Kết quả được thể hiện dưới dạng trung bình SD. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 0 0 và phân tích phương sai NOV ằng SAS 9.4.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa
3.1.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH
Phương pháp qu t gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này được dùng phổ iến vì đơn giản nhanh ch ng và ổn định. DPPH là một gốc tự do c ước sóng cực đại hấp thu tại nm và c màu tím ác chất c khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt
Hiệu quả quét gốc tự do của dịch chiết ethanol của 20 mẫu cây trong thử nghiệm loa i gốc DPPH được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của 20 mẫu cây STT Mẫu % ức chế DPPH 1 Achyranthes aspera 22,13 1,23 2 Acorus calamus 22,45 1,48 3 Bupleurum chinense 15,07 0,50 4 Carica papaya 19,94 1,23 5 Gardenia jasminoides 35,19 0,95 6 Glycyrrhiza uralensis 67,79 3,07 7 Mangifera indica 83,78 2,88 8 Momordica charantia 42,33 0,62 9 Nephelium lappaceum 94,02 0,56 10 Oroxylum indicum 92,30 2,19 11 Oxalis corniculata 38,87 1,35 12 Pandanus tectorius 25,12 0,91 13 Plantago major 48,73 2,23 14 Perilla frutescens 42,79 2,11 15 Polycarpaea arenaria 50,24 0,96 16 Portulaca oleracea 23,42 0,80 17 Psidium guajava 93,23 0,64 18 Polyscias fruticosa 26,17 0,90 19 Typhonium trilobatum 40,31 0,24 20 Wedelia chinensis 34,68 1,15
Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết phân bố trong một phạm vi rộng, từ 0 % đến 94,02% tại nồng độ 1mg/ml của các mẫu cao chiết Trong đ c mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do PPH dưới 50% và 6 mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên 50% là Glycyrrhiza uralensis (cam
thảo bắc), Mangifera indica (xoài), Nephelium lappaceum (chôm chôm), Oroxylum
indicum (núc nác), Polycarpaea arenaria (sài hồ nam), Psidium guajava (ổi).
Kết quả thử nghiệm cho thấy hoạt tính loại gốc tự do ở nồng độ mg ml của mẫu lá Nephelium lappaceum (chôm chôm), Psidium guajava (ổi), Oroxylum indicum núc nác rất mạnh với giá trị % ức chế DPPH lần lượt là 94,02 0,56; 93,23 0,64; 92,30 2,19 gần bằng với giá trị của chất đối chứng ascorbic acid (vitamin C) là 94,40 0,95 và mẫu lá Mangifera indica (xoài) với 83,78 2,88 % ức chế DPPH.
Nghiên cứu trước đây của Nont Thitilertdecha et al. (2010) về khả năng chống oxy hóa của các hợp chất cô lập được từ vỏ quả chôm chôm là ellagic acid (EA), corilagin và geraniin cho thấy rằng so với chất chống oxy hoá tổng hợp (BHT), 3 hợp chất này có khả năng ắt gốc tự do PPH đáng kể Đây là tất cả các hợp chất chống oxy hóa mạnh bởi chúng có một số lượng lớn các nh m hydroxyl và đặc biệt là nhiều nhóm ortho-dihydroxy. Ba hợp chất polyphenol này được xác định là có các đặc tính bắt các ROS mạnh khác nhau cho anion superoxide (O2-), gốc hydroxyl (-OH) và gốc peroxyl (ROO-). Cao chiết ethanol từ lá chôm chôm có hoạt tính chống oxy hóa mạnh cũng c thể cùng lý do trên.
Bốn mẫu cao chiết có hoạt tính quét gốc tự do DPPH tốt tiếp tục được xác định giá trị IC50 với acid ascorbic (vitamin C) là đối chứng. Giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định.
Hình 3.1. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH ở nồng độ 1mg/ml của dịch chiết ethanol
từ 4 mẫu CC: chôm chôm, XO: xoài, OI: ổi, NN: núc nác so sánh với AA: ascorbic acid.
