2.1 .Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chống tăng đƣờng huyết
2.3.4.1. Xác định độc tính cấp
Thử nghiệm xác định độc tính cấp theo phương pháp Bộ Y tế Việt Nam ban hành và tham khảo phương pháp liều cố định hướng dẫn trong OECD số 425. Cao chiết được pha ở nồng độ cao nhất có thể pha loãng nhằm khảo sát độc tính cấp. Chuột bạch đực được chia thành nhiều nh m tương tự nhau, mỗi con ở cùng nhóm sẽ nhận cùng một liều khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết của chuột trong mỗi nhóm. Sau khi cho chuột uống thuốc với liều duy nhất trong ngày, quan sát hành vi, thể trạng của chuột sau 24, 48, 72, 96 và 120 giờ.
Để thăm dò liều đối với mỗi cao chiết, liều dùng 6 con chuột, mỗi con có trọng lượng 20–25g, cho uống liều duy nhất trong ngày với thể tích thuốc tối đa chuột có thể nhận được là 0,2 ml/10 gam thể trọng/lần ngày quy định cho chuột nhắt đây là liều thực hiện cho lượng cao chiết tối đa c thể hòa tan được trong 0,2 ml nước cất và chất trợ tan Đỗ Trung Đàm 003
Hình 2.6. Nhóm thử nghiệm gồm 6 con chuột
trong ngày Nh m đối chứng chuột được cho uống nước cất Sau đ ghi nhận kết quả.
2.3.4.2. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột tăng đƣờng huyết cấp tính
Các mẫu cao chiết có hoạt tính chống oxy hóa tốt trên 2 mô hình DPPH và FRAP sẽ được tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả năng chống tăng đường huyết cấp tính. Thực hiện như mô tả bởi Rahman et al. 0 như sơ đồ mô tả sau đây:
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử hoạt tính của mẫu trên chuột tăng đường
huyết cấp tính. Thuyết minh sơ đồ:
Chuột được chia thành 15 nhóm (6 con mỗi nhóm):
- Nhóm 1 (nhóm chứng trắng) chuột được cho uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 2 (chuột tăng đường huyết) chuột được uống DMSO 1% và đường với
2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 3 (nhóm chứng sinh học) chuột được uống thuốc với thành phần glibenclamide (10 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
MSO % trong nước cất
huột ạch
Glucose g kg-
Đo đường huyết sau h Gli enclamide 0 mg kg- ao chiết ethanol ở các nồng độ Nh m Nh m Nh m 3 Nh m -
- Nhóm 4 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 100 mg.kg-1
thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 5 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 6 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá xoài ở liều 200 mg/kg thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 7 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá chôm chôm ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 8 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
chôm chôm ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 9 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
chôm chôm ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 10 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi
ở liều 100 mg.kg-1
thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 11 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi ở liều 150 mg.kg-1
thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
- Nhóm 12 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá ổi ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng
- Nhóm 13 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá núc nác ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 14 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
núc nác ở liều 150 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng. - Nhóm 15 (nhóm thử cao chiết) chuột được cho uống cao chiết ethanol của lá
núc nác ở liều 200 mg.kg-1 thể trọng và đường với 2g glucose/kg thể trọng.
Các mẫu máu được thu nhận sau khi uống glucose một giờ và lượng đường trong máu được đo ngay lập tức bằng phương pháp glucose oxidase với máy đo đường huyết (Venkatesh et al., 2004).
Hình 2.8. Chuột được cho uống dung dịch glucose 2g.kg-1 thể trọng
2.3.4.3. Khảo sát trên mô hình in vivo chuột gây tiểu đƣờng bởi streptozocin
Tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1 theo mô tả của Kenneth et al. (2008) và tham khảo mô hình của Nguyễn Trung Quân (2009).
Hình 2.9. Sơ đồ tạo mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường type 1.
