ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.6.3. Qui trình xét nghiệm AB-ELISA
- Bước 1: bộ xét nghiệm AB-ELISA được gắn trên giá đỡ.
- Bước 2: cho 100 µl mẫu thử (máu toàn phần, huyết tương, huyết thanh, nước tiểu, dịch vết cắn...) vào mỗi giếng từ D đến G, hai giếng đối chứng cho dung dịch kháng nguyên chuẩn (hỗn hợp kháng nguyên nọc rắn của 4 loài nồng độ 50 ng/ml trong PBS). Ủ 37oC trong 15 phút.
- Bước 3: rửa ít nhất 5 lần tất cả các giếng xét nghiệm bằng dung dịch rửa. - Bước 4: cho thêm 100 µl kháng thể đặc hiệu loài đã gắn biotin vào các
giếng tương ứng với kháng thể đặc hiệu loài đã gắn sẵn trên giếng. Riêng giếng đối chứng âm và đối chứng dương cho hỗn hợp của 4 kháng thể đặc hiệu gắn biotin. Ủ 37oC trong 15 phút.
- Bước 5: lặp lại bước 3.
- Bước 6: cho thêm 100 µl cộng hợp HRP-avidin vào mối giếng. Ủ 37 o C trong 5 phút.
- Bước 8: cho thêm vào mỗi giếng 100 µl cơ chất OPD nồng độ 0,5 mg/ml có bổ xung thêm 0,006 % H2O2. Đọc kết quả sau 5 phút, quan sát sự chuyển màu của cơ chất từ không màu chuyển sang màu vàng bằng mắt thường và đo mật độ quang học ở bước sóng 450nm bằng hệ thống DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ).
Nhận định kết quả: Xét nghiệm được coi là có giá trị khi giếng chứng dương (giếng B) cho màu vàng rõ, giếng chứng âm (giếng C) không lên màu hoặc có màu vàng nhạt. Kết quả được nhận định như sau:
- Nếu chỉ 1 trong 4 giếng từ D đến G cho màu vàng rõ rệt còn các giếng khác không màu hoặc màu nhạt thì mẫu xét nghiệm trong giếng có chứa nọc rắn tương ứng với kháng thể đặc hiệu loài rắn đã gắn trên giếng đó:
o Giếng D: rắn hổ chúa o Giếng E: rắn hổ đất o Giếng F: rắn chàm quạp o Giếng G: rắn lục xanh
- Nếu có nhiều hơn 1 giếng trong 4 giếng từ D đến G cho màu vàng: giếng nào cho màu rõ nhất chứa nọc rắn tương ứng với kháng thể đặc hiệu loài đã gắn trên giếng đó.
- Không có giếng nào từ giếng D đến giếng G lên màu thì có 3 khả năng: o Mẫu xét nghiệm có nọc độc của 1 trong 4 loài rắn nhưng nồng độ
quá thấp dưới ngưỡng nhận biết của xét nghiệm.
o Mẫu xét nghiệm có chứa nọc độc của loài rắn nào đó không thuộc vào 1 trong 4 loài rắn đang nghiên cứu.
o Mẫu xét nghiệm không có nọc rắn độc.
- Đo mật độ quang học và xác định giá trị ngưỡng (cut off values) của xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc rắn dựa vào OD của chứng âm [62].
o Xét nghiệm dương tính khi: ODmẫu> XOD chứng âm + 3SD o Xét nghiệm âm tính khi: ODmẫu ≤ XOD chứng âm + 3SD
o Chỉ công nhận kết quả ELISA khi:
* Giá trị OD của giếng chứng âm dao động trong khoảng: 0,010 – 0,099, tức là giá trị nền của kỹ thuật ELISA rất thấp.
*Giá trị: ODchứng dương / OD chứng âm ≥ 3