Để xác định chỉ số IC50, mỗi cao chiết được pha thành 6 nồng độ 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml và 0,03125 mg/ml tương ứng với các nồng độ cuối của mẫu trong hỗn hợp phản ứng là 24,3902 µg/ml; 12,1951 µg/ml; 6,0975 µg/ml; 3,0488 µg/ml; 1,5244 µg/ml và 0,7622 µg/ml. Sau đ hoạt tính ức chế DPPH ở mỗi nồng độ đươ c xác định và c được đường chuẩn tương ứng với mỗi mẫu. Từ đ kết quả xác định IC50 của các dịch chiết so với Vitamin C được trình bày ở hình 3.2, giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ khả năng chống oxy hóa càng mạnh. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CC XO OI NN AA % ức chế PPH Mẫu %
Hình 3.2. Hoạt tính loại gốc tự do thông qua giá trị IC50 của dịch chiết ethanol từ 4 mẫu CC: chôm chôm, XO: xoài, OI: ổi, NN: núc nác so sánh với AA: ascorbic acid.
IC50 của dịch chiết ethanol từ 4 mẫu lá chôm chôm, xoài, ổi, núc nác lần lượt là 6,85 µg/ml, 10,46 µg/ml, 4,14 µg/ml và 4,34 µg/ml có sự khác biệt so với hoạt tính chống oxy h a của vitamin I 50= 2,73µg/ml).
Giá trị IC50 của cao chiết ethanol từ lá xoài trong nghiên cứu này không có sự khác biệt đáng kể so với nghiên cứu trước đây của Mohan et al. (2013). Nghiên cứu trước đây cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết methanol, ethyl acetat và n-butanol từ lá xoài với giá trị IC50 lần lượt là 13,37; 3,55 và 14,19 µg / mL và so sánh với chất đối chứng acid gallic với giá trị IC50 là 1,88 µg / mL.
3.1.2. Mô hình FRAP
Phương pháp này dựa vào sự khử phức Fe(III)–TPTZ thành phức Fe(II)– TPTZ bền hơn ằng một chất khử chất chống oxi hoá) ở pH thấp e II – TPTZ c màu xanh dương đậm Như vậy sau phản ứng nếu Fe2+-TPTZ sinh ra càng nhiều màu của dung dịch càng đậm và ngược lại Từ đ c thể suy ra hoạt lực của chất chống oxy hóa.
Hoạt lực của chất chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị FRAP xác định từ đường chuẩn. Giá trị FRAP càng lớn chất chống oxi hoá càng mạnh
0 2 4 6 8 10 12 CC XO OI NN AA IC50(µg/ml) Mẫu %
Hình 3.3. Đường chuẩn Fe2+-TPTZ
Từ độ hấp thu của mẫu đo được dựa vào đường chuẩn Fe2+-TPTZ đã lập tính được giá trị FRAP của 20 mẫu dịch chiết ethanol. Giá trị FRAP tính cho nồng độ mg ml của dịch chiết trước phản ứng.
Dịch chiết ethanol của 0 mẫu cây trước khi đem phản ứng được pha loãng ở nồng độ sao cho phản ứng cho kết quả đo độ hấp thu nằm trong đường chuẩn. Trong thí nghiệm này dịch chiết ethanol của 20 mẫu cây được chọn ở nồng độ 0 mg ml do c tác dụng mạnh Khả năng chống oxy hóa qua mô hình FRAP của 20 mẫu được thể hiện trong bảng 3.2 và Hình 3.4
y = 0.0005x + 0.0215 R² = 0.997 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0 200 400 600 800 1000 1200
Bảng 3.2. Khả năng chống oxy hóa thông qua mô hình FRAP của 20 mẫu cây STT Mẫu µmol Fe2+/L 1 Achyranthes aspera 1062 12 2 Acorus calamus 1126 7 3 Bupleurum chinense 1230 23 4 Carica papaya 1174 12 5 Gardenia jasminoides 1502 6 6 Glycyrrhiza uralensis 932 5 7 Mangifera indica 4259 40 8 Momordica charantia 983 14 9 Nephelium lappaceum 6428 74 10 Oroxylum indicum 5495 50 11 Oxalis corniculata 1025 30 12 Pandanus tectorius 1032 17 13 Plantago major 1078 15 14 Perilla frutescens 1264 21 15 Polycarpaea arenaria 1073 25 16 Portulaca oleracea 1001 12 17 Psidium guajava 5794 42 18 Polyscias fruticosa 1263 36 19 Typhonium trilobatum 1542 18 20 Wedelia chinensis 1266 12
Từ bảng 3.2 cho thấy có một sự khác biệt lớn lên đến 6,90 lần) trong khả năng chống oxy hóa FRAP giữa các mẫu. Khả năng chống oxy hóa của các mẫu khác nhau dao động từ 93 đến 6428 µmol Fe2+/L. Trong đ mẫu có hoạt tính tốt là: chôm chôm, ổi, núc nác, xoài với chôm chôm(Nephelium lappaceum) là mẫu có
hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình FRAP tốt nhất với giá trị 6428 74 µmol Fe2+/L của 1mg/ml mẫu bằng 0,56 lần so với đối chứng là ascorbic acid với giá trị 11390 ± 98 μmol Fe2+/L. Kế đến là mẫu dịch chiết ethanol từ lá ổi (Psidium
guajava) và núc nác (Oroxylum indicum) có giá trị tương đương nhau lần lượt là
5794 42 và 5495 50 µmol Fe2+/L. Cuối cùng là dịch chiết ethanol từ lá xoài (Mangifera indica) có giá trị là 4259 40 µmol Fe2+/L. Giá trị FRAP cảu 4 mẫu kể trên có sự chênh lệch khá lớn so với các mẫu cao chiết còn lại dao động từ 93 đến 1502 µmol Fe2+/L).