Tiêm đệm citrate 0 M lạnh pH =
huột ạch
Uống glucose % trong 3 ngày huột tiểu đường type
Tiêm STZ hòa tan trong đệm citrate liều 0 mg kg-
Nh m Nh m
Thuyết minh sơ đồ:
Tạo mô hình chuột tiểu đường type 1: chuột được gây bệnh tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc bụng chuột liều duy nhất 150 mg.kg-1 streptozocin STZ được hòa tan trong đệm citrate 0.1M lạnh pH ; sau khi tiêm nước cho chuột uống được thay thế bằng dung dịch glucose % Nh m đối chứng chuột chỉ được tiêm đệm citrate. Sau 3 ngày tiêm STZ, chuột có nồng độ glucose máu lúc đ i trên mmol L được coi là tiểu đường và đưa vào nghiên cứu.
Hình 2.10. Chuột được tiêm STZ vào phúc mạc bụng.
Sau khi tạo mô hình chuột tiểu đường type 1 thành công, tiến hành với số lượng lớn để thử nghiệm hoạt tính chống tăng đường huyết của các mẫu cao chiết trên chuột đã gây tiểu đường được chọn, thực hiện như mô tả bởi Rucha et al.
Hình 2.11. Sơ đồ thử nghiệm hoạt tính của mẫu trên chuột tiểu đường type 1.
Thuyết minh sơ đồ:
Các con chuột được phân thành 5 nhóm (6 con mỗi nh m và được tiến hành như sau:
- Nhóm 1: Chuột ình thường uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 2: Chuột bệnh tiểu đường uống DMSO 1% và nước cất. - Nhóm 3: Chuột bệnh tiểu đường uống glibenclamide (10 mg.kg-1). - Nhóm 4: Chuột bệnh tiểu đường uống cao chiết ethanol lá ổi liều 100
mg.kg-1.
- Nhóm 5: Chuột bệnh tiểu đường uống cao chiết ethanol lá chôm chôm liều 100 mg.kg-1. huột ình thường Nh m Nh m huột tiểu đường Nh m Nh m 3 Nh m MSO % trong nước cất
Uống mỗi ngày trong ngày
Đo đường huyết lúc đ i vào uổi sáng các ngày thứ Gli enclamide 0 mg kg- ao chiết ethanol ổi 00 mg kg- ao chiết ethanol chôm chôm 00 mg kg-
Hình 2.12. Chuột được cho uống cao chiết.
Mỗi nh m được cho cho uống như mô tả đều đặn mỗi ngày trong ngày đo lượng đường trong máu đều đặn mỗi tuần 1 lần, chuột được cho nhịn ăn cả đêm trước khi đo
2.3.4.4. Phƣơng pháp định lƣợng glucose trong máu
Định lượng glucose trong máu bằng kỹ thuật enzyme. Glucoseoxidase bị oxy hóa nhờ sự xúc tác của các enzyme có trên bề mặt của vùng phản ứng que thử và đọc kết quả trên máy Truetrack do hãng Trividia Health sản xuất.
Nguyên lý hoạt động
Enzyme glucoseoxidase xúc tác quá trình oxy h a β-D-glucose thành - gluconic acid α- -glucose trong máu nhanh ch ng chuyển sang dạng β vì vậy tất cả glucose đều được đo trong cùng một thời điểm ảm biến sinh học enzyme glucose sử dụng một điện cực thay O2 tác động lên lượng glucose khử. Trong phản ứng mở vòng dưới tác dụng của enzyme glucoseoxidase và điện cực trong que thử làm mất các electron cần thiết, nhóm aldehyde ở C1 bị chuyển thành acid acid- - gluconic và hình thành H2O2 òng điện tử được tạo ra tương ứng với nồng độ glucose trong máu.
Phương pháp tiến hành
Máy Truetrack đo lượng đường glucose trong máu toàn phần Máu được thấm vào đầu trên của que thử và tự động hút vào vùng đo nơi phản ứng xảy ra.
- Gắn một que thử để bật máy.
- Tạo vết cắt trên đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là l phải là một máu tròn đầy. Thấm nhẹ giọt máu vào điểm nhận máu trên đầu que thử. Sau 5 giây kết quả sẽ hiện thị trên màn hình.
