Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa

2.1 .Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa

2.3.2.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH

 Nguyên tắc: DPPH là một gốc tự do c ước sóng cực đại hấp thu tại nm và c màu tím ác chất c khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt.

Thí nghiệm được tiến thành theo hương pháp của Von Gadow et al. (1997). Quy trình:

1Hình 2.5. Màu sắc của dung dịch DPPH chứa cao chiết có nồng độ từ cao → thấp.

Đánh giá khả năng kháng oxy h a thông qua I 50 là một giá trị nồng độ của mẫu mà tại đ n c thể ức chế 50% gốc tự do.

 Dựng đƣờng chuẩn Vitamin C

- Pha dung dịch vitamin C theo các nồng độ sau: 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 (mg/ml).

- Dùng micropipet hút 50 mỗi nồng độ vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 ml dung dịch DPPH.

- Ủ trong tối 15 phút ở nhiệt độ phòng. So màu ở ước sóng λ= nm 0 mẫu cao chiết ethanol được

pha loãng với nồng độ thích hợp Hút 0 l mỗi nồng độ

ml PPH Ủ trong tối phút Đo ước s ng λ=517 nm

- Mẫu trắng: methanol tinh khiết

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên Kết quả được đánh giá thông qua giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định.

- Mẫu Vitamin được dùng để so sánh giá trị IC50.

 Tính toán kết quả

Dựa theo Yen và Duh (1994), giá trị IC50 được tính toán như sau: Phần trăm ức chế (%I) = (

)x100% Trong đ :

ADPPH là giá trị OD517nm của dung dịch PPH an đầu pha trong methanol. ATN là giá trị OD517nm của dung dịch chuẩn (hoặc dung dịch mẫu).

Giá trị IC50 được tính toán dựa theo đường chuẩn: y = ax+b theo công thức

2.3.2.2. Mô hình FRAP

Phương pháp này dựa vào sự khử phức Fe(III)–TPTZ thành phức Fe(II)– TPTZ bền hơn bằng một chất khử (chất chống oxi hoá) ở pH thâ p. Fe(II) – TPTZ có màu xanh dương đâ m và có thể đo mâ t độ quang (A) ở bước sóng 595nm.

Như vâ y, sau phản ứng nếu Fe2+-TPTZ sinh ra càng nhiều màu của dung dịch càng đậm và ngươ c lại Từ đ có thể suy ra hoạt lực của chất chống oxy hóa.

Hoạt lực của chất chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị FRAP xác định từ đường chuẩn. Giá trị FRAP càng lớn, chất chống oxi hoá càng mạnh và ngược lại Phương pháp này được thực hiện như mô tả của Benzie và Strain (1996). Quy trình:

Thuốc thử:

- Đệm acetate 0,3M ( pH= 3,6 )

- 0,01M 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ) trong HCl 0,04M - 0,02M FeCl3.6H2O trong nước cất

Tiến hành phân tích:

Thực hiện phản ứng và đo độ hấp thụ trên máy quang phổ UV như sau: – Mẫu trắng: thuốc thử FRAP

– Mẫu đo: 1,5 ml thuốc thử FRAP + 50µl mẫu, ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp thu ở λmax = 595nm.

Đường chuẩn:

– Đường chuẩn sử du ng FeSO4.7H2O pha thành các nồng độ 1000, 800, 600, 400, 200, 100 µM.

– Tương ứng với mỗi nồng độ Fe2+, cho phản ứng với thuốc thử FRAP và đo độ hâ p thu. Tất cả các mẫu đươ c thực hiện 3 lần.

2.3.3. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số

pha loãng với nồng độ thích hợp Hút 0 l mỗi nồng độ

ml thuốc thử R P Ủ 30 phút ở t0 phòng Đo ước s ng λ=59 nm

2.3.3.1. Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol tổng số

 Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử

Folin-Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở ước sóng λ=760 nm, hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid gallic.

 Xây dựng đường chuẩn acid gallic:

- Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,12; 0,14; 0,16 mg/ml.

- Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteau theo phương pháp của Waterhouse (2002), tham khảo thêm TCVN 9745-1:2013. Cho 1 ml dung dịch tác dụng với 5ml thuốc thử Folin–Ciocalteu 10% và lắc đều, sau 5 phút bổ sung thêm 4 ml Na2CO3 7,5% và ủ 30 phút ở 40oC. Mật độ quang của các mẫu được đo tại ước sóng 760 nm.

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn), hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn acid gallic.

2.3.3.2. Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid tổng số

 Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi

phản ứng với AlCl3 tại ước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng (theo phương pháp của Woisky và Salatino, 1998).

 Dựng đường chuẩn Rutin

- Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 96% theo dãy nồng độ: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 (mg/ml)

- Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch. - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%.

