Một bộ xét nghiệm ELISA có thể phát hiện được tất cả các loại nọc rắn độc giúp chẩn đoán phân biệt được tất cả các loài rắn độc có thể gây ra tai nạn rắn cắn trên lâm sàng là hoàn hảo nhất, nhưng điều này rất khó thực hiện và vô cùng tốn kém. Thực tế trên lâm sàng, chỉ có một số loài rắn độc thường gặp và có tỷ lệ gây ra tai nạn rắn cắn cao đó là: rắn lục xanh và rắn hổ đất. Việc phát triển bộ xét nghiệm ELISA giúp chẩn đoán phân biệt được những loài rắn độc phổ biến và có tỷ lệ gây ra tai nạn rắn cắn cao trên lâm sàng không chỉ đáp ứng được yêu cầu thực tiễn mà còn dễ thực hiện trong điều kiện ở Việt Nam.
1.3.2. Một số thiết kế xét nghiệm ELISA được ứng dụng trong chế tạo bộxét nghiệm phát hiện nọc rắn độc xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc
- Nguyên lý chung của xét nghiệm ELISA: là dùng kháng nguyên hoặc kháng thể đánh dấu để phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể qua chất chỉ thị màu.
Để phát hiện kháng thể đặc hiệu người ta sử dụng kỹ thuật ELISA gián tiếp (indirect ELISA) và để phát hiện kháng nguyên người ta sử dụng kỹ thuật ELISA sandwich [28].
Xét nghiệm ELISA gián tiếp (indirect ELISA) để phát hiện kháng thể đặc hiệu là kỹ thuật mà người ta sử dụng các phân tử kháng nguyên đã biết gắn vào các giếng xét nghiệm để phát hiện kháng thể đặc hiệu tương ứng . Cường độ màu đo được tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể đặc hiệu có trong mẫu thử [93]. Lê Văn Đông và CS (2003) đã sử dụng kỹ thuật ELISA gián tiếp để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng lại nọc của 4 loài rắn độc: lục xanh, chàm quạp, hổ chúa và hổ đất trong huyết thanh thỏ được gây miễn dịch [80].
Xét nghiệm ELISA sandwich là kỹ thuật sử dụng kháng thể đặc hiệu đã biết gắn vào giếng xét nghiệm để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu thông qua phức hợp kháng thể bắt giữ (capture antibody) - kháng nguyên (antigen) – kháng thể phát hiện (detecting antibody) hoặc cộng hợp kháng thể phát hiện. Cường độ màu đo được tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên có trong mẫu thử. Có nhiều phương án thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich phát hiện kháng nguyên.
- Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 2 kháng thể
Các xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 2 kháng thể bao gồm 1 kháng thể gắn bản (capture antibody) và 1 kháng thể phát hiện. Tùy thuộc vào kháng thể phát hiện gắn enzyme hay gắn biotin mà ta có thiết kế xét nghiệm khác nhau (hình 1.8).
Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich AbE (antibody enzyme): bao gồm một kháng thể gắn bản, một kháng thể phát hiện gắn enzyme và cơ chất phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể (hình 1.8.A). Đây là thiết kế xét nghiệm rút ngắn được thời gian tiến hành phản ứng ELISA so với các thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich khác, nhưng kỹ thuật gắn enzyme vào kháng thể
lại rất phức tạp, khó thực hiện và độ nhạy phát hiện kháng nguyên không cao. Thiết kế xét nghiệm này đã được Howard và CS (1982) ứng dụng chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc của 5 loài rắn độc phổ biến ở Úc. Kết quả độ nhạy phát hiện nọc rắn độc là 15 ng/ml và tổng thời gian xét nghiệm khoảng 40 phút [53]. Sau đó vào năm 1992, John Cox và cộng sự cũng sử dụng chính thiết kế này để chế tạo lại bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc của 5 loài rắn độc nói trên. Bộ xét nghiệm này chỉ chứng minh được hiệu quả phân biệt nọc của các loài rắn nói trên trong khoảng nồng độ dao động từ 10 – 40 ng/ml, ngoài khoảng nồng độ trên xét nghiệm có phản ứng chéo với một số loại nọc rắn độc khác [60].
Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich avidin-biotin (AB-ELISA): bao gồm một kháng thể gắn bản, một kháng thể phát hiện gắn biotin, cộng hợp HRP gắn avidin (horseradish peroxidase - avidin) và cơ chất phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể (hình 1.8.B). Như vậy, so với thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich AbE (2 kháng thể) thì xét nghiệm AB-ELISA cần nhiều hơn 1 bước trong quá trình tiến hành thực hiện phản ứng ELISA. Việc gắn biotin vào kháng thể trong thiết kế xét nghiệm này dễ thực hiện hơn so với gắn enzyme vào kháng thể. Do một phân tử avidin có thể gắn với nhiều phân tử HRP nên khi avidin gắn biotin sẽ làm khuếch đại tín hiệu của phản ứng ELISA và làm tăng độ nhạy phát hiện kháng nguyên của xét nghiệm AB- ELISA. Thiết kế xét nghiệm này đã được nhiều tác giả ứng dụng trong chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc. Anindya Kanti De (1996) đã ứng dụng thiết kế xét nghiệm này chế tạo thành công bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc của 4 loài rắn độc ở Ấn Độ với độ nhạy phát hiện ở mức 1 ng/ml. Bộ xét nghiệm này đã chứng minh được hiệu quả phát hiện nọc rắn độc trong các mẫu bệnh phẩm của 27 bệnh nhân bị rắn độc cắn [15]. Ernesto Amuy và cộng sự (1997) cũng đã phát triển xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc dựa trên thiết kế xét nghiệm này với độ nhạy phát hiện là 4 ng/ml [46]. Tại
Singapore, Lê Văn Đông và công sự (2003) đã sử dụng thiết kế xét nghiệm này chế tạo thành công bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc của 4 loài rắn độc thường gặp ở Miền nam, Việt Nam đó là: rắn lục xanh, rắn hổ đất, rắn chàm quạp và rắn hổ chúa với độ nhạy phát hiện từ 0,4 đến 1,6 ng/ml tùy thuộc vào loại nọc rắn độc [80]. Tuy nhiên, để ứng dụng trong chẩn đoán xác định loài rắn độc cắn ở Việt Nam, thì bộ xét nghiệm này cần phải tiếp tục được chế tạo và đánh giá độ ổn định trước khi tiến hành thử nghiệm phát hiện nọc rắn độc trên lâm sàng.
