Thuyết minh quy trình a. Chuẩn bị dịch lên men
Bã đậu nành sau khi thu nhận từ nhà máy tiến hành kiểm tra chất lượng bằng cách lấy một lượng nhỏ để phân tích độ ẩm và một số chỉ tiêu vi sinh, hóa lý. Sau đó bã đậu được chia nhỏ vào các túi chịu nhiệt, bảo quản lạnh đông.
Thanh trùng
Thanh trùng Phân tích chỉ tiêu dịch
trước lên men
Phân tích chỉ tiêu dịch trước lên men
Dịch lên men
Dịch lên men Lên men (24 - 48h)
Lên men (24 - 48h)
Phân tích chỉ tiêu dịch sau lên men
Phân tích chỉ tiêu dịch sau lên men
Cấy giống cấp 1
Cấy giống cấp 1 Cấy giống cấp 2
Cấy giống cấp 2
Bx, pH
Lượng protein hòa tan Lượng axitamin và peptit mạch ngắn. Hàm lượng đường khử Polyphenol
Hoạt chất chống oxi hóa Bx, pH
Lượng protein hòa tan Lượng axitamin và peptit mạch ngắn. Hàm lượng đường khử Polyphenol
Hoạt chất chống oxi hóa
Bã đậu nành đã xử lý ở 121oC trong 15 phút Dừng lên men Dừng lên men Lượng CO2 thoát ra Mật độ tế bào nấm men Độ rượu, độ chua
Hàm lượng đường khử còn lại Lượng protein hòa tan
Axitamin, peptit mạch ngắn Polyphenol
Hoạt chất chống oxi hóa
Hình II.1 Bã đậu nànhLượng CO2 thoát ra
Mật độ tế bào nấm men Độ rượu, độ chua
Hàm lượng đường khử còn lại Lượng protein hòa tan
Axitamin, peptit mạch ngắn Polyphenol Thủy phân Thanh trùng Nước Enzyme Nấm men
52 Bã đậu trước khi làm thí nghiệm sẽ được rã đông đến nhiệt độ thường và hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, bổ sung nước và tiến hành thủy phân sử dụng các chế phẩm enzyme Alcalase 2.4L, Viscozyme L, Pectinex Ultra SP-L.
Dịch bã đậu nành sau quá trình thủy phân được thanh trùng ở nhiệt độ khoảng 75-80oC trong 20 phút, sẽ làm vô hoạt bất thuận nghịch enzym và ức chế hệ vi sinh vật trong dịch.
Sau đó chiết rót vô trùng 90 ml dịch vào các chai thủy tinh 200 ml đã tiệt trùng.
b.Cấy giống
* Cấy giống cấp 1
- Môi trường cấp 1: 10ml dịch chiết malt hấp tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Cấy giống: một vòng que cấy từ ống giống thạch nghiêng vào môi trường cấp 1, nuôi ở tủ ấm 30oC trong 24h.
- Tiến hành đếm mật độ tế bào nấm men, cố định mật độ tế bào trước khi cấy cấp 2.
* Cấy giống cấp 2
- Môi trường cấp 2: 9ml (dịch thủy phân bã đậu nành có bổ sung 2% đường saccarose), tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Cấy giống: dùng micropipet hút 1ml từ ống giống cấp 1 vào 9ml môi trường cấp 2, nuôi ở tủ ấm 30oC trong 24h.
- Tiến hành đếm mật độ tế bào nấm men trước khi đưa vào lên men.
c. Lên men
- Bổ sung 10ml dịch nuôi cấy cấp 2 vào 90ml dịch bã đậu sau thủy phân đã thanh trùng, sử dụng nút axit, tiến hành lên men theo các điều kiện nghiên cứu ở trên.
- Trong quá trình lên men, theo dõi lượng CO2 thoát ra.
- Sau lên men, đếm mật độ tế bào nấm men, tiến hành đo, phân tích các chỉ tiêu sau lên men như đã nêu ở trên.
