2.1.Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
Địa điểm
Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện từ tháng 8 0 đến tháng 6/2017.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu 2.2.1. Nguyên liệu thực vật 2.2.1. Nguyên liệu thực vật
Tên, bộ phận sử dụng và nơi thu hái của 20 loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Tên 20 loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên khoa học
(tên Việt Nam)
Bộ phận
sử dụng Nơi thu hái
1 Achyranthes aspera L. (Cỏ xước) Lá, thân TP. HCM 2 Acorus calamus L. (Thủy xương ồ) Lá Kiên Giang 3 Bupleurum chinense DC (Sài hồ bắc) Rễ Bắc Giang 4 Carica papaya L. Đu đủ) Lá Long An
5 Gardenia jasminoides Ellis
(Dành dành)
Quả Đồng Nai 6 Glycyrrhiza uralensis Fisch
(Cam thảo bắc)
Thân Bắc Giang
(Xoài) 8 Momordica charantia L. Mướp đắng) Quả TP. HCM 9 Nephelium lappaceum L. (Chôm chôm) Lá Đồng Nai
10 Oroxylum indicum L. Kurz
(Núc nác)
Lá Đồng Nai
11 Oxalis corniculata L.
hua me đất)
Toàn cây TP. HCM 12 Pandanus tectorius Sol.
(Dứa dại)
Quả TP. HCM
13 Plantago major L.
Mã đề)
Toàn cây Đồng Nai
14 Perilla frutescens Britton.
(Tía tô)
Lá, thân Đồng Nai 15 Polycarpaea arenaria (Lour. ) Gagnep
(Sài hồ nam) Rễ Kiên Giang 16 Portulaca oleracea L. (Rau sam) Toàn cây TP. HCM 17 Psidium guajava L. (Ổi) Lá Đồng Nai
18 Polyscias fruticosa (L.) Harms.
Đinh lăng
Lá Kiên Giang 19 Typhonium trilobatum Shcott.
(Bán hạ)
Củ Kiên Giang 20 Wedelia chinensis (Osbeck) Merr
Sài đất)
Lá, thân TP. HCM
Achyranthes aspera Acorus calamus Bupleurum chinense Carica papaya
Gardenia jasminoides
Glycyrrhiza uralensis
Mangifera indica Momordica charantia
Nephelium lappaceum
Oroxylum indicum Oxalis corniculata Pandanus tectorius
Plantago major Perilla frutescens Polycarpaea arenaria
Psidium guajava Polyscias fruticosa Typhonium trilobatum
Wedelia chinensis
Hình 2.1. Hình ảnh 20 mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu 2.2.2. Đối tƣợng động vật 2.2.2. Đối tƣợng động vật
Chuột bạch đực giống swiss albino mice nặng 20-25g (6-8 tuần tuổi được cung cấp bởi Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Chuột được chia thành các nh m khác nhau và đã được cho ăn một tuần trong điều kiện tiêu chuẩn (70 - 80% độ ẩm tương đối và 12h chiếu sáng) cho thích nghi với điều kiện thử nghiệm.
Hình 2.2. Chuột bạch dùng cho thí nghiệm. 2.2.3. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm 2.2.3. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm:
Micropipet (100- 000 μl 0- 00 μl ; erlen 0 ml 00 ml ống nghiệm, efpendoff ml ; echer 00ml 0 ml 00 ml Đầu típ các loại đũa thủy tinh.
Hóa chất: tất cả các hóa chất đảm bảo độ tin cậy cho thí nghiệm:
- 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ) và thuốc thử Folin-Ciocalteau (Merck – Đức).
- Rutin, Acid Gallic và Streptozocin (Sigma Alrich - Mỹ).
- Vitamin C; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma Alrich – Mỹ). - NaCO3; AlCl3; FeCl3.6H2O; FeSO4.7H2O; H2SO4; HCl; D-glucose (Sharlau - Tây Ban Nha).
- Đệm phosphate pH= đệm citrate 0 M pH= ; đệm acetate 0,3M (pH=3,6).
- Dung môi dùng cho thí nghiệm: Ethanol (Việt Nam); Methanol (Xilong – Trung Quốc); Dimethyl sulfoxyde - DMSO (Xilong - Trung Quốc)
Thiết ị:
- Tủ sấy, tủ ấm (Memmert-Đức).
- Máy cô quay chân không (Heidolph-Đức). - Máy lọc chân không (Rocker-Đài Loan - Bình ngâm chiết mẫu.
- Máy đo quang phổ UV-Vis (Labomed-Mỹ). - Bể điều nhiệt (Memmert - Đức).
- Máy đo đường huyết Truetrack (Mỹ). - Cân phân tích (Orbital – Đức
- Máy ly tâm (Tuttligen – Đức
- Nồi hấp vô trùng Huxky – Đài loan
Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.
