2.2.1.Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp mô tả hàng loạt ca.
2.2.2.Cách chọn mẫu nghiên cứu
- Chọn mẫu thuận lợi
- Số mẫu thu thập được: 92 trường hợp
2.2.3.Tiến trình nghiên cứu
Cách thu thập và xử lý dữ liệu
- Thu thập các dữ liệu theo mẫu phiếu thu thập dữ liệu.
- Thu thập các thông tin từ phiếu gởi mẫu xét nghiệm giải phẫu bệnh.
- Thu thập lam nhuộm H&E và hình ảnh vi thể nhuộm DIF đã được lưu trữ hoặc lam nhuộm DIF.
- Đọc tiêu bản nhuộm H&E và hình ảnh nhuộm DIF hoặc đọc trực tiếp tiêu bản nhuộm DIF, chụp và lưu trữ lại các hình ảnh vi thể của tiêu bản H&E và DIF tương ứng.
- Dữ liệu thô được quản lý và mã hoá bằng phần mềm Microsoft Excel, phiên bản 16.16.22.
- Số liệu được trình bày dưới dạng bảng và biểu đồ. Các tỷ lệ và phép so sánh cơ bản được tính toán bằng phần mềm STATA 14.0.
- So sánh chẩn đoán lâm sàng, mô bệnh học và DIF bằng phép kiểm Mc Nemar’s. Đánh giá sự tương hợp chẩn đoán giữa lâm sàng, mô bệnh hoc và DIF phép thống kê Kappa. Các thống kê được thực hiện với độ tin cậy 95%.
Quy trình tiếp nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm
- Nhận mẫu: Mẫu nhuộm H&E để khảo sát mô học cố định trong formol đệm trung tính 10%. Mẫu dùng nhuộm DIFbọc trong gạc tẩm nước muối sinh lý và gởi đến phòng xét nghiệm trong vòng 24 giờ.
- Xử lý:
(1) Mẫu dành cho khảo sát mô học được xử lý theo quy trình nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E):
• Mẫu sinh thiết được cố định trong dung dịch formol đệm trung tính và được xử lý mô bằng máy xử lý mô tự động Medimeas. Tổng thời gian cố định mô từ 6-48 tiếng.
• Mẫu được vùi và đúc trong khối parafin.
• Cắt mỏng mô đã được đúc khối với máy cắt mỏng Microm HM325, độ dày lát cắt 3-5 µm.
• Các lát cắt mô được trải trên lam kính và được nhuộm H&E.
(2)Mẫu dùng nhuộm DIF được vùi và đúc thành khối trong hợp chất OCT và được làm lạnh. Sau đó tiếp tục xử lý theo quy trình nhuộm DIF như sau:
1. Lấy các lát cắt lạnh 4 μm lên lam tĩnh điện, sấy lạnh trong 15 phút.
2. Cố định lát cắt bằng Acetone lạnh (đã bảo quản ở -200C) hoặc paraformaldehyde 4% trong 10 phút ở nhiệt độ 200C.
3. Tăng thấm: Ủ với Phosphate Buffered Saline (PBS) lạnh và Triton X-100 0.1% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Ủ với KT gắn fluorescein isothiocyanate (FITC) trong buồng ẩm ở 40C qua đêm. Các loại kháng thể sử dụng gồm polyclonal rabbit anti-human fibrinogen/FITC, polyclonal rabbit anti-human IgG/FITC, polyclonal rabbit anti-human IgA/FITC, polyclonal rabbit anti- human IgM/FITC và polyclonal rabbit anti -human C3c complement/FITC của hãng Dako.
5. Rửa KT không gắn bằng dung dịch đệm PBS-T(0,3% Triton-X100) trong 5 phút x 1 lần rồi tiếp tục rửa bằng PBS (5 phút x 2 lần)
6. Gắn lamen bằng mounting.
Đánh giá tiêu bản nhuộm H&E và DIF
- Nghiên cứu viên cùng đọc và lý giải tiêu bản H&E và kết quả nhuộm DIF với giảng viên hướng dẫn khoa học.
- Tiêu bản nhuộm H&E của mẫu mô được quan sát và đánh gía bằng kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại x40, x100 và x400.
- Tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp được quan sát và đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại x100 và x400. Hình ảnh vi thể của tiêu bản nhuộm DIF được chụp và lưu trữ trên máy bằng phần mềm ToupView.
Hình 2.1. Các hình ảnh dương tính và âm tính trên DIF
(Hình A: IgG dương tính ở bề mặt TB gai, mẫu B21-02610, CĐXĐ: PV Hình B: IgG dương tính ở BMZ, mẫu B21-22337, CĐXĐ: BP
Hình C: IgA âm tính, mẫu B21-22337, CĐXĐ: BP)
2.3. Các biến số của nghiên cứu
2.3.1.Các biến số nền của mẫu nghiên cứu
(1) Tuổi BN: là biến liên tục. Tuổi = (Năm thực hiện ST tổn thương) – (Năm sinh BN) (2) Giới tính BN: Biến nhị giá, có hai giá trị nam hoặc nữ
(3) Chẩn đoán lâm sàng: biến danh định, là tên loại bệnh được CĐ trên LS.
2.3.2.Các biến số đặc điểm giải phẫu bệnh của tổn thương
(1) Đặc điểm đại thể của tổn thương:
Bảng 2.2. Các biến số về đặc điểm đại thể của tổn thương
Biến số Loại biến Giá trị & định nghĩa
Loại tổn thương da ưu thế
Biến danh định 3 giá trị: bóng nước/mụn nước, vết tích bóng nước trợt/đóng mài, tổn thương khác
Bóng nước/mụn nước: tổn thương da, niêm, bên trong chứa dịch, gồ cao hơn mặt da. Vết tích bóng nước gồm: trợt là tổn thương da do mất một phần hoặc toàn bộ bề dày thượng bì, đóng mài là mảng cứng do huyết thanh, máu hoặc mủ đông tụ và khô lại trên bề mặt Tổn thương khác: hồng ban, đỏ da tróc vảy, sẩn/mảng mề đay,…
Tính chất bóng nước/mụn nước
Sự phân bố tổn thương
Biến danh định 2 giá trị: toàn thân, khu trú
Tình trạng tổn thương niêm mạc
Biến nhị giá 2 giá trị: có tổn thương niêm mạc, không tổn thương niêm mạc.
Sự hiện diện của bóng nước dạng hoa hồng và/ hoặc dấu hiệu chuỗi vòng ngọc
Biến nhị giá 2 giá trị: có hoặc không.
Bóng nước dạng hoa hồng là tổn thương hình tròn hoặc hình cung có vùng trung tâm là chấm vảy hồng ban hoặc vết tích bóng nước với các mụn nước hoặc bóng nước viền xung quanh. Dấu hiệu chuỗi vòng ngọc gồm các mụn nước hoặc bóng nước xếp viền quanh hồng ban trung tâm có bờ tròn hoặc bờ đa cung [116]
(2) Đặc điểm vi thể của tổn thương da trên tiêu bản H&E:
Bảng 2.3. Các biến số về đặc điểm vi thể của tổn thương
Biến số Loại biến Giá trị & định nghĩa
Các đặc điểm tổng quát của bóng nước
Vị trí bóng nước Biến danh định 3 giá trị: trong thượng bì, dưới thượng bì, không quan sát được.
Vị trí bóng nước trong thượng bì (chỉ đánh giá ở bóng nước trong thượng bì)
Biến danh định 3 giá trị: trên lớp đáy, trong lớp hạt hoặc dưới lớp sừng, vị trí khác trong thượng bì
Hiện tượng ly gai ở thượng bì Biến nhị giá 2 giá trị: có ly gai, không ly gai Bóng nước sạch hay bóng
nước viêm (chỉ đánh giá ở bóng nước dưới thượng bì)
Biến nhị giá 2 giá trị:
-Bóng nước sạch: có rất ít hoặc không có TB viêm trong lòng bóng nước và lớp bì kế cận.
-Bóng nước viêm: thấm nhập nhiều TB viêm trong lòng bóng nước và lớp bì kế cận.
Bóng nước đơn ngăn hay đa ngăn (chỉ đánh giá ở bóng nước dưới thượng bì)
Biến nhị giá 2 giá trị: đơn ngăn, đa ngăn
Gọi là bóng nước đa ngăn khi lòng bóng nước có ≥2 ngăn.