53
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme chuyển hóa bã đậu nành thu dịch thủy phân để lên men tạo đồ uống
3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bã đến quá trình thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L
Tiến hành thủy phân bã đậu nành (hấp ở 121oC trong 15 phút) với các nồng độ bã 3%, 4% và 5% (tính theo chất khô) bằng chế phẩm enzyme Alcalase® 2.4L (32,5 U/g chất khô) ở điều kiện pH 7 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N); nhiệt độ 50oC; trong thời gian 1 giờ; thu được kết quả bảng 3.1:
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ bã đậu đến quá trình thủy phân của Alcalase® 2.4L Hàm lượng Nồng độ bã (%) 3 4 5 Protein (mg/100 ml) 268,31a ±1,39 383,14b ±1,34 462,14c ±18,73 Peptit mạch ngắn và axit amin (mg/100 ml) 242,91 a ±4,75 320,29b ±3,26 357,75c ±2,88 Polyphenol tổng số (GAE) (mg/100 ml) 13,18 a ±0,05 17,42b ±0,20 21,39c ±0,14
Hiệu suất thủy phân (%) 38,93a ±0,78 38,66a ±0,41 34,22b ±0,29
Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Kết quả phân tích ở bảng 3.1 cho thấy khi cố định tỷ lệ enzym/ cơ chất và các điều kiện thủy phân (pH, nhiệt độ, thời gian) như nhau hàm lượng các chất hòa tan trong dịch sau thủy phân đều tăng lên tương đồng khi tăng nồng độ bã đậu. Tuy nhiên quan sát với nồng độ bã 5% (tính theo chất khô), dịch thủy phân bị sánh, đặc và nhớt, cánh khuấy hoạt động khá khó do đó dẫn đến hiệu suất thủy phân của enzym ở mẫu này thấp hơn so với hai mẫu ở nồng độ bã 3% và 4%.
Kết quả phân tích cũng cho thấy ở nồng độ bã 4%, hiệu suất thủy phân tương đương với mẫu 3% nhưng hàm lượng các chất hòa tan trong dịch đều cao hơn, đặc biệt hàm lượng peptit mạch ngắn và axit amin đạt cao gần bằng mẫu
54 5%. Từ đây có thể thấy nồng độ bã đậu 4% (tính theo chất khô) là phù hợp khi thủy phân bã đậu bằng chế phẩm enzym Alcalase® 2.4L.
Ở nồng độ bã 4% (tính theo chất khô), so với lượng protein trong mẫu đối chứng không thủy phân (chứa 189,2 mg/100ml protein, 11,97 mg/100ml axit amin và peptit mạch ngắn, 7,57 mg/100ml polyphenol tổng số), sau 1 giờ thủy phân bằng enzym Alcalase® 2.4L, lượng protein giải phóng vào dịch tăng gấp hơn 2 lần. Lượng peptit mạch ngắn và axit amin tăng tương ứng 26,8 lần và lượng polyphenol tổng số tăng 2,3 lần. Từ kết quả phân tích cho thấy dịch thủy phân thu được có hàm lượng các chất hòa tan tăng đáng kể so với trước khi thủy phân. Như vậy, thủy phân protein trong bã đậu bằng protease là một phương pháp tiềm năng để tái sử dụng bã đậu, tận dụng các chất dinh dưỡng còn giá trị trong phụ phẩm [26].