Hình 3.4. Khả năng chống oxy hóa in vitro trên mô hình FRAP của 4 mẫu có hoạt
tính tốt nhất là CC: chôm chôm, XO: xoài, OI: ổi, NN: núc nác so sánh với AA: ascorbic acid.
Nói chung, các hợp chất chống oxy h a và cơ chế tác động của chúng rất phức tạp và không chỉ có duy nhất một phương pháp xác định khả năng chống oxy hóa của mẫu mà cần có một sự kết hợp của những phương pháp khác nhau Trong nghiên cứu này hai phương pháp được sử dụng đều xảy ra trong dung môi phân cực nên thích hợp cho việc đánh giá các cao chiết ethanol phân cực của các mẫu để chứng minh khả năng chống oxy hóa. Một số cao chiết có khả năng chống oxy hóa khác nhau trong từng phương pháp
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 CC XO OI NN AA µmol Fe2+/L Mẫu
3.2. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số
Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro trên 2 mô hình quét gốc tự do DPPH và FRAP của 20 mẫu thực vật cho thấy 4 mẫu cao chiết ethanol từ lá của 4 cây Nephelium lappaceum (chôm chôm), Psidium guajava (ổi), Oroxylum indicum (núc nác) và Mangifera indica (xoài) có hoạt tính tốt nên 4 mẫu này được
tiếp tục định lượng polyphenol tổng số và flavonoid tổng số.
3.2.1. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số
Để xác định hàm lượng polyphenol tổng số của các mẫu cao chiết, cần lập đường chuẩn acid gallic như sau:
- Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,12; 0,14; 0,16 mg/ml.
- Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin–Ciocalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. Cho 1 ml dung dịch tác dụng với 5ml thuốc thử Folin–Ciocalteu 10% và lắc đều, sau 5 phút bổ sung thêm 4 ml Na2CO3 7,5% và ủ 30 phút ở 40oC. Mật độ quang của các mẫu được đo tại ước sóng 760 nm.
Hình 3.5. Đường chuẩn acid gallic.
y = 5.6232x - 0.014 R² = 0.9973 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 OD
Dựa vào đường chuẩn acid gallic, kết hợp độ hấp thụ của mẫu ta tính được hàm lượng polyphenol tổng số, kết quả được trình bình trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol tổng số của 4 cây có hoạt tính chống oxy hóa cao
nhất Mẫu Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g trọng lƣợng khô) Mangifera indica 104,67 7,02 Nephelium lappaceum 168,73 8,45 Psidium guajava 150,47 6,49 Oroxylum indicum 77,81 0,04
GAE gallic acid equivalent : đương lượng gallic acid.
Kết quả phân tích trong bảng 3.3 cho thấy cao chiết ethanol của từ lá cây
Nephelium lappaceum (chôm chôm) chứa hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất 168,73 8,45 mg GAE/g trọng lượng khô điều này phù hợp khả năng chống oxy hóa cao ở 2 mô hình DPPH và FRAP của mẫu cây này. Nghiên cứu của Josephine
et al. (2015) về tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học - geranin, một hợp chất
polyphenol từ vỏ chôm chôm cho thấy tổng hàm lượng polyphenol cao nhất được tìm thấy trong quả chôm chôm.
