y = 5.6232x - 0.014 R² = 0.9973 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 OD
Dựa vào đường chuẩn acid gallic, kết hợp độ hấp thụ của mẫu ta tính được hàm lượng polyphenol tổng số, kết quả được trình bình trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol tổng số của 4 cây có hoạt tính chống oxy hóa cao
nhất Mẫu Hàm lƣợng polyphenol tổng số (mg GAE/g trọng lƣợng khô) Mangifera indica 104,67 7,02 Nephelium lappaceum 168,73 8,45 Psidium guajava 150,47 6,49 Oroxylum indicum 77,81 0,04
GAE gallic acid equivalent : đương lượng gallic acid.
Kết quả phân tích trong bảng 3.3 cho thấy cao chiết ethanol của từ lá cây
Nephelium lappaceum (chôm chôm) chứa hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất 168,73 8,45 mg GAE/g trọng lượng khô điều này phù hợp khả năng chống oxy hóa cao ở 2 mô hình DPPH và FRAP của mẫu cây này. Nghiên cứu của Josephine
et al. (2015) về tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học - geranin, một hợp chất
polyphenol từ vỏ chôm chôm cho thấy tổng hàm lượng polyphenol cao nhất được tìm thấy trong quả chôm chôm.
Kế đến là cao chiết ethanol của từ lá cây Psidium guajava (ổi) chứa hàm lượng polyphenol tổng số là 150,47 6,49 mg GAE/g trọng lượng khô. Kết quả này tốt hơn so với nghiên cứu của Alothman et al. (2009) cho kết quả hàm lượng
polyphenol tổng của cao chiết ethanol từ quả ổi là 157 6,18 mg GAE/g trọng lượng tươi.
3.2.2. Kết quả định lƣợng flavonoid tổng số
Dựa trên nguyên tắc đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3 tại ước sóng λ=420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng
- Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng ethanol 96% theo dãy nồng độ: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 (mg/ml)
- Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch. - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2%.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Mật độ quang của các mẫu được đo ở ước s ng λ = 0 nm
Hình 3.6 Đường chuẩn rutin
Dựa vào đường chuẩn rutin, kết hợp độ hấp thụ của mẫu ta tính được hàm lượng flavonoid tổng số, kết quả được trình bình trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Hàm lượng polyphenol tổng số của 4 cây có hoạt tính chống oxy hóa cao
tốt nhất Mẫu Hàm lƣợng flavonoid tổng số (mg RE/g trọng lƣợng khô) Mangifera indica 82,33 9,61 Nephelium lappaceum 74,45 0,81 Psidium guajava 97,45 1,03 Oroxylum indicum 49,74 0,06 RE rutin equivalent : đương lượng rutin.
y = 18.59x + 0.0007 R² = 0.9997 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060
Kết quả phân tích trong bảng 3.4 cho thấy cao chiết ethanol của từ lá cây
Psidium guajava (ổi) chứa hàm lượng flavonoid tổng số cao nhất là 97,45 1,03 mg RE/g trọng lượng khô. Kế đến là Mangifera indica (xoài) với hàm lượng là 82,33
9,61 mg RE/g trọng lượng khô, mặc dù cao chiết này c hàm lượng polyphenol tổng số thấp hơn cao chiết ethanol từ lá chôm chôm.
Kết quả cho thấy thành phần polyphenol và flavonoid tổng số tương đối phù hợp với khả năng chống oxy hóa cao ở hai phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ở trên. Các hợp chất polyphenol là những thành phần quan trọng để ngăn ngừa chống lại stress oxy hóa và có khả năng chống tăng đường huyết,...
3.3. Kết quả đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết 3.3.1. Xác định độc tính cấp 3.3.1. Xác định độc tính cấp
Trước khi thực hiện các thử nghiệm trên chuột, phải tiến hành kiểm tra độc tính cấp của cao chiết để xác định độ an toàn của cao chiết. Kết quả khảo sát độc tính cấp của cao chiết ethanol từ 4 mẫu sau thời gian thử nghiệm 120 giờ.
Quan sát hành vi của chuột của 4 nhóm thử cao chiết sau thời gian thử nghiệm, thấy rằng về hình dáng bên ngoài, màu sắc lông chuột không bị thay đổi và không có dấu hiệu của sự rụng lông. Về hoạt động của chúng diễn ra ình thường sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ theo dõi. Về hoạt động ăn uống, bài tiết, chuột vẫn ăn uống, bài tiết và tăng cân ình thường. Không thấy xuất hiện phân lỏng và cũng không có bất kỳ dấu hiệu ngộ độc nào xảy ra trên chuột.