Hình 1.8. Kỹ thuật ELISA sandwich (sử dụng 2 kháng thể)
*Nguồn: theo Coligan John (2005)[28].
- Thiết kế xét nghiệm ELISA sandwich sử dụng mô hình 3 kháng thể
Thiết kế xét nghiệm AbE-ELISA sandwich sử dụng mô hình 3 kháng thể bao gồm: một kháng thể gắn bản, kháng thể phát hiện là kháng thể đặc hiệu kháng nguyên nhưng có nguồn gốc sản xuất khác với kháng thể gắn bản. Cộng hợp HRP-kháng thể kháng lại kháng thể phát hiện và cơ chất dùng để
phát hiện phức hợp kháng nguyên kháng thể (hình 1.9). So với thiết kế xét nghiệm AB-ELISA thì hai thiết kế xét nghiệm này có tổng số bước tiến hành xét nghiệm như nhau. Tuy nhiên, đây là thiết kế xét nghiệm mà kháng thể phát hiện không phải xử lý gắn enzyme hay gắn biotin nên sẽ có độ ổn định và hiệu giá tốt hơn so với kháng thể phát hiện sử dụng trong các thiết kế nghiên cứu nói trên. Cộng hợp HRP-kháng thể kháng kháng thể phát hiện có thể được cung cấp dưới dạng thương phẩm nên có tính đặc hiệu và độ ổn định cao hơn.
Hình 1.9. Kỹ thuật ELISA sandwich (sử dụng 3 kháng thể)
*Nguồn: theo Coligan John (2005)[28].
Abdul và cộng sự (1993) là người đầu tiên sử dụng thiết kế xét nghiệm này trong chế tạo bộ xét nghiệm ELISA huỳnh quang phát hiện nọc rắn lục
russelli. Bộ xét nghiệm do Abdul và cộng sự chế tạo sử dụng huyết thanh ngựa kháng nọc rắn lục russelli thương phẩm làm kháng thể bắt giữ. Kháng
thể phát hiện là kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn lục russelli được tạo ra bằng cách gây miễn dịch trên thỏ với kháng nguyên nọc rắn độc này. Cộng hợp HRP- kháng thể thứ ba là kháng thể dê gắn enzyme kháng IgG thỏ. Bộ xét nghiệm này có độ nhạy phát hiện nọc rắn lục russelli rất tốt ở mức 0,1 pg/ml [13]. Selvanayagam và cộng sự (1999) đã chế tạo thành công bộ xét nghiệm AbE-ELISA (3 kháng thể: kháng thể dê gắn bản, kháng thể phát hiện có nguồn gốc từ thỏ và cộng hợp HRP-kháng thể dê kháng IgG thỏ). Bộ xét nghiệm này đã chứng minh hiệu quả phát hiện nọc của loài rắn hổ carinatus
với độ nhạy phát hiện ở mức 2,5 ng/ml [44]. Hong Dong-Zong (2003) đã ứng dụng thiết kế xét nghiệm này chế tạo thành công bộ xét nghiệm AbE-ELISA (3 kháng thể) phát hiện nọc rắn N. Atra ở Đài Loan với độ nhạy phát hiện ở mức 1 ng/ml [56]. Với thiết kế xét nghiệm ELISA này, chúng ta có thể ứng dụng phát triển bộ xét nghiệm mới phát hiện nọc rắn độc trong điều kiện thực tiễn ở Việt Nam đó là: sử dụng các nguyên liệu thương phẩm sẵn có như huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh và hổ đất đã chứng minh được hiệu quả điều trị trên lâm sàng dùng làm kháng thể bắt giữ kháng nguyên (capture antibody) như trong nghiên cứu của Abdul. Sử dụng kháng thể phát hiện là kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn và cộng hợp HRP-kháng thể là HRP gắn kháng thể chuột kháng IgG thỏ thương phẩm do hãng Sigma cung cấp [56].
- Cơ chất sử dụng trong xét nghiệm ELISA
Cơ chất thường được sử dụng trong phản ứng ELISA là O- phenylenediamine (OPD), loại cơ chất này thường bền ở dạng tinh thể nếu được bảo quản trong lọ tránh ánh sáng ở nhiệt độ 4-80C. Khi phản ứng với enzyme thì cơ chất này từ không màu chuyển sang màu vàng và chúng ta dễ dàng nhận biết được bằng mắt thường. Một loại cơ chất khác cũng được sử dụng trong phản ứng ELISA đó là Tetramethylbenzidine (TMB), đây là loại cơ chất thường được cung cấp từ các nhà sản xuất ở dạng dung dịch không
màu. Khi phản ứng với enzyme thì cơ chất này từ không màu chuyển thành màu xanh dương.