KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.2.1.Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và hổ đất
LOÀI RẮN LỤC XANH VÀ HỔ ĐẤT
4.2.1. Bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn lụcxanh và hổ đất xanh và hổ đất
Bộ xét nghiệm AbE-ELISA cũng được chế tạo bằng những vật liệu được sử dụng tương tự trong bộ xét nghiệm AB-ELISA (hình 3.4). Tuy nhiên, đây là bộ xét nghiệm chỉ có khả năng phát hiện đồng thời hai loại nọc rắn độc đó là lục xanh và hổ đất chứ không phải bốn loại nọc rắn độc như bộ xét nghiệm AB-ELISA. Đây là bộ xét nghiệm được thiết kế dựa trên nguyên lý ELISA sandwich (3 kháng thể). Trong đó, chúng tôi sử dụng kháng thể gắn bản là kháng thể ngựa có trong huyết thanh kháng nọc rắn thương phẩm đang được sử dụng trên lâm sàng do IVAC sản xuất. Kháng thể phát hiện là kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn sau tinh sạch và cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ.
Mô hình xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc rắn trong nghiên cứu này phù hợp với mô hình xét nghiệm ELISA sandwich 3 kháng thể của Abdul (1993); Selvanayagam (1999) và Hung Dong - Zong (2003) [13], [44], [56]. Tuy nhiên, kháng thể gắn bản trong nghiên cứu của Selvanayagam và Hung đều ở dạng phân tử IgG nguyên vẹn, còn trong nghiên cứu của chúng tôi kháng thể gắn bản không phải là phân tử IgG nguyên vẹn mà có thể ở dạng phân tử F(ab’)2. Bởi vì, khi tiến hành điện di protein có trong huyết thanh kháng nọc rắn do IVAC sản xuất, không thấy xuất hiện protein có trọng lượng phân tử khoảng 150.000 Dalton (tương đương với trọng lượng phân tử IgG nguyên vẹn) mà chỉ xuất hiện protein có trọng lượng phân tử khoảng 100.000 Dalton (tương đương trọng lượng phân tử F(ab’)2). Lần đầu tiên tại Việt Nam, công trình nghiên cứu đã sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn thương phẩm làm nguyên liệu trong chế tạo bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc. Đây là tính mới trong nghiên cứu này so với các nghiên cứu khác, huyết thanh
kháng nọc rắn do IVAC sản xuất đã chứng minh được hiệu quả điều trị đặc hiệu nhiễm độc rắn cắn trên lâm sàng, chứng tỏ các phân tử kháng thể có trong kháng huyết thanh do IVAC sản xuất phải bắt giữ được các kháng nguyên nọc rắn đặc hiệu. Đó là lý do nghiên cứu này chọn kháng thể có trong huyết thanh do IVAC sản xuất làm kháng thể gắn bản.
Để làm tăng độ nhạy phát hiện nọc rắn và độ ổn định của bộ xét nghiệm AbE-ELISA, đề tài đã lựa chọn kháng thể phát hiện là kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn sau tinh sạch và sử dụng cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ. Trong đó, phân tử kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn ở dạng nguyên vẹn không gắn biotin hoặc enzyme nên sẽ giữ được hiệu giá kháng thể và có độ ổn định cao. Cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ có độ nhạy và độ đặc hiệu cao với chuỗi nặng của phân tử IgG thỏ nên sẽ làm tăng độ nhạy cho phản ứng ELISA, bởi vì một phân tử kháng thể phát hiện có thể được gắn với nhiều cộng hợp HRP-kháng thể chuột nên làm khuếch đại tín hiệu của phản ứng ELISA.
4.2.2. Điều kiện tối ưu của phản ứng AbE-ELISA
Nồng độ kháng thể ngựa gắn lên giếng xét nghiệm tối ưu cho phản ứng ELISA theo kết quả nghiên cứu này là 5,0 µg/ml (bảng 3.2). Kết quả này phù hợp với kết quả của Quangzhi Li và cs (1994) và Selvanayagam (1999) nhưng lại cao hơn kết quả của Cox (1992) và Lê Văn Đông (2003) là 2,0 µg/ml [44], [60], [80], [81].
Nồng độ dung dịch BSA dùng để che phủ các vị trí không có kháng thể gắn lên giếng được áp dụng trong nghiên cứu này là: BSA 1%, ủ ở 370C trong 1 giờ theo Lê Văn Đông và cs (2003) [80]. Tuy nhiên, Ernesto Amuy (1997) thấy rằng BSA 2% pha trong dung dịch PBS-T ủ 37oC trong 15 phút cho hiệu quả che phủ tốt nhất [46]. Selvanayagam (1999) không sử dụng BSA mà sử dụng huyết thanh dê ở nồng độ 2% pha trong dung dịch PBS-T ủ ở 37o C
trong 1 giờ [44]. Các tác giả khác là O’leary (2006); Kulawickrama (2010) lại chỉ sử dụng 0,5 % BSA trong dung dịch PBS-T ở 37oC trong 1 giờ để che phủ những vị trí kháng thể không gắn bản [75], [82]. Như vậy, theo hầu hết các tác giả thì BSA vẫn là chất được sử dụng nhiều nhất để che phủ những vị trí kháng thể không gắn bản, trong điều kiện ủ 370C và thời gian ủ là 1 giờ.
Kết quả xác định nồng độ tối ưu của kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn lục xanh và hổ đất (kháng thể phát hiện) trong nghiên cứu này là 2,0 µg/ml (bảng 3.3). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê Văn Đông và cộng sự (2003) [80]. Theo Kulawickrama (2010) thì kết quả này chỉ là 1,5 µg/ml [75].
Cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ với độ pha loãng 1/10.000 được lựa chọn tối ưu trong nghiên cứu này.Theo khuyến cáo của nhà sản xuất thì độ pha loãng sử dụng trong các phản ứng ELISA có thể là 1/20.000. Tuy nhiên, qua nghiên cứu tôi thấy trong cùng điều kiện phản ứng, sử dụng cộng hợp HRP-kháng thể chuột kháng IgG thỏ pha loãng 1/10.000 cho phản ứng màu rõ nét hơn (giá trị OD đo được cao hơn) so với sử dụng độ pha loãng 1/20.000 theo khuyến cáo của nhà sản xuất (bảng 3.4). Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Selvanayagam (1999) lại cần nồng độ kháng thể kháng IgG thỏ gắn HRP cao hơn ở độ pha loãng 1/2.000 [44]. Theo Hung Dong-Zong và cộng sự (2003) thì nồng độ kháng thể kháng IgG thỏ gắn HRP này là 0,25 µg/ml [56].
Cơ chất được chúng tôi sử dụng là OPD với nồng độ 0,5 mg/ml pha trong đệm citrate có bổ xung 0,006% H2O2 theo Lê Văn Đông và cs (2003) [80]. Đây cũng là loại cơ chất được sử dụng trong nghiên cứu của Ernesto (1997), nhưng ở nồng độ cao hơn là 1 mg/ml [46]. Tuy nhiên một số tác giả khác lại sử dụng TMB (tetramethyl benzidine) làm cơ chất như Cox (1992); O’leary (2006) và Kulawickrama (2010) [60], [75], [82].
Thời gian ủ cơ chất màu theo nghiên cứu của chúng tôi chỉ cần 5 phút để có được độ tương phản rõ nét giữa chứng âm và chứng dương đồng thời không bị tín hiệu nền cao (bảng 3.5). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả như Selvanayagam (1999); Lê Văn Đông (2003) và Kulawickrama (2010) [44], [75], [80].