Thông qua các chỉ số đánh giá chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết ethanol từ 4 mẫu ở liều 3000 mg.kg-1 an toàn trên chuột theo đường uống Như vậy, cao chiết ethanol có thể tiến hành các thử nghiệm tiếp theo trên chuột.
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng điều hòa đƣờng huyết của các mẫu cao chiết trên mô hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính trên mô hình chuột tăng đƣờng huyết cấp tính
Từ kết quả khảo sát khả năng chống oxy h a cũng như định lượng thành phần polyphenol của các mẫu chôm chôm, xoài, ổi, núc nác cho thấy cao chiết ethanol từ
4 mẫu thể hiện hoạt tính chống oxy hóa tốt nên các mẫu cao chiết này được tiến hành thử nghiệm trên mô hình in vivo chuột tăng đường huyết cấp tính.
Mục đích của thử nghiệm này nhằm sàng lọc liều đây là ước cơ ản có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định liều tối ưu nhất có tác dụng chống tăng đường huyết phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo trên mô hình tiểu đường thực nghiệm.
Nồng độ cao chiết của các mẫu được thử nghiệm ở những liều khác nhau nhưng khởi điểm chuột được cho uống cao chiết với nồng độ 100 mg.kg-1 thể trọng.
3.3.2.1. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây
Mangifera indica
Mangifera indica (xoài) là một trong 4 mẫu thể hiện hoạt tính tốt trong mô
hình khảo sát khả năng chống oxy h a và được tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết trên chuột. Kết quả thể hiện trong hình 3.7.
Hình 3.7. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá xoài so sánh với
các nh m đối chứng p<0,01 (Trắng: chuột ình thường; Đường: chuột tăng đường huyết; Gliben: chuột tăng đường huyết uống glibenclamide 10 mg.kg-1; XO_100, XO_150, XO_200: chuột tăng đường huyết được cho uống cao chiết ethanol từ lá xoài liều 100, 150, 200 mg.kg-1). 0 2 4 6 8 10 12 14
Trắng Đường Gliben XO_100 XO_150 XO_200
d a d b c d N ồng đ ộ gl ucose m áu (m m ol /L )
Kết quả từ hình 3.7 cho thấy nồng độ glucose trong máu ở các liều thử nghiệm đều thấp hơn nh m chuột tăng đường huyết (13,85 0,88 mmol/L). Cụ thể liều khởi điểm 100 mg.kg-1, nồng độ glucose máu của nhóm chuột được cho uống cao chiết từ ethanol từ lá xoài (9,02 0,75 mmol L đã giảm và có sự khác biệt so với nh m đối chứng chuột tăng đường huyết không được điều trị.
Vì liều khởi điểm chưa đạt yêu cầu thử nghiệm nên chuột được cho uống cao chiết ở liều 150 mg.kg-1, kết quả cho thấy nồng độ glucose trong máu ở liều này (7,21 0,53 mmol L đã giảm so với liều 100 mg.kg-1, tuy nhiên chúng vẫn chưa thể hiện khả năng chống tăng đường huyết như mong muốn. Mặt khác, cao chiết ethanol từ lá xoài ở liều 150 mg.kg-1 trong nghiên cứu này cho thấy % ức chế tăng nồng độ glucose máu là 47,94 % và cho thấy hiệu quả tốt hơn khi so sánh với nghiên cứu trước đây của Hossain et al. (2010) thử nghiệm cao chiết phân đoạn từ
cao tổng ethanol cho thấy phân đoạn ete dầu hỏa và phân đoạn chloroform có giá trị % ức chế tăng nồng độ glucose máu là 28% và 26% so với nhóm chuột tăng đường huyết.
o đ chuột được tiếp tục cho uống cao chiết ở liều 200 mg.kg-1
và kết quả nồng độ glucose trong máu của chuột ở liều này (6,03 0,58 mmol L đạt hiệu quả chống tăng đường huyết tương đương nh m chứng trắng chuột ình thường (6,29
0,30 mmol/L) và nhóm chuột tăng đường huyết được cho uống thuốc điều trị tiểu đường glibenclamide (5,91 0,68 mmol/L).
3.3.2.2. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây
Nephelium lappaceum
Nephelium lappaceum (chôm chôm) là một trong 4 mẫu thể hiện hoạt tính tốt
trong mô hình khảo sát khả năng chống oxy h a và được tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết trên chuột. Kết quả thể hiện trong hình 3.8.
Hình 3.8. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá chôm chôm so sánh với nh m đối chứng. (p<0,01) (Trắng: chuột ình thường; Đường: chuột tăng đường huyết; Gliben: chuột tăng đường huyết uống glibenclamide 10 mg.kg-1; CC_100, CC_150, CC_200: chuột tăng đường huyết uống cao chiết ethanol từ lá chôm chôm liều 100, 150, 200 mg.kg-1).