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả được thể hiện dưới dạng trung bình SD. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 0 0 và phân tích phương sai NOV ằng SAS 9.4.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa 3.1. Kết quả đánh giá khả năng chống oxy hóa
3.1.1. Mô hình quét gốc tự do DPPH
Phương pháp qu t gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này được dùng phổ iến vì đơn giản nhanh ch ng và ổn định. DPPH là một gốc tự do c ước sóng cực đại hấp thu tại nm và c màu tím ác chất c khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần chuyển từ tím sang vàng nhạt
Hiệu quả quét gốc tự do của dịch chiết ethanol của 20 mẫu cây trong thử nghiệm loa i gốc DPPH được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của 20 mẫu cây STT Mẫu % ức chế DPPH 1 Achyranthes aspera 22,13 1,23 2 Acorus calamus 22,45 1,48 3 Bupleurum chinense 15,07 0,50 4 Carica papaya 19,94 1,23 5 Gardenia jasminoides 35,19 0,95 6 Glycyrrhiza uralensis 67,79 3,07 7 Mangifera indica 83,78 2,88 8 Momordica charantia 42,33 0,62 9 Nephelium lappaceum 94,02 0,56 10 Oroxylum indicum 92,30 2,19 11 Oxalis corniculata 38,87 1,35 12 Pandanus tectorius 25,12 0,91 13 Plantago major 48,73 2,23 14 Perilla frutescens 42,79 2,11 15 Polycarpaea arenaria 50,24 0,96 16 Portulaca oleracea 23,42 0,80 17 Psidium guajava 93,23 0,64 18 Polyscias fruticosa 26,17 0,90 19 Typhonium trilobatum 40,31 0,24 20 Wedelia chinensis 34,68 1,15
Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của các cao chiết phân bố trong một phạm vi rộng, từ 0 % đến 94,02% tại nồng độ 1mg/ml của các mẫu cao chiết Trong đ c mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do PPH dưới 50% và 6 mẫu có hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH trên 50% là Glycyrrhiza uralensis (cam
thảo bắc), Mangifera indica (xoài), Nephelium lappaceum (chôm chôm), Oroxylum
indicum (núc nác), Polycarpaea arenaria (sài hồ nam), Psidium guajava (ổi).
Kết quả thử nghiệm cho thấy hoạt tính loại gốc tự do ở nồng độ mg ml của mẫu lá Nephelium lappaceum (chôm chôm), Psidium guajava (ổi), Oroxylum indicum núc nác rất mạnh với giá trị % ức chế DPPH lần lượt là 94,02 0,56; 93,23 0,64; 92,30 2,19 gần bằng với giá trị của chất đối chứng ascorbic acid (vitamin C) là 94,40 0,95 và mẫu lá Mangifera indica (xoài) với 83,78 2,88 % ức chế DPPH.
Nghiên cứu trước đây của Nont Thitilertdecha et al. (2010) về khả năng chống oxy hóa của các hợp chất cô lập được từ vỏ quả chôm chôm là ellagic acid (EA), corilagin và geraniin cho thấy rằng so với chất chống oxy hoá tổng hợp (BHT), 3 hợp chất này có khả năng ắt gốc tự do PPH đáng kể Đây là tất cả các hợp chất chống oxy hóa mạnh bởi chúng có một số lượng lớn các nh m hydroxyl và đặc biệt là nhiều nhóm ortho-dihydroxy. Ba hợp chất polyphenol này được xác định là có các đặc tính bắt các ROS mạnh khác nhau cho anion superoxide (O2-), gốc hydroxyl (-OH) và gốc peroxyl (ROO-). Cao chiết ethanol từ lá chôm chôm có hoạt tính chống oxy hóa mạnh cũng c thể cùng lý do trên.
Bốn mẫu cao chiết có hoạt tính quét gốc tự do DPPH tốt tiếp tục được xác định giá trị IC50 với acid ascorbic (vitamin C) là đối chứng. Giá trị IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ chất chống oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định.
Hình 3.1. Hoạt tính loại gốc tự do DPPH ở nồng độ 1mg/ml của dịch chiết ethanol
từ 4 mẫu CC: chôm chôm, XO: xoài, OI: ổi, NN: núc nác so sánh với AA: ascorbic acid.
