Chỉ định của DIF
DIF là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán các BDBNTM. Giúp phân biệt các BDBNTM có đặc điểm lâm sàng tương tự nhau và chẩn đoán loại trừ các bệnh bóng nước khác [85].
Bảng 1.5. Chỉ định của xét nghiệm MDHQTT trong các bệnh lý da liễu [35]
DIF là tiêu chuẩn chẩn đoán (A) Bệnh lý bóng nước Nhóm bệnh pemphigus Nhóm bệnh pemphigoid Viêm da dạng herpes
Ly thượng bì bóng nước mắc phải (B) Bệnh lý mô liên
kết
Lupus ban đỏ dạng đĩa Lupus ban đỏ hệ thống DIF là đặc trưng và ít nhiều có giá trị chẩn đoán (A) Bệnh lý mạch máu Viêm mạch dị ứng Henoch – Schoenlein
Cryoglobulin huyết hỗn hợp vô căn
Viêm nút quanh động mạch (B) Các bệnh khác Porphyria da muộn và các thể
porphyria khác Lichen phẳng DIF không phải là
xét nghiệm chẩn đoán bệnh nhưng giúp gợi ý nguyên nhân tự miễn.
(A) Bệnh lý mô liên kết
Bệnh lý mô liên kết hỗn hợp Xơ cứng hệ thống
Viêm bì cơ Vảy nến
Trong chẩn đoán BDBNTM, DIF được thực hiện với 5 loại KT: IgG, IgA, IgM, C3, Fibrinogen [85].
Sinh thiết mẫu mô cho xét nghiệm DIF
(1)Cách lấy mẫu bệnh phẩm
Đối với BDBNTM, nên sinh thiết (ST) hai mẫu: (1) mẫu ST bóng nước cho khảo sát mô học (nhuộm H&E) và (2) mẫu ST da cạnh bóng nước cho xét nghiệm DIF [81]. Đối với mảnh ST cho khảo sát mô học, nên lấy ở vùng tiếp giáp, trong đó bóng nước nên chiếm 2/3 và da quanh bóng nước chiếm 1/3 mảnh ST [48]. Nên chọn ST các tổn thương mới thành lập < 24 giờ để tránh hiện tượng tái tạo biểu mô gai và bội nhiễm [48].
Hình 1.17. Vị trí ST tổn thương cho khảo sát mô học và nhuộm DIF trong BDBNTM.
Quan niệm cổ điển cho rằng mảnh ST tốt cho khảo sát DIF là ở vùng da xung quanh tổn thương; ST lấy tại vùng tổn thương hoặc sát tổn thương có thể gây âm tính giả, do KN bị mất theo phần da bị trợt, loét hoặc KN màng đáy bị phá huỷ do phản ứng viêm mạnh [81],[85]. Các tác giả Jonkman và Diercks đề nghị ST vùng hồng ban trong khoảng 1-2 cm cạnh bóng nước [81], một số tác giả đề nghị ST vùng da bình thường trong khoảng 1cm quanh bóng nước [Hình 1] [47]. Trong BSLE, ST da để nhuộm DIF nên lấy ở cả vùng quanh tổn thương và ngay tại tổn thương để khảo sát “lupus band test” [81]. Đặc trưng miễn dịch học của SLE là “lupus band test” – định nghĩa bởi sự lắng đọng thành dải của các loại immunoglobulins và bổ thể ở vùng nối bì- thượng bì, bộc lộ bởi phép
nhuộm DIF trên vùng da quanh tổn thương, ngay tại tổn thương và cả vùng da không tổn thương [136].
Bảng 1.6. Vị trí ST được khuyến cáo cho nhuộm DIF trong BDBNTM [81]
Quanh tổn thương Vùng da không tổn thương Tổn thương
Nguyên tắc chung ✓ Mặt trong cánh tay
Các ngoại lệ
BSLE ✓ Mặt lưng cổ tay ✓
DH ✓ Mặt duỗi khuỷu ✓
(2)Cách bảo quản và vận chuyển mẫu sinh thiết
Mẫu ST cho nhuộm H&E để khảo sát mô học được cố định trong formol đệm trung tính 10% ở nhiệt độ phòng. Mẫu ST cho DIF không được cố định bằng bất kỳ loại hoá chất nào. Để tránh cho mẫu ST bị khô, nên bọc bệnh phẩm trong gạc tẩm dung dịch (dd) NaCl 0,9% và để ngay bệnh phẩm vào nitơ lỏng càng sớm càng tốt [81]. Mẫu nhuộm DIF cũng có thể bảo quản tối đa 1 tháng trong dịch vận chuyển mô Michel’s pH 7,0 – 7,2 giữ ở 4oC. Nếu chưa thực hiện ngay DIF thì bệnh phẩm được bảo quản lạnh ở -800C.