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Mật độ quang của các mẫu được đo ở ước s ng λ = 20 nm.

- Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi

làm thí nghiệm như trên hàm lượng flavonoid được tính toán dựa theo đường chuẩn Rutin.

2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết 2.3.4.1. Xác định độc tính cấp 2.3.4.1. Xác định độc tính cấp

Thử nghiệm xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành và tham khảo phương pháp liều cố định hướng dẫn trong OECD số 425. Cao chiết được pha ở nồng độ cao nhất có thể pha loãng nhằm khảo sát độc tính cấp. Chuột bạch đực được chia thành nhiều nh m tương tự nhau, mỗi con ở cùng nhóm sẽ nhận cùng một liều khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết của chuột trong mỗi nhóm. Sau khi cho chuột uống thuốc với liều duy nhất trong ngày, quan sát hành vi, thể trạng của chuột sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ.

Để thăm dò liều đối với mỗi cao chiết, liều dùng 6 con chuột, mỗi con có trọng lượng 20–25g, cho uống liều duy nhất trong ngày với thể tích thuốc tối đa chuột có thể nhận được là 0,2 ml/10 gam thể trọng/lần ngày quy định cho chuột nhắt đây là liều thực hiện cho lượng cao chiết tối đa c thể hòa tan được trong 0,2 ml nước cất và chất trợ tan Đỗ Trung Đàm 003

Hình 2.6. Nhóm thử nghiệm gồm 6 con chuột

trong ngày Nh m đối chứng chuột được cho uống nước cất Sau đ ghi nhận kết quả.

2.3.4.2. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột tăng đƣờng huyết cấp tính

Các mẫu cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa tốt trên 2 mô hình DPPH và FRAP sẽ được tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết cấp tính. Thực hiện như mô tả bởi Rahman et al. 0 như sơ đồ mô tả sau đây:

Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường

huyết cấp tính. Thuyết minh sơ đồ:

Chuột được chia thành 15 nhóm (6 con mỗi nhóm):

- Nhóm 1 (nhóm chứng trắng) chuột được cho uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 2 (chuột tăng đường huyết) chuột được uống DMSO 1% và đường với

2g glucose/kg thể trọng.

- Nhóm 3 (nhóm chứng sinh học) chuột được uống thuốc với thành phần glibenclamide (10 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

MSO % trong nước cất

huột ạch

Glucose g kg-

Đo đường huyết sau h Gli enclamide 0 mg kg- ao chiết ethanol ở các nồng độ Nh m Nh m Nh m 3 Nh m -

- Nhóm 4 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 100 mg.kg-1

thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

- Nhóm 5 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

- Nhóm 6 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 200 mg/kg thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

- Nhóm 7 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá chôm chôm ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 8 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá

chôm chôm ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 9 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá

chôm chôm ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 10 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi

ở liều 100 mg.kg-1

thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

- Nhóm 11 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi ở liều 150 mg.kg-1

thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

- Nhóm 12 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng

- Nhóm 13 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá núc nác ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 14 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá

núc nác ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 15 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá

núc nác ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.

Các mẫu máu được thu nhận sau khi uống glucose một giờ và lượng đường trong máu được đo ngay lập tức bằng phương pháp glucose oxidase với máy đo đường huyết (Venkatesh et al., 2004).

Hình 2.8. Chuột được cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng

2.3.4.3. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột gây tiểu đƣờng bởi streptozocin

Tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1 theo mô tả của Kenneth et al. (2008) và tham khảo mô hình của Nguyễn Trung Quân (2009).

Hình 2.9. Sơ đồ tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1.

Tiêm đệm citrate 0 M lạnh pH =

huột ạch

Uống glucose % trong 3 ngày huột tiểu đường type

Tiêm STZ hòa tan trong đệm citrate liều 0 mg kg-

Nh m Nh m

Thuyết minh sơ đồ:

Tạo mô hình chuột tiểu đường type 1: chuột được gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc bụng chuột liều duy nhất 150 mg.kg-1 streptozocin STZ được hòa tan trong đệm citrate 0.1M lạnh pH ; sau khi tiêm nước cho chuột uống được thay thế bằng dung dịch glucose % Nh m đối chứng chuột chỉ được tiêm đệm citrate. Sau 3 ngày tiêm STZ, chuột có nồng độ glucose máu lúc đ i trên mmol L được coi là tiểu đường và đưa vào nghiên cứu.

Hình 2.10. Chuột được tiêm STZ vào phúc mạc bụng.

Sau khi tạo mô hình chuột tiểu đường type 1 thành công, tiến hành với số lượng lớn để thử nghiệm hoạt tính chống tăng đường huyết của các mẫu cao chiết trên chuột đã gây tiểu đường được chọn, thực hiện như mô tả bởi Rucha et al.