3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bã đến quá trình thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L kết hợp Viscozyme® L
Tiến hành thủy phân bã đậu nành (hấp ở 121oC trong 15 phút) với các nồng độ bã 4% và 5% (tính theo chất khô) bằng chế phẩm enzyme Alcalase® 2.4L (32,5 U/g chất khô) ở điều kiện pH 7 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N); nhiệt độ 50oC; trong thời gian 1 giờ. Sau đó chỉnh xuống pH 4,5 (dùng H3PO4 10%); bổ sung Viscozyme® L (3% enzym/ chất khô); thủy phân trong thời gian 3 giờ. Kết quả thu được bảng 3.2:
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ bã đậu đến quá trình thủy phân của Alcalase® 2.4L và Viscozyme® L Hàm lượng Nồng độ bã (%) 4% 5% Đường khử (mg/100 ml) 549,16 ± 5,85 772,25 ± 9,84 Protein (mg/100 ml) 468,17 ± 3,08 580,05 ± 1,16 Peptit mạch ngắn và axit amin (mg/100 ml) 374,97 ± 2,14 462,29 ± 3,22 Polyphenol tổng số (GAE) (mg/100 ml) 19,98 ± 0,11 26,02 ± 0,52
Kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy, cùng một lượng enzym và các điều kiện thủy phân (pH, nhiệt độ, thời gian) như nhau hàm lượng các chất hòa tan
55 trong dịch sau thủy phân đều tăng lên một lượng đáng kể khi tăng nồng độ cơ chất bã đậu. Theo quan sát, dịch với nồng độ bã 5% (tính theo chất khô) khi thủy phân sử dụng Alcalase® 2.4L kết hợp với Viscozyme® L đã làm giảm độ đặc sánh, cánh khuấy thực hiện dễ dàng hơn. Thủy phân bã đậu sử dụng Alcalase®
2.4L kết hợp với Viscozyme® L giúp tăng lượng đường khử trong dịch lên gấp khoảng 10 lần so với khi chỉ thủy phân bằng Alcalase® 2.4L, bên cạnh đó còn làm tăng thêm hàm lượng protein, axit amin và polyphenol.
Như vậy, với mong muốn thu được dịch thủy phân bã đậu nành có hàm lượng các chất hòa tan cao, nên chọn nồng độ bã đậu 5% (tính theo chất khô) khi thủy phân sử dụng Alcalase® 2.4L kết hợp với Viscozyme® L.
3.1.3 Kết quả thủy phân bã đậu nành bằng Alcalase® 2.4L kết hợp Viscozyme® L và Pectinex® Ultra SP-L Viscozyme® L và Pectinex® Ultra SP-L
Tiến hành thủy phân bã đậu nành (hấp ở 121oC trong 15 phút) bằng Alcalase® 2.4L (32,5 U/g chất khô) ở điều kiện pH 7 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N); nhiệt độ 50oC; nồng độ bã 5% (tính theo chất khô) trong thời gian 1 giờ. Sau đó chỉnh xuống pH 4,5 (dùng H3PO4 10%), bổ sung Viscozyme® L và Pectinex® Ultra SP-L (3% enzym/ chất khô); thủy phân trong thời gian 3 giờ. Thu được dịch bã đậu nành sau thủy phân có các thành phần được thể hiện trong bảng 3.3:
Bảng 3.3 Thành phần dịch thủy phân bã đậu nành bởi Alcalase® 2.4L kết hợp Viscozyme® L và Pectinex® Ultra SP-L
Thành phần Đơn vị Hàm lượng
Hàm lượng đường khử mg/100ml 962 ± 0,8 Hàm lượng protein hòa tan mg/100ml 556 ± 6,2 Hàm lượng axit amin và
peptit mạch ngắn tan trong TCA
mg/100ml 446 ± 5,1
Hàm lượng chất khô hòa
tan trong dịch mg/100ml 2175 ± 45,0 Hàm lượng polyphenol mgGAE/100ml 27,7 ± 0,1 Hàm lượng chất có hoạt
tính chống oxy hóa
mgVTMC/100
ml 0,52 ± 0,011
56 Kết quả phân tích bảng 3.3 thu được dịch thủy phân bã đậu nành bằng ba chế phẩm enzym có hàm lượng các chất hòa tan đều cao hơn so với khi thủy phân bã đậu bằng hai chế phẩm enzym Alcalase® 2.4L và Viscozyme® L. Hàm lượng đường khử tăng thêm khoảng 200 mg/100ml. Bên cạnh đó, chế phẩm enzym Pectinex® Ultra SP-L giúp dịch thủy phân giảm độ nhớt rõ rệt.
