ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.7.4. Tối ưu hóa xét nghiệm AbE-ELISA
Việc tối ưu hoá các điều kiện phản ứng của xét nghiệm AbE-ELISA được tiến hành bằng cách thử riêng rẽ từng điều kiện trong khi giữ các điều kiện khác hằng định, cụ thể như sau:
- Nồng độ kháng thể ngựa (kháng thể bắt giữ):được khảo sát với các nồng độ 2,5 và 5,0µg/ml.
- Nồng độ dung dịch BSA dùng để che phủ các vị trí không có kháng thể gắn lên giếng:sử dụng BSA nồng độ 1,0 %. ủ trong thời gian 60 phút ở 370C theo nghiên cứu của Lê Văn Đông và cộng sự (2003) [80].
- Kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn lục xanh và hổ đất (kháng thể phát hiện):các nồng độ khảo sát gồm 1,0 và 2,0µg/ml.
- Cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ: sinh phẩm do hãng Sigma, Mỹ cung cấp được nhà sản xuất khuyến cáo pha loãng 1/20.000 cho các phản ứng trong xét nghiệm ELISA. Mức độ pha loãng cộng hợp kháng thể được khảo sát ở các độ pha loãng là 1/10.000 và 1/20.000.
- Nồng độ cơ chất: sử dụng nồng độ 0,5 mg/ml OPD pha trong đệm citrate có bổ xung 0,006% H2O2theo nhiều nghiên cứu đã công bố [80]
- Thời gian ủ mẫu:Các bước ủ cho phản ứng kháng nguyên-kháng thể diễn ra (bước ủ mẫu xét nghiệm với kháng thể thứ nhất và bước ủ kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn) được áp dụng theo nghiên cứu của Lê Văn Đông và cộng sự năm 2003 là 15 phút [80].
- Thời gian ủ cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ: áp dụng là 5 phút theo nghiên cứu của Lê Văn Đông và cộng sự năm 2003 [80].
- Thời gian ủ cơ chất màu: khảo sát ở thời gian sau 5 phút và 10 phút.
- Nhiệt độ: áp dụng là 370C theo nghiên cứu của Lê Văn Đông và cộng sự năm 2003 [80].