Cách lý giải kết quả xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong chẩn đoán BDBNTM:
(1)Tín hiệu huỳnh quang không đặc hiệu
Nền HQ xanh lá cây nhạt của thượng bì và trung bì bình thường phản ánh sự kết hợp không đặc hiệu của KT với tổ chức. Tín hiệu HQ không đặc hiệu còn có thể tìm thấy ở lớp sáng ở giữa lớp sừng và lớp hạt, do sự kết hợp của các KT với bề mặt thượng bì. Nền huỳnh quang không đặc hiệu mạnh có thể gây trở ngại trong việc xác định HQ đặc hiệu.
Cách lý tưởng để hạn chế tối đa HQ không đặc hiệu là khử KN không đặc hiệu và KN nền bằng huyết thanh cừu 5% trong PBS/ Triton-X100 0.3% trong 30 phút. Theo Vodegel, vận chuyển và lưu giữ bệnh phẩm 24 giờ trong dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ phòng có thể giúp giảm tín hiệu huỳnh quang không đặc hiệu [165].
(2)Cách đọc kết quả DIF
Kết quả miễn dịch huỳnh quang luôn được lý giải kết hợp với lâm sàng, mô học và các xét nghiệm khác (xét nghiệm huyết thanh học). Đọc kết quả DIF phải mô tả một cách kỹ lưỡng các hình thức lắng đọng của huỳnh quang miễn dịch bao gồm: vị trí lắng đọng KT, loại KT lắng đọng, kiểu lắng đọng và cường độ tín hiệu.
i. Vị trí lắng đọng KT:
Các vị trí lắng đọng KT thường gặp trong nhuộm DIF các bệnh lý tự miễn ở da bao gồm: trong lớp sừng, trên bề mặt các TB gai, nhân TB gai, ở BMZ, trung bì, thành mạch, nang lông, tuyến mồ hôi và kết hợp nhiều vị trí. Trong đó, lắng đọng KT ở bề mặt các TB biểu mô gai và ở BMZ có ý nghĩa quan trọng trong phân loại BDBNTM.
ii. Loại KT lắng đọng:
Các loại KT dùng trong DIF để chẩn đoán BDBNTM bao gồm : KT lớp Ig (G, A, M), bổ thể (C3), fibrinogen (fibrin). Pemphigus và pemphigoid thường lắng đọng IgG, có thể kèm lắng đọng C3 [85]. Lắng đọng IgA là đặc điểm của IAP, LAD, và DH [85]. Fibrinogen lắng đọng dạng tua dọc màng đáy trong lichen phẳng thể bóng nước (LPP) [85]. IgM là loại kháng thể thường găp nhất trong lupus band test [136].. Trong SLE, IgM dương tính đơn độc, gián đoạn ở BMZ với cường độ vừa ở vùng da không phơi bày ánh sáng được xem là đủ để kết luận lupus band test dương tính [136].
iii. Kiểu lắng đọng KT:
Các kiểu lắng đọng KT trong DIF có thể là thành dải, thành hạt mịn, hạt thô, thành búi. KT lắng đọng thành dải khi tín hiệu liên tục, đều, mảnh mai. Dạng hạt có thể là hạt
nhỏ, đều, có thể là hạt lớn, không đều. Đôi khi các hạt mịn sát vào nhau tạo thành hình ảnh giả dạng dải như trong pemphigus [85].
Kiểu lắng đọng KT giúp chẩn đoán phân biệt các BDBNTM. Cùng là dương tính với IgG ở dọc màng đáy nhưng BP, EBA và BSLE biểu hiện lắng đọng dạng dải, SLE cổ điển có kiểu dương tính dạng hạt [85]. Tương tự, DH và LAD đều dương tính với IgA ở BMZ nhưng DH dương tính dạng hạt, LAD dương tính dạng dải [85].
iv. Cường độ tín hiệu:
PVe và PV điển hình dương tính với IgG mạnh hơn C3 và có thể biểu hiện lắng đọng KT ở lớp thượng bì sâu mạnh hơn so với lớp thượng bì nông. Trái lại, PF và PE biểu hiện IgG ở lớp thượng bì nông mạnh hơn [25],[112]. PNP và PE đều lắng đọng IgG và/ hoặc C3 ở bề mặt TB gai kết hợp với ở BMZ nhưng PNP thường biểu hiện cường độ trên bề mặt TB gai yếu, cục bộ so với PE [85]. Theo Mutasim [123], De Vega [56], Smoller [152], trên DIF, BP có tỷ lệ dương tính với C3 nhiều hơn và ở cường độ mạnh hơn so với EBA; C3 biểu hiện mạnh hơn IgG ở BMZ thường thấy trong BP, PG, MMP. Theo Aoki [6], gần 100% các ca EBA có cường độ IgG ưu thế [6].
