ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.7.3. Qui trình xét nghiệm AbE-ELISA
- Bước 2: cho 100 µl mẫu thử (máu toàn phần có chống đông, huyết tương, huyết thanh, nước tiểu...) vào mỗi giếng từ C đến H, hai giếng đối chứng cho dung dịch kháng nguyên chuẩn (hỗn hợp kháng nguyên nọc rắn của 2 loài nồng độ 50 ng/ml trong PBS). Ủ 37oC trong 15 phút.
- Bước 3: rửa ít nhất 5 lần tất cả các giếng xét nghiệm bằng dung dịch rửa. - Bước 4: cho kháng thể IgG thỏ đặc hiệu loài rắn vào các giếng từ A đến H
tương ứng với kháng thể ngựa đặc hiệu loài đã gắn sẵn trên giếng. Riêng giếng đối chứng âm và đối chứng dương cho hỗn hợp của 2 kháng thể đặc hiệu. Ủ 37°C trong 15 phút.
- Bước 5: lặp lại bước 3.
- Bước 6: cho thêm 100 µl cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ vào các giếng. Ủ 37°C trong 5 phút.
- Bước 7: lặp lại như bước 3.
- Bước 8: Thêm cơ chất màu. Mỗi giếng 100 µl cơ chất OPD nồng độ 0,5 mg/ml có bổ sung thêm 0,006% H2O2. Đọc kết quả sau 5 phút, quan sát sự chuyển màu của cơ chất từ không màu chuyển sang màu vàng bằng mắt thường và đo mật độ quang học ở bước sóng 450nm bằng hệ thống DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ).
Nhận định kết quả: Xét nghiệm được coi là có giá trị khi giếng đối chứng dương cho màu vàng rõ, giếng đối chứng âm không lên màu.
- Nếu có một hoặc nhiều giếng từ C đến H cho kết quả dương tính, tên của nọc rắn độc tương ứng với loại kháng thể đã gắn bản trên giếng đó. Trong đó, các giếng C, E, G tương tứng với rắn lục xanh; D, F, H tương ứng với rắn hổ đất.
- Nếu tất cả các giếng từ C đến H đều cho kết quả âm tính thì có 3 khả năng: o Mẫu xét nghiệm có nọc độc của 1 trong 2 loài rắn nghiên cứu nhưng
o Mẫu xét nghiệm có chứa nọc độc của loài rắn nào đó không thuộc 2 loài rắn đang nghiên cứu.
o Mẫu xét nghiệm không có nọc rắn độc.
- Đo mật độ quang học thì xác định giá trị ngưỡng (cut off values) của xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn dựa vào OD của chứng âm [62].
o Xét nghiệm dương tính khi: ODmẫu> XOD chứng âm + 3SD o Xét nghiệm âm tính khi: ODmẫu ≤ XOD chứng âm+ 3SD o Chỉ công nhận kết quả ELISA khi:
* Giá trị OD của giếng chứng âm dao động trong khoảng: 0,010 – 0,099, tức là giá trị nền của kỹ thuật ELISA rất thấp
*Giá trị: ODchứng dương / OD chứng âm ≥ 3