Để xác định chỉ số IC50, mỗi cao chiết được pha thành 6 nồng độ 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml và 0,03125 mg/ml tương ứng với các nồng độ cuối của mẫu trong hỗn hợp phản ứng là 24,3902 µg/ml; 12,1951 µg/ml; 6,0975 µg/ml; 3,0488 µg/ml; 1,5244 µg/ml và 0,7622 µg/ml. Sau đ hoạt tính ức chế DPPH ở mỗi nồng độ đươ c xác định và c được đường chuẩn tương ứng với mỗi mẫu. Từ đ kết quả xác định IC50 của các dịch chiết so với Vitamin C được trình bày ở hình 3.2, giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ khả năng chống oxy hóa càng mạnh. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CC XO OI NN AA % ức chế PPH Mẫu %
Hình 3.2. Hoạt tính loại gốc tự do thông qua giá trị IC50 của dịch chiết ethanol từ 4 mẫu CC: chôm chôm, XO: xoài, OI: ổi, NN: núc nác so sánh với AA: ascorbic acid.
IC50 của dịch chiết ethanol từ 4 mẫu lá chôm chôm, xoài, ổi, núc nác lần lượt là 6,85 µg/ml, 10,46 µg/ml, 4,14 µg/ml và 4,34 µg/ml có sự khác biệt so với hoạt tính chống oxy h a của vitamin I 50= 2,73µg/ml).
Giá trị IC50 của cao chiết ethanol từ lá xoài trong nghiên cứu này không có sự khác biệt đáng kể so với nghiên cứu trước đây của Mohan et al. (2013). Nghiên cứu trước đây cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết methanol, ethyl acetat và n-butanol từ lá xoài với giá trị IC50 lần lượt là 13,37; 3,55 và 14,19 µg / mL và so sánh với chất đối chứng acid gallic với giá trị IC50 là 1,88 µg / mL.
3.1.2. Mô hình FRAP
Phương pháp này dựa vào sự khử phức Fe(III)–TPTZ thành phức Fe(II)– TPTZ bền hơn ằng một chất khử chất chống oxi hoá) ở pH thấp e II – TPTZ c màu xanh dương đậm Như vậy sau phản ứng nếu Fe2+-TPTZ sinh ra càng nhiều màu của dung dịch càng đậm và ngược lại Từ đ c thể suy ra hoạt lực của chất chống oxy hóa.
Hoạt lực của chất chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị FRAP xác định từ đường chuẩn. Giá trị FRAP càng lớn chất chống oxi hoá càng mạnh
0 2 4 6 8 10 12 CC XO OI NN AA IC50(µg/ml) Mẫu %
Hình 3.3. Đường chuẩn Fe2+-TPTZ
Từ độ hấp thu của mẫu đo được dựa vào đường chuẩn Fe2+-TPTZ đã lập tính được giá trị FRAP của 20 mẫu dịch chiết ethanol. Giá trị FRAP tính cho nồng độ mg ml của dịch chiết trước phản ứng.
Dịch chiết ethanol của 0 mẫu cây trước khi đem phản ứng được pha loãng ở nồng độ sao cho phản ứng cho kết quả đo độ hấp thu nằm trong đường chuẩn. Trong thí nghiệm này dịch chiết ethanol của 20 mẫu cây được chọn ở nồng độ 0 mg ml do c tác dụng mạnh Khả năng chống oxy hóa qua mô hình FRAP của 20 mẫu được thể hiện trong bảng 3.2 và Hình 3.4
y = 0.0005x + 0.0215 R² = 0.997 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0 200 400 600 800 1000 1200
Bảng 3.2. Khả năng chống oxy hóa thông qua mô hình FRAP của 20 mẫu cây STT Mẫu µmol Fe2+/L 1 Achyranthes aspera 1062 12 2 Acorus calamus 1126 7 3 Bupleurum chinense 1230 23 4 Carica papaya 1174 12 5 Gardenia jasminoides 1502 6 6 Glycyrrhiza uralensis 932 5 7 Mangifera indica 4259 40 8 Momordica charantia 983 14 9 Nephelium lappaceum 6428 74 10 Oroxylum indicum 5495 50 11 Oxalis corniculata 1025 30 12 Pandanus tectorius 1032 17 13 Plantago major 1078 15 14 Perilla frutescens 1264 21 15 Polycarpaea arenaria 1073 25 16 Portulaca oleracea 1001 12 17 Psidium guajava 5794 42 18 Polyscias fruticosa 1263 36 19 Typhonium trilobatum 1542 18 20 Wedelia chinensis 1266 12
Từ bảng 3.2 cho thấy có một sự khác biệt lớn lên đến 6,90 lần) trong khả