Kết quả từ hình 3.8 cho thấy nồng độ glucose trong máu ở các liều thử nghiệm đều thấp hơn nh m chuột tăng đường huyết (13,85 0,88 mmol/L). Cụ thể liều khởi điểm 100 mg.kg-1, nồng độ glucose máu của nhóm chuột được cho uống cao chiết từ ethanol từ lá chôm chôm (7,36 0,67 mmol L đã ắt đầu giảm và có sự khác biệt so với nh m đối chứng chuột tăng đường huyết không được diều trị.
Vì liều khởi điểm chưa đạt yêu cầu thử nghiệm nên chuột được cho uống cao chiết ở liều 150 mg.kg-1, kết quả cho thấy nồng độ glucose trong máu ở liều này (6,95 0,74 mmol L đã giảm so với liều 100 mg.kg-1, đạt giá trị tương đương nhóm chứng trắng chuột ình thường (6,29 0,30 mmol/L). Tuy nhiên chúng vẫn chưa thể hiện khả năng chống tăng đường huyết như mong muốn.
o đ chuột được cho uống cao chiết ethanol từ lá chôm chôm ở liều 200 mg.kg-1 và kết quả nồng độ glucose trong máu của chuột ở liều này (5,53 0,49 mmol L đạt hiệu quả chống tăng đường huyết tương đương nhóm chuột tăng
0 2 4 6 8 10 12 14 Trắng Đường Gliben CC_100 CC_150 CC_200 cd a d b bc d N ồng đ ộ gl ucose m áu (m m ol /L )
đường huyết được cho uống thuốc điều trị tiểu đường glibenclamide (5,91 0,68 mmol/L).
Nghiên cứu trước đây của Subramaniam et al. (2015) cho thấy cao chiết
ethanol của vỏ Nephelium lappaceum có hoạt tính chống tăng đường huyết in vitro, thông qua ức chế hoạt động của hai enzyme thủy phân carbohydrate, cụ thể là α- glucosidase và α-amylase ở mức độ đáng kể so với thuốc acarbose. Những phát hiện này tương tự như nghiên cứu của Palanisamy et al. (2011a), cao chiết ethanol của
vỏ Nephelium lappaceum ức chế α-glucosidase (EC50 = 2,7 ± 2,3 µg.mL-1) lớn hơn α-amylase (EC50 = 70,8 ± 49 µg.mL-1). Trong một nghiên cứu khác, Palanisamy et
al. (2011b) cho rằng geraniin - hợp chất hoạt tính sinh học trong vỏ của Nephelium lappaceum c tác động ức chế mạnh hơn đối với cả hai enzyme α-glucosidase và α-
amylase (IC50 = 0.92 ± 0.1 µg.mL-1). Những thay đổi sinh h a được quan sát về mặt mô học cho thấy những khu vực tế bào tuyến tụy bị tổn thương do STZ được phục hồi đáng kể về mặt hình thái tế ào cũng như kích thước và số lượng khi sử dụng cao chiết của vỏ Nephelium lappaceum ở liều 2000 mg.kg-1 (Subramaniam et al.,
2015 o đ c thể cao chiết ethanol từ lá chôm chôm chứa chất geraniin có hoạt tính chống tăng đường huyết tốt do có khả năng phục hồi sự tổn thương của tế ào β tuyến tụy tương tự như cao chiết từ vỏ.
3.3.2.3. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Psidium
guajava
Psidium guajava (ổi) là một trong 4 mẫu thể hiện hoạt tính tốt trong mô hình
khảo sát khả năng chống oxy hóa và được tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết trên chuột. Kết quả thể hiện trong hình 3.9.
Hình 3.9. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá ổi so sánh với nh m đối chứng.(p<0,01) (Trắng: chuột ình thường; Đường: chuột tăng đường huyết; Gliben: chuột tăng đường huyết uống glibenclamide 10 mg.kg-1; OI_100, OI_150, OI_200: chuột tăng đường huyết uống cao chiết ethanol từ lá ổi liều 100, 150, 200 mg.kg-1).
Kết quả từ hình 3.9 cho thấy nồng độ glucose trong máu ở các liều thử nghiệm đều thấp hơn nh m chuột tăng đường huyết (13,85 0,88 mmol/L). Cụ thể liều khởi điểm 100 mg.kg-1, nồng độ glucose máu của nhóm chuột được cho uống cao chiết từ ethanol từ lá ổi (7,13 0,66 mmol L đã giảm và có sự khác biệt so với nh m đối chứng chuột tăng đường huyết không được diều trị.