Sàng lọc trên mô hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính
Tạo mô hình chuột tiểu đường type
Thử nghiệm hoạt tính cao chiết trên mô hình in vivo chuột tiểu
đường type 20 mẫu thực vật
Bột thô
Rửa sạch, sấy ở t0 ≤ 00C, xay
3 lần
Định lượng polyphenol tổng số
Sàng lọc trên mô hình qu t gốc tự do PPH
ác mẫu cao chiết c hoạt tính chống oxy h a tốt
Sàng lọc trên mô chống oxy h a R P
Định lượng flavonoid tổng số Cao chiết ethanol
Tách chiết với ethanol 70%
Bã Cô quay chân không ở 500C
Thử nghiệm độc tính cấp diễn
Theo dõi và ghi nhận kết quả vào các ngày thứ
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu, tách chiết và thu nhận cao chiết
Mục đích: Tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau.
Nguyên tắc: Sử dụng dung môi thích hợp để tách chiết các hợp chất có trong các mẫu thực vật nhờ lực liên kết hóa học từ đ ta c thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu.
Xử lý mẫu: Các mẫu sau khi thu hái được rửa sạch sau đ sấy khô cẩn thận trong tủ sấy ở nhiệt độ không cao hơn 0° đến khi khối lượng không đổi và tiến hành xay thành bột thô. Bột được bảo quản trong túi polyethylen ở nơi khô ráo
Bột sẽ được ngâm để trích ly hợp chất với dung môi ethanol 70 % (tỉ lệ 1:20 w/v) trong 24 giờ và lặp lại 3 lần. Dịch chiết sẽ được loại bỏ dung môi để thu nhận cao chiết bằng cách cô quay chân không. Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 4oC.
2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa 2.3.2.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH 2.3.2.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH
Nguyên tắc: DPPH là một gốc tự do c ước sóng cực đại hấp thu tại nm và c màu tím ác chất c khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Thí nghiệm được tiến thành theo hương pháp của Von Gadow et al. (1997). Quy trình:
1Hình 2.5. Màu sắc của dung dịch DPPH chứa cao chiết có nồng độ từ cao → thấp.
Đánh giá khả năng kháng oxy h a thông qua I 50 là một giá trị nồng độ của mẫu mà tại đ n c thể ức chế 50% gốc tự do.
Dựng đƣờng chuẩn Vitamin C
- Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 (mg/ml).
- Dùng micropipet hút 50 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml dung dịch DPPH.
- Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở ước sóng λ= nm 0 mẫu cao chiết ethanol được
pha loãng với nồng độ thích hợp Hút 0 l mỗi nồng độ
ml PPH Ủ trong tối phút Đo ước s ng λ=517 nm
- Mẫu trắng: methanol tinh khiết
- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định.
- Mẫu Vitamin được dùng để so sánh giá trị IC50.
Tính toán kết quả
Dựa theo Yen và Duh (1994), giá trị IC50 được tính toán như sau: Phần trăm ức chế (%I) = (
)x100% Trong đ :
ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch PPH an đầu pha trong methanol. ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu).
Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn: y = ax+b theo công thức
2.3.2.2. Mô hình FRAP
Phương pháp này dựa vào sự khử phức Fe(III)–TPTZ thành phức Fe(II)– TPTZ bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxi hoá) ở pH thâ p. Fe(II) – TPTZ có màu xanh dương đâ m và có thể đo mâ t độ quang (A) ở bước sóng 595nm.
Như vâ y, sau phản ứng nếu Fe2+-TPTZ sinh ra càng nhiều màu của dung dịch càng đậm và ngươ c lại Từ đ có thể suy ra hoạt lực của chất chống oxy hóa.
Hoạt lực của chất chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị FRAP xác định từ đường chuẩn. Giá trị FRAP càng lớn, chất chống oxi hoá càng mạnh và ngược lại Phương pháp này được thực hiện như mô tả của Benzie và Strain (1996). Quy trình:
Thuốc thử:
- Đệm acetate 0,3M ( pH= 3,6 )
- 0,01M 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ) trong HCl 0,04M - 0,02M FeCl3.6H2O trong nước cất
Tiến hành phân tích:
Thực hiện phản ứng và đo độ hấp thụ trên máy quang phổ UV như sau: – Mẫu trắng: thuốc thử FRAP
– Mẫu đo: 1,5 ml thuốc thử FRAP + 50µl mẫu, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thu ở λmax = 595nm.
Đường chuẩn:
– Đường chuẩn sử du ng FeSO4.7H2O pha thành các nồng độ 1000, 800, 600, 400, 200, 100 µM.
– Tương ứng với mỗi nồng độ Fe2+, cho phản ứng với thuốc thử FRAP và đo độ hâ p thu. Tất cả các mẫu đươ c thực hiện 3 lần.
2.3.3. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số
pha loãng với nồng độ thích hợp Hút 0 l mỗi nồng độ
ml thuốc thử R P Ủ 30 phút ở t0 phòng Đo ước s ng λ=59 nm
2.3.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số
Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử
Folin-Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở ước sóng λ=760 nm, hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid gallic.
Xây dựng đường chuẩn acid gallic:
- Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,12; 0,14; 0,16 mg/ml.
- Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteau theo phương pháp của Waterhouse (2002), tham khảo thêm TCVN 9745-1:2013. Cho 1 ml dung dịch tác dụng với 5ml thuốc thử Folin–Ciocalteu 10% và lắc đều, sau 5 phút bổ sung thêm 4 ml Na2CO3 7,5% và ủ 30 phút ở 40oC. Mật độ quang của các mẫu được đo tại ước sóng 760 nm.
- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn), hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn acid gallic.
2.3.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid tổng số
Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi
phản ứng với AlCl3 tại ước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng (theo phương pháp của Woisky và Salatino, 1998).
Dựng đường chuẩn Rutin
- Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 96% theo dãy nồng độ: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 (mg/ml)
- Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch. - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Mật độ quang của các mẫu được đo ở ước s ng λ = 20 nm.
- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi
làm thí nghiệm như trên hàm lượng flavonoid được tính toán dựa theo đường chuẩn Rutin.
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết 2.3.4.1. Xác định độc tính cấp 2.3.4.1. Xác định độc tính cấp
Thử nghiệm xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành và tham khảo phương pháp liều cố định hướng dẫn trong OECD số 425. Cao chiết được pha ở nồng độ cao nhất có thể pha loãng nhằm khảo sát độc tính cấp. Chuột bạch đực được chia thành nhiều nh m tương tự nhau, mỗi con ở cùng nhóm sẽ nhận cùng một liều khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết của chuột trong mỗi nhóm. Sau khi cho chuột uống thuốc với liều duy nhất trong ngày, quan sát hành vi, thể trạng của chuột sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ.
Để thăm dò liều đối với mỗi cao chiết, liều dùng 6 con chuột, mỗi con có trọng lượng 20–25g, cho uống liều duy nhất trong ngày với thể tích thuốc tối đa chuột có thể nhận được là 0,2 ml/10 gam thể trọng/lần ngày quy định cho chuột nhắt đây là liều thực hiện cho lượng cao chiết tối đa c thể hòa tan được trong 0,2 ml nước cất và chất trợ tan Đỗ Trung Đàm 003
Hình 2.6. Nhóm thử nghiệm gồm 6 con chuột
trong ngày Nh m đối chứng chuột được cho uống nước cất Sau đ ghi nhận kết quả.
2.3.4.2. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột tăng đƣờng huyết cấp tính
Các mẫu cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa tốt trên 2 mô hình DPPH và FRAP sẽ được tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết cấp tính. Thực hiện như mô tả bởi Rahman et al. 0 như sơ đồ mô tả sau đây:
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường
huyết cấp tính. Thuyết minh sơ đồ:
Chuột được chia thành 15 nhóm (6 con mỗi nhóm):
- Nhóm 1 (nhóm chứng trắng) chuột được cho uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 2 (chuột tăng đường huyết) chuột được uống DMSO 1% và đường với
2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 3 (nhóm chứng sinh học) chuột được uống thuốc với thành phần glibenclamide (10 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
MSO % trong nước cất
huột ạch
Glucose g kg-
Đo đường huyết sau h Gli enclamide 0 mg kg- ao chiết ethanol ở các nồng độ Nh m Nh m Nh m 3 Nh m -
- Nhóm 4 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 100 mg.kg-1
thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 5 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 6 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 200 mg/kg thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 7 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá chôm chôm ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 8 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
chôm chôm ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 9 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
chôm chôm ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 10 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi
ở liều 100 mg.kg-1
thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 11 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi ở liều 150 mg.kg-1
thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 12 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng
- Nhóm 13 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá núc nác ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 14 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
núc nác ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 15 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
núc nác ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
Các mẫu máu được thu nhận sau khi uống glucose một giờ và lượng đường trong máu được đo ngay lập tức bằng phương pháp glucose oxidase với máy đo đường huyết (Venkatesh et al., 2004).
Hình 2.8. Chuột được cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng
2.3.4.3. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột gây tiểu đƣờng bởi streptozocin
Tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1 theo mô tả của Kenneth et al. (2008) và tham khảo mô hình của Nguyễn Trung Quân (2009).
Hình 2.9. Sơ đồ tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1.
Tiêm đệm citrate 0 M lạnh pH =
huột ạch
Uống glucose % trong 3 ngày huột tiểu đường type
Tiêm STZ hòa tan trong đệm citrate liều 0 mg kg-
Nh m Nh m
Thuyết minh sơ đồ:
Tạo mô hình chuột tiểu đường type 1: chuột được gây bệnh tiểu đường bằng