Một số hình thức lắng đọng KT thường gặp trong xét nghiêm DIF đối với BDBNTM
(1)Lắng đọng trên bề mặt TB biểu mô gai
Lắng đọng KT ở bề mặt TB gai là đặc trưng, có giá trị chẩn đoán rất cao đối với nhóm bệnh pemphigus. Kiểu lắng đọng có thể là dải liên tục hoặc dạng hạt (mịn hoặc thô) [82].
Dương tính giả liên TB gai thượng bì có thể gặp trong tổn thương chàm da. Trong trường hợp này, tín hiệu huỳnh quang lắng đọng dạng “đường ray xe điện” [44].
Hình 1.19. Dương tính giả với IgG trong chàm da [44] (2)Lắng đọng miễn dịch ở khoảng gian bào và tại BMZ
Lắng đọng dạng hạt của Ig và /hoặc C3c ở BMZ kết hợp với ở bề mặt TB gai thường gặp trong PE và PNP [44]. PNP thường dương tính ở bề mặt TB gai yếu, cục bộ so với PE [85]. Ngoài dạng hạt giống PE, PNP có thể dương tính dạng dải ở BMZ [85].
(3)Lắng đọng kháng thể ở vùng màng đáy
Sự lắng đọng KT ở BMZ gặp ở nhiều bệnh như nhóm bệnh pemphigoid, bệnh mạch máu, bệnh mô liên kết và một số bệnh khác [85]. Lý giải kết quả phải kết hợp với kiểu lắng đọng (hạt, dải, kiểu răng cưa) loại Ig lắng đọng, cường độ tín hiệu, kèm theo lắng đọng ở mạch máu hay không để phân biệt các bệnh khác nhau [44] (Bảng 1.7)
Bảng 1.7. Các bệnh da bóng nước có lắng đọng KT ở BMZ trên DIF [44]
Loại bệnh Loại KT Tỷ lệ dương tính Kiểu lắng đọng
BP
IgG 90%
Dạng dải liên tục C3 >90% (hầu hết)
C3 100% MMP IgG, C3, IgA EBA IgG 100% IgA 66% IgM 50% LAD IgA 100% IgG, IgM, C3 LPP
IgG, C3 Dạng dải liên tục
IgM, IgA, C3 Cytoid bodies Fibrinogen Dạng tua DH IgA 100% Dạng hạt C3c 50%
BSLE IgG, IgM, IgA, C3
>90% ở tổn thương da vùng phơi bày ánh sáng
50% ở vùng da phơi bày ánh sáng không tổn thương
Dạng hạt hoặc dải liên tục u-shape trên mẫu da lành quanh bóng nước
30% ở vùng da không phơi bày ánh sáng và không tổn thương
Kèm IgG dương nhân TB gai dạng chấm trong 10- 15% trường hợp
Lắng đọng dạng dải của IgG là đặc điểm của các bệnh nhóm pemphigoid gồm BP, EBA, PG, MMP, BSLE. Để phân biệt chính xác, cần quan sát dưới KHV điện tử hoặc dùng kỹ thuật muối bão hoà làm tách màng đáy để xác định vị trí lắng đọng của phức hợp miễn dịch. Trong BP, PG và MMP, KT lắng đọng phía trên lá đặc tương ứng với phía trần bóng nước; còn trong EBA và BSLE, tín hiệu huỳnh quang sẽ lắng đọng ở phía dưới lá đặc tương ứng với phía sàn bóng nước [143],[150]. Một đặc điểm hữu ích giúp hỗ trợ phân biệt 2 loại bệnh này là kiểu răng cưa của dải tín hiệu: trong BP, KT lắng đọng trên lá đặc tạo dải hình răng cưa dạng chữ n (n-serrated pattern); còn trong EBA và BSLE, dải tín hiệu lắng đọng dưới lá đặc có dạng chữ u (u-serrated pattern) [44].
Hình 1.20. Kiểu dương tính với IgG khác nhau giữa BP và EBA trên DIF [44]. Dải tín hiệu huỳnh quang hình răng cưa kiểu chữ n trong BP (hình a) và kiểu chữ u
trong EBA (hình b).
Lắng đọng thành dải của C3 có thể đơn độc hoặc kết hợp với các Ig, phải dựa vào loại và kiểu Ig cùng lắng đọng để chẩn đoán. Lắng đọng C3 đơn độc không đặc hiệu để chẩn đoán [44].
Trường hợp chỉ lắng đọng IgA gặp trong LAD và DH [85]. Khi biểu hiện IgA kết hợp với các Ig khác thì không đặc hiệu để chẩn đoán bệnh. IgA lắng đọng dạng hạt ở BMZ tập trung ở nhú bì rất nhạy và đặc hiệu cho chẩn đoán DH [85].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU