục 2.4.2a); -Nhiệt độ lên men (nhiệt độ đã chọn được ở mục 2.4.2b); -Bổ sung đường với tỉ lệ (đã chọn được ở mục 2.4.2c); -Thời gian lên men 24 giờ;

Thay đổi mật độ giống ban đầu: 105, 5×105, 106, 5×106 CFU/ml;

Sau lên men, phân tích các chỉ tiêu tương tự như trên. Dựa vào các chỉ tiêu và tiêu chí của các mẫu sau lên men tương ứng, chọn ra mật độ giống ban đầu phù hợp.

e. Khảo sát thời gian lên men

- Tiến hành thí nghiệm với các điều kiện pH trước lên men, nhiệt độ, mật độ giống ban đầu, tỉ lệ đường bổ sung đã chọn được ở các mục trên.

- Thay đổi thời gian lên men: 12, 24, 36, 48, 72 giờ;

- Dựa vào các chỉ tiêu và tiêu chí của các mẫu sau lên men tương ứng, để xác định thời điểm hợp lý kết thúc quá trình lên men.

2.4.4 Nghiên cứu khả năng lên men kết hợp chủng trên dịch thủy phân bã đậu nành phân bã đậu nành

Sau khi nghiên cứu điều kiện lên men của mỗi chủng đã chọn trên dịch thủy phân bã đậu nành, chọn ra điều kiện phù hợp để kết hợp hai chủng với mục đích: cải thiện dịch lên men có hương vị tốt, khả năng chuyển hóa các tiền chất trong bã đậu tạo ra các chất có lợi, có hoạt tính chống oxi hóa cao, đồng thời chứa probiotic mang lại lợi ích sức khỏe cho người dùng.

Nghiên cứu khả năng kết hợp chủng lên men dịch thủy phân bã đậu nành với các trường hợp lên men đồng thời hay thời điểm bổ sung khác nhau;

Sau quá trình lên men đánh giá các chỉ tiêu: mật độ tế bào; nồng độ rượu; độ chua, pH, hàm lượng đường khử còn lại; hàm lượng chất khô hòa tan; hàm lượng protein hòa tan, axit amin và peptit mạch ngắn, hoạt tính chống oxy hóa, tính chất cảm quan, …Từ các chỉ tiêu và tiêu chí của các mẫu sau lên men tương ứng, đưa ra đánh giá về khả năng lên men kết hợp chủng, điều kiện lên men trên dịch thủy phân bã đậu nành nhằm mang lại những chỉ tiêu tốt nhất.

2.4.5 Đánh giá chất lượng sản phẩm cuối

Đánh giá sản phẩm sau lên men:

-Đặc điểm sản phẩm: màu sắc, trạng thái, mùi, vị,…

-Xác định thành phần các chất dinh dưỡng có trong 100ml sản phẩm: Hàm lượng đường khử, protein hòa tan, axit amin và peptit mạch ngắn, polyphenol, isoflavone, hàm lượng chất có hoạt tính chống oxi hóa

-Đánh giá cảm quan sản phẩm.

2.4.6 Theo dõi một số chỉ tiêu của sản phẩm trong thời gian bảo quản

Theo dõi một số chỉ tiêu, tính chất của sản phẩm khi để ở nhiêt độ bảo quản thực tế (4-6oC). Một số chỉ tiêu theo dõi trong quá trình bảo quản sản phẩm: mật độ tế bào probiotic, độ pH, cảm quan, axit tổng số.

2.4.7 Sơ đồ quy trình thí nghiệm

 Thuyết minh quy trình a. Chuẩn bị dịch lên men

Bã đậu nành sau khi thu nhận từ nhà máy tiến hành kiểm tra chất lượng bằng cách lấy một lượng nhỏ để phân tích độ ẩm và một số chỉ tiêu vi sinh, hóa lý. Sau đó bã đậu được chia nhỏ vào các túi chịu nhiệt, bảo quản lạnh đông.

Thanh trùng

Thanh trùng Phân tích chỉ tiêu dịch

trước lên men

Phân tích chỉ tiêu dịch trước lên men

Dịch lên men

Dịch lên men Lên men (24 - 48h)

Lên men (24 - 48h)

Phân tích chỉ tiêu dịch sau lên men

Cấy giống cấp 1

Cấy giống cấp 1 Cấy giống cấp 2

Cấy giống cấp 2

Bx, pH

Lượng protein hòa tan Lượng axitamin và peptit mạch ngắn. Hàm lượng đường khử Polyphenol

Hoạt chất chống oxi hóa Bx, pH

Lượng protein hòa tan Lượng axitamin và peptit mạch ngắn. Hàm lượng đường khử Polyphenol

Hoạt chất chống oxi hóa

Bã đậu nành đã xử lý ở 121oC trong 15 phút Dừng lên men Dừng lên men Lượng CO2 thoát ra Mật độ tế bào nấm men Độ rượu, độ chua

Hàm lượng đường khử còn lại Lượng protein hòa tan

Axitamin, peptit mạch ngắn Polyphenol

Hoạt chất chống oxi hóa

Hình II.1 Bã đậu nànhLượng CO2 thoát ra

Mật độ tế bào nấm men Độ rượu, độ chua

Hàm lượng đường khử còn lại Lượng protein hòa tan

Axitamin, peptit mạch ngắn Polyphenol Thủy phân Thanh trùng Nước Enzyme Nấm men

52 Bã đậu trước khi làm thí nghiệm sẽ được rã đông đến nhiệt độ thường và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, bổ sung nước và tiến hành thủy phân sử dụng các chế phẩm enzyme Alcalase 2.4L, Viscozyme L, Pectinex Ultra SP-L.

Dịch bã đậu nành sau quá trình thủy phân được thanh trùng ở nhiệt độ khoảng 75-80oC trong 20 phút, sẽ làm vô hoạt bất thuận nghịch enzym và ức chế hệ vi sinh vật trong dịch.

Sau đó chiết rót vô trùng 90 ml dịch vào các chai thủy tinh 200 ml đã tiệt trùng.

b.Cấy giống

* Cấy giống cấp 1

- Môi trường cấp 1: 10ml dịch chiết malt hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.

- Cấy giống: một vòng que cấy từ ống giống thạch nghiêng vào môi trường cấp 1, nuôi ở tủ ấm 30oC trong 24h.

- Tiến hành đếm mật độ tế bào nấm men, cố định mật độ tế bào trước khi cấy cấp 2.

* Cấy giống cấp 2

- Môi trường cấp 2: 9ml (dịch thủy phân bã đậu nành có bổ sung 2% đường saccarose), tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.

- Cấy giống: dùng micropipet hút 1ml từ ống giống cấp 1 vào 9ml môi trường cấp 2, nuôi ở tủ ấm 30oC trong 24h.

- Tiến hành đếm mật độ tế bào nấm men trước khi đưa vào lên men.

c. Lên men

- Bổ sung 10ml dịch nuôi cấy cấp 2 vào 90ml dịch bã đậu sau thủy phân đã thanh trùng, sử dụng nút axit, tiến hành lên men theo các điều kiện nghiên cứu ở trên.

- Trong quá trình lên men, theo dõi lượng CO2 thoát ra.

- Sau lên men, đếm mật độ tế bào nấm men, tiến hành đo, phân tích các chỉ tiêu sau lên men như đã nêu ở trên.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme chuyển hóa bã đậu nành thu dịch thủy phân để lên men tạo đồ uống

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bã đến quá trình thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ bã đậu đến quá trình thủy phân của Alcalase® 2.4L Hàm lượng Nồng độ bã (%) 3 4 5 Protein (mg/100 ml) 268,31a ±1,39 383,14b ±1,34 462,14c ±18,73 Peptit mạch ngắn và axit amin (mg/100 ml) 242,91 a ±4,75 320,29b ±3,26 357,75c ±2,88 Polyphenol tổng số (GAE) (mg/100 ml) 13,18 a ±0,05 17,42b ±0,20 21,39c ±0,14

Hiệu suất thủy phân (%) 38,93a ±0,78 38,66a ±0,41 34,22b ±0,29

Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Kết quả phân tích ở bảng 3.1 cho thấy khi cố định tỷ lệ enzym/ cơ chất và các điều kiện thủy phân (pH, nhiệt độ, thời gian) như nhau hàm lượng các chất hòa tan trong dịch sau thủy phân đều tăng lên tương đồng khi tăng nồng độ bã đậu. Tuy nhiên quan sát với nồng độ bã 5% (tính theo chất khô), dịch thủy phân bị sánh, đặc và nhớt, cánh khuấy hoạt động khá khó do đó dẫn đến hiệu suất thủy phân của enzym ở mẫu này thấp hơn so với hai mẫu ở nồng độ bã 3% và 4%.

Kết quả phân tích cũng cho thấy ở nồng độ bã 4%, hiệu suất thủy phân tương đương với mẫu 3% nhưng hàm lượng các chất hòa tan trong dịch đều cao hơn, đặc biệt hàm lượng peptit mạch ngắn và axit amin đạt cao gần bằng mẫu

54 5%. Từ đây có thể thấy nồng độ bã đậu 4% (tính theo chất khô) là phù hợp khi thủy phân bã đậu bằng chế phẩm enzym Alcalase® 2.4L.

Ở nồng độ bã 4% (tính theo chất khô), so với lượng protein trong mẫu đối chứng không thủy phân (chứa 189,2 mg/100ml protein, 11,97 mg/100ml axit amin và peptit mạch ngắn, 7,57 mg/100ml polyphenol tổng số), sau 1 giờ thủy phân bằng enzym Alcalase® 2.4L, lượng protein giải phóng vào dịch tăng gấp hơn 2 lần. Lượng peptit mạch ngắn và axit amin tăng tương ứng 26,8 lần và lượng polyphenol tổng số tăng 2,3 lần. Từ kết quả phân tích cho thấy dịch thủy phân thu được có hàm lượng các chất hòa tan tăng đáng kể so với trước khi thủy phân. Như vậy, thủy phân protein trong bã đậu bằng protease là một phương pháp tiềm năng để tái sử dụng bã đậu, tận dụng các chất dinh dưỡng còn giá trị trong phụ phẩm [26].

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bã đến quá trình thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L kết hợp Viscozyme® L

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ bã đậu đến quá trình thủy phân của Alcalase® 2.4L và Viscozyme® L Hàm lượng Nồng độ bã (%) 4% 5% Đường khử (mg/100 ml) 549,16 ± 5,85 772,25 ± 9,84 Protein (mg/100 ml) 468,17 ± 3,08 580,05 ± 1,16 Peptit mạch ngắn và axit amin (mg/100 ml) 374,97 ± 2,14 462,29 ± 3,22 Polyphenol tổng số (GAE) (mg/100 ml) 19,98 ± 0,11 26,02 ± 0,52

Kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy, cùng một lượng enzym và các điều kiện thủy phân (pH, nhiệt độ, thời gian) như nhau hàm lượng các chất hòa tan

55 trong dịch sau thủy phân đều tăng lên một lượng đáng kể khi tăng nồng độ cơ

Quá trình thủy phân bã đậu nành

Tiêu chí sản phẩm nghiên cứu