KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. BỘ XÉT NGHIỆM AB-ELISA PHÁT HIỆN NỌC ĐỘC CỦA 4 LOÀI RẮN LỤC XANH, HỔ ĐẤT, CHÀM QUẠP VÀ HỔ CHÚA
LOÀI RẮN LỤC XANH, HỔ ĐẤT, CHÀM QUẠP VÀ HỔ CHÚA
4.1.1. Bốn loại kháng thể thỏ đặc hiệu loài rắn dùng trong bộ xét nghiệmAB-ELISA AB-ELISA
4.1.1.1 Hiệu giá kháng thể của 4 loại huyết thanh thỏ kháng nọc rắn
Hiệu giá kháng thể của 4 loại huyết thanh thỏ kháng nọc rắn phụ thuộc vào loại kháng nguyên, cách gây miễn dịch và đáp ứng của động vật được gây miễn dịch. Biến động hiệu giá kháng thể (biểu đồ 3.1) chứng tỏ kháng nguyên nọc rắn độc toàn thể có phối trộn với tá chất Freund có tính sinh miễn dịch tốt và tính kháng nguyên cao. Chúng tôi đã sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh cho lần gây miễn dịch đầu tiên và từ lần gây miễn dịch thứ hai trở đi sử dụng tá chất Freund không hoàn chỉnh. Cách phối hợp tá chất này của chúng tôi phù hợp với các tác giả Anindya Kanti De (1996) khi phát triển kít xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán xác định loài rắn cắn ở Ấn Độ [15]. Lê Văn Đông (2003) cũng sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh và tá chất Freund không hoàn chỉnh trong việc tạo ra các sản phẩm kháng nguyên nọc rắn, gây miễn dịch trên thỏ tạo ra kháng thể kháng nọc rắn [80]. Tuy nhiên trong một nghiên cứu khác của Arun Waghmare và cộng sự (2009) lại thấy rằng sử dụng tá chất IMS 3012 ở lần tiêm đầu tiên cũng mang lại hiệu quả trong việc tạo kháng thể kháng nọc rắn [18]. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nọc rắn độc toàn thể để chế tạo kháng nguyên chứ không phải độc tố đơn thành phần myotoxin như nghiên cứu của Quanzhi Li và cs (1994) hoặc độc tố đơn thành phần Ammodytoxin từ loài rắn lục trong nghiên cứu của Beata Halassy và cs (2010) [19], [20], [81]. Chúng tôi cũng không sử dụng
nọc độc giảm độc lực bằng nhiệt làm kháng nguyên theo khuyến cáo của Ya Tang và cộng sự (2010) [122].
Cách gây miễn dịch được sử dụng trong nghiên cứu này đó là: tiêm dưới da, liều thấp, thể tích nhỏ, nhiều vị trí và tiêm nhắc lại nhiều lần. Cách gây miễn dịch này giúp cho các tế bào miễn dịch được tiếp xúc nhiều hơn với kháng nguyên, thời gian tiếp xúc kháng nguyên dài hơn và kích thích thỏ sinh kháng thể tốt hơn. Đây là cách gây miễn dịch đã được nhiều tác giả áp dụng như Charoonjoi Chotwiwatthanakun và cộng sự (2001), Supod Sriprapat và cộng sự (2003), El-Kady và cộng sự (2009) và Kavi Ratanabanangkoon (2010) [31], [43], [71], [109]. Bằng cách gây miễn dịch này, chúng tôi đã tạo ra huyết thanh thỏ kháng nọc rắn ngay sau lần gây miễn dịch (lần tiêm) thứ hai và có hiệu giá cao từ 128.000 đến 256.000 chỉ sau 4 đến 5 lần gây miễn dịch (biểu đồ 3.2). Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lê Văn Đông và cộng sự (2003) [80].
Thỏ là động vật được sử dụng để chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn vì: thứ nhất, mục đích của việc chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp và hổ chúa trong nghiên cứu này để làm nguyên liệu sản xuất bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn, do vậy với lượng máu toàn phần thu được từ 40 – 60 ml trên một thỏ (20 – 30 ml huyết thanh) đảm bảo đủ lượng kháng thể cần thiết cho nghiên cứu. Thứ hai là đáp ứng miễn dịch của thỏ với kháng nguyên nọc rắn rất tốt, điều này đã được chứng minh trong các công trình nghiên cứu của Anindya Kanti De (1996); Lê Văn Đông và cộng sự (2003) [15], [80]. Thứ ba đó là việc chăm sóc thỏ, thực hiện gây miễn dịch và thu thập máu sau các lần gây miễn dịch rất thuận tiện.
4.1.1.2. Phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc hiệu vànọc của các loài rắn khác nọc của các loài rắn khác
Huyết thanh thỏ kháng nọc rắn đơn đặc hiệu do chúng tôi tạo ra có phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn của loài rắn này với nọc độc của 3 loài rắn kia trong số 4 loài rắn nghiên cứu (biểu đồ 3.3). Kết quả này phù hợp với nhiều công trình nghiên cứu khác đã công bố như : Theakston và cs (1995) khi nghiên cứu lựa chọn HTKNR trong điều trị tại Ecuador ; Binie Lipps và cs (2000) khi nghiên cứu phản ứng trung hòa chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu loài này với nọc độc của các loài rắn khác đều nhận thấy có phản ứng chéo xảy ra ở các mức độ khác nhau [22], [113]. Một công trình nghiên cứu khác được công bố vào năm 2007 bởi Margaret và cộng sự đã chứng minh được rằng phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu do CSL của Úc sản xuất với một số nọc rắn khác là phản ứng chéo thực sự chứ không phải phản ứng chéo có được do sự phối trộn nhiều kháng thể đặc hiệu loài rắn khác nhau [83]. Geoffrey và cộng sự (2010) cũng đã chứng minh được rằng phản ứng chéo xảy ra giữa huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu loài này với kháng nguyên thuộc các loài rắn cùng họ mạnh hơn so với kháng nguyên thuộc loài rắn khác họ [51]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh với kháng nguyên nọc rắn chàm quạp (hai loài rắn thuộc họ rắn lục) mạnh hơn phản ứng chéo giữa huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh với kháng nguyên nọc rắn hổ đất (một loài rắn lục và một loài rắn hổ). Các công trình nghiên cứu khác được công bố năm bởi Maria và cộng sự (2010) ; Choo Hock Tan và cộng sự (2011) và gần đây nhất bởi Alvaro Segura (2012) đều khẳng định rằng sử dụng kháng nguyên nọc rắn độc toàn thể gây miễn dịch sẽ tạo ra sản phầm huyết thanh kháng nọc rắn có phản ứng chéo với các nọc rắn khác loài ở các mức độ khác nhau [36], [85], [104]. Như vậy, để có được kháng thể đặc hiệu loài rắn dùng làm nguyên liệu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA thì cần phải tinh
chế kháng thể để loại bỏ các thành phần kháng thể phản ứng chéo với kháng nguyên nọc rắn khác loài.
Một số tác giả cho rằng, sử dụng thành phần nọc độc đơn lẻ để gây miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn được cho là một giải pháp làm giảm phản ứng chéo. Tuy nhiên, theo Favoretto (2011) khi đánh giá hiệu quả điều biến miễn dịch của crotoxin lên khả năng đáp ứng tạo kháng thể IgG chuột kháng albumin huyết thanh ở người. Trong đó crotoxin là thành phần độc tố đơn lẻ phân lập được từ nọc độc của loài rắn Crotalus durissus terrificus thì thấy rằng, crotoxin có tác dụng ức chế đáp ứng tạo kháng thể IgG ở chuột kháng albumin huyết thanh người bằng cơ chế làm giảm số lượng tế bào lympho tham gia vào đáp ứng miễn dịch. Như vậy, việc sử dụng độc tố đơn thành phần làm kháng nguyên nhằm mục đích loại bỏ phản ứng chéo chưa hẳn đã có được đáp ứng tạo kháng thể tốt vì có thể xảy ra tác dụng ức chế quần thể tế bào lympho tham gia vào đáp ứng miễn dịch dịch thể như chất crotoxin [48].
4.1.1.3. Tinh chế kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn lục xanh, hổ đất,chàm quạp và hổ chúa chàm quạp và hổ chúa
Có nhiều phương pháp tinh chế kháng thể IgG với mức độ tinh khiết khác nhau như tinh chế bằng phương pháp tủa với amoniun sulphat, tinh chế bằng cột protein A/G, tinh chế bằng sắc ký ái lực miễn dịch [74], [92], [120]. Để có được kháng thể IgG thỏ đặc hiệu nọc rắn đủ số lượng và tính đặc hiệu loài cao, chúng tôi sử dụng phương pháp tinh chế 3 bước theo nội dung mô tả ở mục 2.2.3.
Trong đó, sắc ký ái lực với cột protein G là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng để tinh chế IgG thỏ từ huyết thanh thỏ kháng nọc rắn (làm giàu IgG). Kết quả trình bày ở hình 3.1 và 3.2 cho thấy hiệu quả phân tách IgG từ hỗn hợp protein có trong huyêt thanh thỏ bằng cột protein G rất tốt. Chúng tôi
không sử dụng cột protein A vì protein A có ái lực cao với IgG người, IgG chuột mà không có ái lực cao với IgG thỏ, trong khi đó protein G lại có ái lực cao với IgG thỏ [92]. Để có hiệu suất tinh chế cao, chúng tôi đã loại trừ khả năng gắn của protein G với một số protein trọng lượng phân tử lớn có trong huyết thanh của thỏ, bằng cách lọc huyết thanh thỏ toàn phần qua màng lọc có kích thước 0,2 µm trước khi cho huyết thanh thỏ chạy qua cột protein G.
Để có được IgG thỏ đặc hiệu loài rắn, chúng tôi đã sử dụng cột kháng nguyên nọc rắn đặc hiệu gắn shepharose trong hệ thống sắc ký ái lực miễn dịch. IgG thỏ sau khi tinh chế bước 1 bằng cột protein G được chạy qua cột kháng nguyên nọc rắn đặc hiệu để loại bỏ những phân thử IgG không đặc hiệu nọc rắn. Phương pháp này đã được Chavez-Olortegui (1996) và Ernesto Amuy (1997) sử dụng để tinh chế kháng thể đặc hiệu loài rắn [32], [46].
Các kháng thể đặc hiệu loài rắn thu được sau tinh chế bước 2 vẫn còn phản ứng chéo với nọc độc của một số loài rắn khác. Để loại bỏ các phân tử IgG thỏ phản ứng chéo, chúng tôi sử dụng cột kháng nguyên nọc rắn khác loài gắn shepharose trong hệ thống sắc ký ái lực miễn dịch. Sản phẩm IgG thỏ thu được sau tinh chế bước 3 có tính đặc hiệu loài rắn cao và không có phản ứng chéo với 3 loại nọc rắn độc khác còn lại ở nồng độ < 100 ng/ml (biểu đồ 3.4). Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp với kết quả của Lê Văn Đông và cộng sự (2003) [80].