Hình ảnh ổ vi áp-xe trong đỉnh nhú bì (chỉ đánh giá ở bóng nước dưới thượng bì)
Biến nhị giá 2 giá trị: có vi áp xe đỉnh nhú bì, không có vi áp xe đỉnh nhú bì
Tình trạng viêm
Loại TB viêm hiện diện Biến nhị giá 2 giá trị: hiện diện hoặc không hiện diện, đánh giá đối với từng loại TB viêm gồm BCĐNTT, BCAT, TB viêm đơn nhân (gồm lymphô bào, tương bào, mô bào)
Loại TB viêm ưu thế Biến danh định Gồm 3 giá trị: BCĐNTT, BCAT, TB viêm đơn nhân
2.3.3.Các biến số về đặc điểm lắng đọng KT trên tiêu bản nhuộm DIF
Bảng 2.4. Các biến số về đặc điểm lắng đọng KT trên DIF
Biến số Loại biến Giá trị & định nghĩa
Loại KT lắng đọng Biến danh định 6 giá trị: IgG, IgA, IgM, C3, fibrinogen, kết hợp nhiều loại
Vị trí lắng đọng KT Biến danh định 4 giá trị: trên bề mặt các TB gai, tại BMZ, vị trí khác (trong lớp bì, trong thành mạch), kết hợp nhiều vị trí
Kiểu lắng đọng Biến danh định 4 giá trị: dải liên tục, dạng hạt, dạng búi, kết hợp nhiều dạng
Kiểu răng cưa của dải tín hiệu IgG (chỉ đánh giá khi IgG dương dạng dải ở BMZ)
Biến danh định 3 giá trị: n-shape, u-shape, không quan sát được
Cường độ IgG so với C3 (đánh giá khi lắng đọng đồng thời 2 loại này ở BMZ)
Biến danh định 3 giá trị: C3 ưu thế, IgG ưu thế, IgG và C3 tương đương nhau
Cường độ IgA so với IgG (đánh giá khi lắng đọng đồng thời 2 loại này ở BMZ hoặc trên bề mặt TB gai)
Biến danh định 3 giá trị: IgA ưu thế, IgG ưu thế, IgA và IgG tương đương nhau
Cường độ tín hiệu ở lớp nông so với lớp sâu của thượng bì
Biến danh định 4 giá trị: ưu thế lớp sâu, ưu thế lớp nông, đồng đều, không đánh giá được
2.3.4.Chẩn đoán trên mô bệnh học
CĐ mô bệnh học được đưa ra từ các đặc điểm thu thập trên tiêu bản H&E, do hạn chế của mô bệnh học trong CĐ chính xác thể bệnh, chúng tôi chỉ đưa ra các nhận định trong các trường hợp điển hình, cụ thể được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.5. Chẩn đoán trên mô bệnh học dựa trên một số tính chất vi thể điển hình
Đặc điểm vi thể trên tiêu bản H&E Chẩn đoán trên tiêu bản H&E
Bóng nước trong thượng bì, trên lớp đáy kèm hiện tượng ly gai thượng bì sâu và/hoặc ly gai nang lông
Phù hợp pemphigus sâu (PV, Pve, PNP, IAP thể SPD)
Bóng nước trong thượng bì, trong lớp hạt hoặc dưới lớp sừng kèm theo ly gai thượng bì nông và/hoặc ly gai nang lông
Phù hợp pemphigus nông (PF, PE, PH, IAP thể IEN)
Bóng nước trong thượng bì không rõ nông hay sâu hoặc không có ly gai
Bóng nước trong thượng bì không rõ loại
Bóng nước dưới thượng bì, đơn ngăn, đường viền nhú bì rõ, có hiện diện BCAT
Phù hợp BP
Bóng nước dưới thượng bì đa ngăn và thấm nhập ưu thế BCĐNTT
Bóng nước dưới thượng bì thấm nhập ưu thế BCĐNTT có vi áp-xe chứa BCĐNTT ở đỉnh nhú bì và mất đường viền nhú bì
Phù hợp DH/BSLE
Bóng nước dưới thượng bì không mang các đặc điểm chẩn đoán phù hợp BP, LAD, DH, BSLE
Bóng nước dưới thượng bì không rõ loại
Trường hợp đặc điểm vi thể trên tiêu bản H&E không đủ để đưa ra chẩn đoán nêu trên thì xếp vào nhóm “không rõ loại” trên mô bệnh học.