Đặc điểm dịch thủy phân có cấu trúc sánh mịn, có mùi đậu đặc trưng, mùi bã đậu không mong muốn. Nhưng có các hàm lượng chất khô hòa tan, lượng đường khử, protein hòa tan, axit amin, là nguồn N, C,…. cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển và lên men, giúp cải thiện mùi vị và gia tăng giá trị dinh dưỡng,…
3.2 Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men thích hợp 3.2.1 Kết quả nghiên cứu hình thái của các chủng nấm men 3.2.1 Kết quả nghiên cứu hình thái của các chủng nấm men
Các chủng này được cấy vào môi trường cấp 1 (dịch chiết malt), nuôi ở 30oC trong vòng 24h. Tiến hành quan sát hình dạng của tế bào nấm men trên tiêu bản vi sinh vật sống với kính hiển vi có độ phóng đại 40 lần.
Sau khi quan sát hình thái tế bào các chủng nấm men, đặc điểm hình thái của các chủng nấm men được thể hiện ở bảng 3.4:
Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men
STT Tên chủng Hình thái tế bào
1 Nấm men rượu
S. cerevisiae 7012
Hình cầu, hình trứng;
Có kích thước lớn nhất trong 4 chủng nấm men nghiên cứu; 2 Nấm men rượu S. cerevisiae 7028 Hình bầu dục, hình trứng; Kích thước nhỏ; 3 Nấm men S. boulardii CNCM I-745 Hình trứng, hình ô-van; Có kích thước nhỏ nhất trong bốn chủng nấm men;
4 Nấm men bia S.cerevisiae
SafAle BE-134
Hình bầu dục, hình trứng; Kích thước nhỏ;
57
3.2.2 Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành
Các chủng nấm men sau khi hoạt hóa 24h trong môi trường nhân giống cấp 1, được chuyển sang môi trường cấp 2; Sau đó tiến hành xác định mật độ tế bào tại các thời điểm 0h, 2h, 4h, 6h, …. để theo dõi tốc độ và khả năng sinh trưởng. Mật độ tế bào của các chủng nấm men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành được thể hiện ở hình 3.1:
Hình 3.1 Khả năng sinh trưởng của các chủng trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành theo thời gian
Từ hình 3.1 cho thấy, với cùng mật độ tế bào ban đầu như nhau, cả 4 chủng nấm men đều có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trong môi trường dịch thủy phân bã đậu nành. Mật độ tế bào nấm men đều tăng từ thời điểm 2 giờ đến thời điểm 16 giờ, sau đó mật độ tế bào giữ ổn định trong khoảng 14 giờ tiếp theo và sau giờ thứ 28 mật độ tế bào giảm dần.
Trong 4 chủng nấm men nghiên cứu với cùng điều kiện môi trường dịch thủy phân bã đậu nành, ta thấy chủng nấm men S. boulardii CNCM I-745 có tốc độ sinh trưởng nhanh và mật độ tế bào cao hơn các chủng còn lại. Từ giai đoạn cân bằng, mật độ tế bào nằm trong khoảng 5.107 - 6.107 CFU/ml. Như vậy, chủng nấm men S. boulardii CNCM I-745, là một probiotic có thể sinh trưởng, phát triển tốt và duy trì một lượng lớn tế bào trong dịch thủy phân bã đậu nành.
58 Đây là một ưu điểm rất có lợi cho mục đích sử dụng chủng để lên men dịch thủy phân bã đậu nành tạo đồ uống probiotic.
3.2.3 Kết quả nghiên cứu khả năng lên men của các chủng nấm men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu trên môi trường dịch thủy phân bã đậu
a. Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men dựa vào lượng CO2 thoát ra
Tiến hành lên men cùng điều kiện với 4 chủng nấm men và theo dõi khả năng lên men thông qua lượng CO2 thoát ra theo thời gian ở mỗi bình. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2:
Hình 3.2 Lượng CO2 thoát ra của các chủng nấm men theo thời gian lên men Từ hình 3.2, dựa vào lượng CO2 thoát ra cho thấy 4 chủng nấm men đều có khả năng lên men trên môi trường dịch thủy phân bã đậu nành. Lượng CO2 thoát ra tăng nhanh từ giờ thứ 4 đến giờ thứ 10 sau đó lượng CO2 thoát ra tăng chậm dần.
Khi so sánh về khả năng sinh trưởng chủng nấm men S. cerevisiae 7012 luôn có mật độ tế bào thấp nhất trong 4 chủng, nhưng bình được lên men bởi chủng này có lượng CO2 giải phóng ra cao ngang với hai chủng S. cerevisiae
7028, S. cerevisiae SafAle BE-134. Cho thấy chủng S. cerevisiae 7012 cũng có khả năng lên men tốt trên dịch thủy phân bã đậu nành.
59
b. So sánh khả năng lên men của các chủng nấm men dựa vào thành phần của dịch sau lên men
Bảng 3.5 Thành phần của dịch lên men sau 24 giờ bởi các chủng nấm men
Các chỉ tiêu của dịch sau lên men bởi các
chủng nấm men S. Boulardii CNCM I- 745 S. cerevisiae 7012 S. cerevisiae 7028 S. cerevisiae Safale Be-134 Hàm lượng đường khử còn lại, mg/100ml 646 ± 1,5 a 519 ± 1,3b 519 ± 2,9b 517 ± 4,6b Hàm lượng protein hòa tan, mg/100ml 455 ± 2,1 a 444 ± 3,8b 435 ± 3,2c 445 ± 4,9b
Hàm lượng axit amin và peptit mạch ngắn, mg/100ml 363 ± 2,6a 351 ± 4,9b 347 ± 6,4b 348 ± 6,3b Hàm lượng polyphenol, mg GAE/100ml 20,2 ± 0,09 19,9 ± 0,24 19,5 ± 0,11 19,7 ± 0,39 Độ chua, mg/100ml 560 ± 6,1 515 ± 20,0 518 ± 15,4 511 ± 6,13 pH của dịch 3,96 ±0,2 3,98 ± 0,2 3,96 ± 0,2 3,98 ± 0,2 Độ rượu, % v/v 1,06 1,18 1,15 1,15
Các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng cho biết sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)
Từ bảng 3.5, xét về hàm lượng protein hòa tan, axit amin, lượng đường khử, hàm lượng polyphenol thì dịch bã đậu nành sau lên men bởi chủng nấm men
S. boulardii CNCM I-745 có hàm lượng cao hơn các chủng còn lại.
Xét về độ rượu thì chủng nấm men S. boulardii CNCM I-745 cho dịch có độ rượu thấp nhất trong 4 chủng. Do đặc tính là chủng probiotic nên nấm men S. boulardii CNCM I-745 thiên về tăng mật độ tế bào, tạo sinh khối, sinh một số sản phẩm thứ cấp.
Đối với 3 chủng còn lại S. cerevisiae 7012, S. cerevisiae 7028 và S. cerevisiae SafAle BE-134 đều cho dịch lên men có hàm lượng protein hòa tan, axit amin, lượng đường khử, hàm lượng polyphenol tương đương nhau.
60 Bảng 3.6 Các thành phần khác của dịch trước và sau lên men 24 giờ
Chỉ tiêu của dịch
Trước lên men
Sau lên men
S. Boulardi i CNCM I-745 S. cerevisia e7012 S. cerevisia e7028 S. cerevisia eSafale Be-134 Hàm lượng isoflavone, mg/100ml 5,67 5,89 5,78 5,77 5,96 Tổng aglycone 4,77 5,88 5,75 5,73 5,93 Daidzein 0,94 1,25 1,23 1,22 1,27 Glycitein 0,29 0,48 0,45 0,48 0,46 Genistein 3,54 4,12 4,07 4,03 4,20 Hàm lượng chất có hoạt tính chống oxy hóa(mgVTMC/100m l) 0,60±0,0 4 1,03±0,0 2 0,95±0,0 1 0,83±0,0 2 1,00±0,0 2
Từ bảng 3.6, nhận thấy hàm lượng isoflavone của dịch sau lên men bởi cả 4 chủng đều tăng lên so với dịch trước khi lên men. Và hàm lượng isoflavone aglycone cũng tăng lên so với trước lên men. Điều này có thể do các chủng nấm men lên men được bã đậu, tiết ra β-glucosidase (Bhatia, Mishra, & Bisaria, 2002), và giúp chuyển đổi sinh học isoflavone glucoside trong bã đậu thành aglycones, và giúp tăng khả dụng sinh học của isoflavone.