Hình 2.11. Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính của mẫu trên chuột tiểu đường type 1.

Thuyết minh sơ đồ:

Các con chuột được phân thành 5 nhóm (6 con mỗi nh m và được tiến hành như sau:

- Nhóm 1: Chuột ình thường uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 2: Chuột bệnh tiểu đường uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 3: Chuột bệnh tiểu đường uống glibenclamide (10 mg.kg-1). - Nhóm 4: Chuột bệnh tiểu đường uống cao chiết ethanol lá ổi liều 100

mg.kg-1.

- Nhóm 5: Chuột bệnh tiểu đường uống cao chiết ethanol lá chôm chôm liều 100 mg.kg-1. huột ình thường Nh m Nh m huột tiểu đường Nh m Nh m 3 Nh m MSO % trong nước cất

Uống mỗi ngày trong ngày

Đo đường huyết lúc đ i vào uổi sáng các ngày thứ Gli enclamide 0 mg kg- ao chiết ethanol ổi 00 mg kg- ao chiết ethanol chôm chôm 00 mg kg-

Hình 2.12. Chuột được cho uống cao chiết.

Mỗi nh m được cho cho uống như mô tả đều đặn mỗi ngày trong ngày đo lượng đường trong máu đều đặn mỗi tuần 1 lần, chuột được cho nhịn ăn cả đêm trước khi đo

2.3.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng glucose trong máu

Định lượng glucose trong máu bằng kỹ thuật enzyme. Glucoseoxidase bị oxy hóa nhờ sự xúc tác của các enzyme có trên bề mặt của vùng phản ứng que thử và đọc kết quả trên máy Truetrack do hãng Trividia Health sản xuất.

Nguyên lý hoạt động

Enzyme glucoseoxidase xúc tác quá trình oxy h a β-D-glucose thành - gluconic acid α- -glucose trong máu nhanh ch ng chuyển sang dạng β vì vậy tất cả glucose đều được đo trong cùng một thời điểm ảm biến sinh học enzyme glucose sử dụng một điện cực thay O2 tác động lên lượng glucose khử. Trong phản ứng mở vòng dưới tác dụng của enzyme glucoseoxidase và điện cực trong que thử làm mất các electron cần thiết, nhóm aldehyde ở C1 bị chuyển thành acid acid- - gluconic và hình thành H2O2 òng điện tử được tạo ra tương ứng với nồng độ glucose trong máu.

Phương pháp tiến hành

Máy Truetrack đo lượng đường glucose trong máu toàn phần Máu được thấm vào đầu trên của que thử và tự động hút vào vùng đo nơi phản ứng xảy ra.

- Gắn một que thử để bật máy.

- Tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là l phải là một máu tròn đầy. Thấm nhẹ giọt máu vào điểm nhận máu trên đầu que thử. Sau 5 giây kết quả sẽ hiện thị trên màn hình.

2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Kết quả được thể hiện dưới dạng trung bình  SD. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 0 0 và phân tích phương sai NOV ằng SAS 9.4.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa

3.1.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH

Phương pháp qu t gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này được dùng phổ iến vì đơn giản nhanh ch ng và ổn định. DPPH là một gốc tự do c ước sóng cực đại hấp thu tại nm và c màu tím ác chất c khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt

Hiệu quả quét gốc tự do của dịch chiết ethanol của 20 mẫu cây trong thử nghiệm loa i gốc DPPH được trình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của 20 mẫu cây STT Mẫu % ức chế DPPH 1 Achyranthes aspera 22,13  1,23 2 Acorus calamus 22,45  1,48 3 Bupleurum chinense 15,07  0,50 4 Carica papaya 19,94  1,23 5 Gardenia jasminoides 35,19  0,95 6 Glycyrrhiza uralensis 67,79  3,07 7 Mangifera indica 83,78  2,88 8 Momordica charantia 42,33  0,62 9 Nephelium lappaceum 94,02  0,56 10 Oroxylum indicum 92,30  2,19 11 Oxalis corniculata 38,87  1,35 12 Pandanus tectorius 25,12  0,91 13 Plantago major 48,73  2,23 14 Perilla frutescens 42,79  2,11 15 Polycarpaea arenaria 50,24  0,96 16 Portulaca oleracea 23,42  0,80 17 Psidium guajava 93,23  0,64 18 Polyscias fruticosa 26,17  0,90 19 Typhonium trilobatum 40,31  0,24 20 Wedelia chinensis 34,68  1,15

Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết phân bố trong một phạm vi rộng, từ 0 % đến 94,02% tại nồng độ 1mg/ml của các mẫu