2.3.5.Chẩn đoán trên DIF
CĐ trên DIF được đưa ra dựa vào loại KT, vị trí lắng đọng, kiểu lắng đọng và cường độ lắng đọng, cụ thể được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.6. Chẩn đoán dựa trên các đặc điểm DIF
Loại KT Vị trí lắng đọng Kiểu lắng đọng Cường độ lắng đọng Chẩn đoán trên DIF IgG (bắt buộc), có thể kèm C3 Bề mặt TB gai, không kèm ở BMZ Dải liên tục/ hạt mịn Lớp sâu > lớp nông hoặc đồng đều Phù hợp PV/Pve IgG (bắt buộc), có thể kèm C3 Bề mặt TB gai, không kèm ở BMZ Dải liên tục/ hạt mịn Lớp nông > lớp sâu hoặc đồng đều Phù hợp PF IgG (bắt buộc), có thể kèm C3 Bề mặt TB gai và ở BMZ Dải liên tục/ hạt mịn Lớp nông > lớp sâu hoặc đồng đều Phù hợp PNP/PE
IgA (bắt buộc), có thể kèm C3 và/hoặc Ig khác
Bề mặt TB gai Dải liên tục/ hạt mịn - IAP IgG (bắt buộc), có thể kèm C3 và/hoặc Ig khác BMZ Dải liên tục, dạng n-shape C3 ≥ IgG. Nếu IgA(+) thì IgG > IgA Phù hợp BP IgG (bắt buộc), có thể kèm các Ig khác và/hoặc C3. BMZ Dải liên tục, dạng u-shape IgG mạnh hơn C3 Phù hợp EBA/BSLE IgA (bắt buộc), có thể kèm C3 và/hoặc Ig khác BMZ Dải Dải-hạt IgA có cường độ mạnh nhất trong các Ig Phù hợp LAD IgA (bắt buộc) có thể kèm C3 BMZ, tập trung trong đỉnh nhú bì Hạt - DH
Trường hợp các đặc điểm lắng đọng KT không đủ để đưa ra các chẩn đoán như đã nêu thì xếp vào nhóm “không rõ loại” trên DIF.
2.3.6.Chẩn đoán xác định
CĐXĐ là biến danh định, là một trong các loại BDBNTM. CĐXĐ được đưa ra dựa trên sự kết hợp lâm sàng, giải phẫu bệnh và DIF theo các tiêu chuẩn chẩn đoán đã nêu trong phần tiêu chuẩn chọn bệnh (mục 2.1.1)
2.4. Y đức trong nghiên cứu
Đề cương nghiên cứu sẽ được trình cho Hội Đồng Y Đức của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thẩm định, xét duyệt và được thông qua, cho phép nghiên cứu được tiến hành.
Trong quá trình nghiên cứu, tất cả thông tin về BN đều được giữ bí mật. Tất cả bệnh phẩm được xử lý theo quy trình an toàn sinh học. Đồng thời, nghiên cứu được thực hiện trên các tiêu bản, không gây ảnh hưởng đến BN. Sau cùng, tất cả các kết quả nghiên cứu không sử dụng cho bất kỳ mục đích thương mại nào.
2.5. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ Môn Mô Phôi - Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 09/2020 đến tháng 09/2021.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Qua khảo sát 92 ca BDBNTM được CĐXĐ dựa trên các dữ liệu lâm sàng, hình thái tổn thương trên tiêu bản H&E và kết quả nhuộm DIF, chúng tôi có được những kết quả như sau
3.1. Một số đặc điểm lâm sàng của các bệnh da bóng nước tự miễn 3.1.1.Tỷ lệ và số lượng của các BDBNTM 3.1.1.Tỷ lệ và số lượng của các BDBNTM
Từ tháng 09/2019 đến tháng 7/2021 có 92 ca được CĐXĐ BDBNTM tại bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Tp HCM được chọn vào nghiên cứu. Nhóm pemphigus gồm 55 ca (59,78%), nhóm pemphigoid gồm 36 ca (chiếm 39,13%), chỉ ghi nhận duy nhất 1 trường hợp DH (1,09%).
Biểu đồ 3.1. Phân bố tỷ lệ 3 nhóm BDBNTM
Ghi nhận 3 loại bệnh nhóm pemphigus là PV, PF và IAP; trong đó, PV chiếm ưu thế với 41 ca (chiếm 74,55%). Không ghi nhận các bệnh PVe, PE, EPF, PNP, PH, DIP trong nhóm pemphigus.
Bảng 3.1. Phân bố các BDBNTM trong thượng bì
Loại bệnh Số lượng (N) Tỷ lệ (%) PV 41 74,54 59.78% 39.13% 1.09% Nhóm pemphigus Nhóm pemphigoid DH
PF 13 23,64
IAP 1 1,82
Tổng 55 100
Ghi nhận 3 loại bệnh nhóm pemphigoid là BP, LAD và BSLE, trong đó, BP chiếm ưu thế với 27 ca (chiếm 75%). Không ghi nhận các bệnh MMP, PG, EBA trong nhóm pemphigoid.
Bảng 3.2. Phân bố các BDBNTM dưới thượng bì
Loại bệnh Số lượng (N) Tỷ lệ (%) BP 27 72,97 LAD 8 21,62 BSLE 1 2,70 DH 1 2,70 Tổng 37 100
3.1.2.Giới tính của bệnh nhân
Trong 55 ca BDBNTM trong thượng bì, có 39 BN nữ và 16 BN nam, tỷ lệ nữ : nam = 2,44 : 1. Trong 37 ca BDBNTM dưới thượng bì, có 18 BN nữ và 19 BN nam, tỷ lệ nữ : nam = 0,95 : 1. Trong đó nhóm bệnh BP có tỷ lệ nữ : nam = 0,93:1. Nhóm bệnh LAD có tỷ lệ nữ : nam = 1:1. Trường hợp BSLE ghi nhận ở BN nữ. Trường hợp DH xảy ra ở BN nam.
3.1.3.Tuổi của bệnh nhân
Các trường hợp BDBNTM trong thượng bì có phổ tuổi từ 11 đến 82. Trong đó, có 2 trường hợp nhỏ tuổi nhất (11 tuổi) được chẩn đoán PV và IAP, trường hợp lớn tuổi nhất (82 tuổi) được chẩn đoán PF. Tuổi trung bình của nhóm pemphigus là 51,98 26,40. 36/55 ca pemphigus thuộc nhóm tuổi 30-59 (chiếm tỷ lệ 65,45%). Trong đó có 28/41 ca PV (68,29%) và 8/13 ca PF (61,54%) thuộc nhóm tuổi này.
Biểu đồ 3.2. Phân bố theo độ tuổi của nhóm bệnh pemphigus
Các trường hợp BP có phổ tuổi từ 10 đến 95 với tuổi trung vị là 65. Trong 27 ca BP, 17 ca thuộc nhóm ≥ 60 tuổi (chiếm 62,96% các trường hợp BP), có 3 BN ≥ 90 tuổi (chiếm 11,11%), có 1 trường hợp BP trẻ em (10 tuổi) và 2 trường hợp BP ở người trẻ (25 tuổi và 33 tuổi).
Biểu đồ 3.3. Phân bố theo độ tuổi của BP
7.27% 65.46% 27.27% < 30 tuổi 30-59 tuổi ≥ 60 tuổi 37.04% 62.96% <60 tuổi ≥ 60 tuổi
Các trường hợp LAD có phổ tuổi từ 14 đến 72, tuổi trung vị là 33,5. Trong đó có 3/8 (37,5%) trường hợp ở độ tuổi 18, 1 trường hợp ở người trưởng thành trẻ (22 tuổi), 3 trường hợp trung niên (45, 48 và 56 tuổi) và 1 trường hợp người già (72 tuổi)
Biểu đồ 3.4. Phân bố theo độ tuổi của LAD