Kế đến là cao chiết ethanol của từ lá cây Psidium guajava (ổi) chứa hàm lượng polyphenol tổng số là 150,47 6,49 mg GAE/g trọng lượng khô. Kết quả này tốt hơn so với nghiên cứu của Alothman et al. (2009) cho kết quả hàm lượng
polyphenol tổng của cao chiết ethanol từ quả ổi là 157 6,18 mg GAE/g trọng lượng tươi.
3.2.2. Kết quả định lƣợng flavonoid tổng số
Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3 tại ước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng
- Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 96% theo dãy nồng độ: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 (mg/ml)
- Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch. - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Mật độ quang của các mẫu được đo ở ước s ng λ = 0 nm
Hình 3.6 Đường chuẩn rutin
Dựa vào đường chuẩn rutin, kết hợp độ hấp thụ của mẫu ta tính được hàm lượng flavonoid tổng số, kết quả được trình bình trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của 4 cây có hoạt tính chống oxy hóa cao
tốt nhất Mẫu Hàm lƣợng flavonoid tổng số (mg RE/g trọng lƣợng khô) Mangifera indica 82,33 9,61 Nephelium lappaceum 74,45 0,81 Psidium guajava 97,45 1,03 Oroxylum indicum 49,74 0,06 RE rutin equivalent : đương lượng rutin.
y = 18.59x + 0.0007 R² = 0.9997 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060
Kết quả phân tích trong bảng 3.4 cho thấy cao chiết ethanol của từ lá cây
Psidium guajava (ổi) chứa hàm lượng flavonoid tổng số cao nhất là 97,45 1,03 mg RE/g trọng lượng khô. Kế đến là Mangifera indica (xoài) với hàm lượng là 82,33
9,61 mg RE/g trọng lượng khô, mặc dù cao chiết này c hàm lượng polyphenol tổng số thấp hơn cao chiết ethanol từ lá chôm chôm.
Kết quả cho thấy thành phần polyphenol và flavonoid tổng số tương đối phù hợp với khả năng chống oxy hóa cao ở hai phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ở trên. Các hợp chất polyphenol là những thành phần quan trọng để ngăn ngừa chống lại stress oxy hóa và có khả năng chống tăng đường huyết,...
3.3. Kết quả đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết 3.3.1. Xác định độc tính cấp 3.3.1. Xác định độc tính cấp
Trước khi thực hiện các thử nghiệm trên chuột, phải tiến hành kiểm tra độc tính cấp của cao chiết để xác định độ an toàn của cao chiết. Kết quả khảo sát độc tính cấp của cao chiết ethanol từ 4 mẫu sau thời gian thử nghiệm 120 giờ.
Quan sát hành vi của chuột của 4 nhóm thử cao chiết sau thời gian thử nghiệm, thấy rằng về hình dáng bên ngoài, màu sắc lông chuột không bị thay đổi và không có dấu hiệu của sự rụng lông. Về hoạt động của chúng diễn ra ình thường sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ theo dõi. Về hoạt động ăn uống, bài tiết, chuột vẫn ăn uống, bài tiết và tăng cân ình thường. Không thấy xuất hiện phân lỏng và cũng không có bất kỳ dấu hiệu ngộ độc nào xảy ra trên chuột.
Thông qua các chỉ số đánh giá chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết ethanol từ 4 mẫu ở liều 3000 mg.kg-1 an toàn trên chuột theo đường uống Như vậy, cao chiết ethanol có thể tiến hành các thử nghiệm tiếp theo trên chuột.
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng điều hòa đƣờng huyết của các mẫu cao chiết trên mô hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính trên mô hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính
Từ kết quả khảo sát khả năng chống oxy h a cũng như định lượng thành phần polyphenol của các mẫu chôm chôm, xoài, ổi, núc nác cho thấy cao chiết ethanol từ
4 mẫu thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt nên các mẫu cao chiết này được tiến hành thử nghiệm trên mô hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính.
Mục đích của thử nghiệm này nhằm sàng lọc liều đây là ước cơ ản có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định liều tối ưu nhất có tác dụng chống tăng đường huyết phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trên mô hình tiểu đường thực nghiệm.
Nồng độ cao chiết của các mẫu được thử nghiệm ở những liều khác nhau nhưng khởi điểm chuột được cho uống cao chiết với nồng độ 100 mg.kg-1 thể trọng.
3.3.2.1. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây