ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.2.Xét nghiệm ELISA gián tiếp (indirect ELISA)
Kháng thể đặc hiệu nọc rắn có trong huyết thanh thỏ sau gây miễn dịch hoặc trong các chế phẩm kháng thể sau tinh chế được phát hiện bằng xét nghiệm ELISA gián tiếp (indirect ELISA) theo quy trình của Selvanayagam và CS (1999) [44].
Bước 1: Gắn kháng nguyên nọc rắn lên các phiến xét nghiệm:
Kháng nguyên (nọc rắn) được gắn bằng phương pháp hấp phụ thụ động lên các phiến xét nghiệm ELISA 16 giếng đáy phẳng (Nunc-ImmunoTM modules, 16 well strip flat bottom, MaxiSorpTM surface) do hãng Nunc (Đan Mạch) sản xuất. Nọc rắn (2 µg/ml) pha trong dung dịch gắn (coating buffer) pH = 9,6 được cho vào mỗi giếng của phiến xét nghiệm 100 µl, ủ qua đêm ở nhiệt độ 40C. Rửa sạch các giếng đã gắn kháng nguyên bằng dung dịch PBS- Tween, sau đó ủ với dung dịch BSA 1% trong 60 phút ở 37 0C để che phủ (block) các vị trí không gắn kháng nguyên. Loại bỏ BSA thừa bằng cách rửa lại 1 lần với dung dịch PBS-T.
Bước 2: Cho chứng âm và kháng thể kháng nọc rắn có trong huyết thanh thỏ: Huyết thanh thỏ lấy trước khi gây miễn dịch được dùng làm chứng âm. Huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch hoặc chế phẩm kháng thể sau tinh chế được pha loãng thành nhiều nồng độ giảm dần rồi cho vào mỗi giếng 100 µl và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Rửa loại bỏ các thành phần kháng thể không gắn vào giếng.
Bước 3: Cho cộng hợp HRP – kháng thể kháng IgG thỏ:
Cộng hợp HRP-kháng thể kháng IgG thỏ (Anti Rabbit IgG - HRP) được cho vào các giếng và ủ tiếp trong 30 phút. Rửa loại bỏ các cộng hợp HRP- kháng thể kháng IgG thỏ không gắn vào giếng.
Bước 4: Cho dung dịch cơ chất OPD:
Hoạt tính của enzyme trong mỗi giếng tương ứng với sự có mặt nhiều hay ít của kháng thể đặc hiệu trong giếng được phát hiện bằng cơ chất OPD (nồng độ 0,5 mg/ml, 100µl/giếng).
Bước 5: Đọc kết quả
Sự đổi mầu của cơ chất OPD từ không mầu sang mầu vàng thể hiện sự có mặt của kháng thể đặc hiệu trong các giếng. Mật độ quang học (OD) của các giếng được đo bằng máy đọc ELISA (Beckman Coulter, Hoa Kỳ) ở bước sóng 450 nm hoặc ở bước sóng 492 nm sau khi cho 50 µl dung dịch hãm (dung dịch H2SO4 nồng độ 2N) vào mỗi giếng. Giá trị OD của các giếng ELISA tỷ lệ thuận với lượng kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên nọc rắn đã được gắn vào các giếng ELISA.