Vì liều khởi điểm chưa đạt yêu cầu thử nghiệm nên chuột được cho uống cao chiết ở liều 150 mg.kg-1, kết quả cho thấy nồng độ glucose trong máu ở liều này rất tốt (5,38 0,72 mmol L đã giảm so với liều 100 mg.kg-1 đạt giá trị tương đương với nhóm chuột tăng đường huyết được cho uống thuốc điều trị tiểu đường glibenclamide (5,91 0,68 mmol/L) và thấp hơn nhóm chứng trắng chuột bình thường (6,29 0,30 mmol/L).
Mặc dù theo như kết quả thử nghiệm hoạt tính cao chiết ethanol từ lá ổi ở liều 150 mg.kg-1 đạt kết quả tốt nhưng ta vẫn tiếp tục thử hoạt tính ở liều 200 mg.kg-1
0 2 4 6 8 10 12 14
Trắng Đường Gliben OI_100 OI_150 OI_200
c a cd b d d N ồng đ ộ gl ucose m áu (m m ol /L )
theo như ố trí thí nghiệm. Kết quả cho thấy nồng độ glucose máu ở nhóm chuột dùng liều này là 5,13 0,31 mmol/L, không có sự khác biệt về mặt thống kê so với nh m được cho uống liều 150 mg.kg-1
.
Cao chiết ethanol 70% từ lá ổi trong nghiên cứu này cho thấy hiệu quả tốt hơn so với nghiên cứu trước đây của Santosh et al., 2015. Nghiên cứu của Santosh thử nghiệm cao chiết ethanol 98% của lá ổi ở nồng độ 1 g.kg-1 và 0,5 g.kg-1 trên mô hình chuột tăng đường huyết cấp tính cho kết quả nồng độ glucose trong máu sau 1h được cho uống cao chiết và đường glucose tương ứng là 7,62 1,21 và 9,50 2,33 mmol/L chưa đạt hiệu quả tương đương với nh m đối chứng chuột tăng đường huyết được cho uống thuốc điều trị tiểu đường glibenclamide (6,42 0,58 mmol/L). Sự khác nhau có thể do độ phân cực của dung môi tách chiết và do tính chất của mẫu khác nhau ở mỗi nơi thu hái khác nhau.
3.3.2.4. Khả năng điều hòa đƣờng huyết của nhóm cao chiết từ lá cây Oroxylum
indicum
Oroxylum indicum (núc nác) là một trong 4 mẫu thể hiện hoạt tính tốt trong
mô hình khảo sát khả năng chống oxy h a và được tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết trên chuột. Kết quả thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.10. Nồng độ glucose máu của nhóm cao chiết ethanol từ lá núc nác so sánh
với nh m đối chứng. (p<0,01) (Trắng: chuột ình thường; Đường: chuột tăng đường huyết; Gliben: chuột tăng đường huyết uống glibenclamide 10 mg.kg-1; NN_100, NN_150, NN_200: chuột tăng đường huyết uống cao chiết ethanol từ lá núc nác liều 100, 150, 200 mg.kg-1).
Kết quả từ hình 3.10 cho thấy nồng độ glucose trong máu ở các liều thử nghiệm đều thấp hơn nh m chuột tăng đường huyết (13,85 0,88 mmol/L). Với liều khởi điểm 100 mg.kg-1, nồng độ glucose máu của nhóm chuột được cho uống cao chiết từ ethanol từ lá núc nác (9,35 0,81 mmol L đã giảm và có sự khác biệt so với nh m đối chứng chuột tăng đường huyết không được diều trị.
Vì liều khởi điểm chưa đạt yêu cầu thử nghiệm nên chuột được cho uống cao chiết ở liều 150 mg.kg-1, kết quả cho thấy nồng độ glucose trong máu ở liều này (7,95 0,54 mmol L đã giảm so với liều 100 mg.kg-1.
o đ chuột được tiếp tục cho uống cao chiết ở liều 200 mg.kg-1
và kết quả nồng độ glucose trong máu của chuột ở liều này (6,10 0,84 mmol L đạt hiệu quả chống tăng đường huyết tương đương nh m chứng trắng chuột ình thường (6,29
0,30 mmol/L) và nhóm chuột tăng đường huyết được cho uống thuốc điều trị tiểu đường glibenclamide (5,91 0,68 mmol/L).
0 2 4 6 8 10 12 14 Trắng Đường Gliben NN_100 NN_150 NN_200 d a d b c d N ồng đ ộ gl ucose m áu (m m ol /L )
Trong thử nghiệm gần đây của Bo-wei Zhang et al. (2017) về khả năng dung nạp tinh bột và thử nghiệm tăng đường huyết cấp tính, sự kết hợp của cao chiết