H. 2-27 Phức hợp ATPase ty thể.
4.6 Sự liín kết hóa thẩm cho phĩp tính toân tỷ số tơng quan không nguyín của oxy tiíu thụ vă ATP tổng hợp.
nguyín của oxy tiíu thụ vă ATP tổng hợp.
Trớc khi chấp nhận mô hình hóa thẩm cho sự phosphoryl oxy hóa, giả định đê lă phơng trình tổng quât có thể có dạng:
Với giâ trị của x- đôi khi còn gọi lă tỷ số P/O (P/O ratio) hoặc tỷ lệ P/2e-
(P/2e- ratio) thờng lă số nguyín. Khi một ty thể còn nguyín vẹn cho văo trong một dung dịch có cơ chất có khả năng oxy hóa nh lă succinate hay NADH vă đê đợc cung cấp O2, sự tổng hợp ATP thì có thể đợc đo theo sự giảm O2.
Hình 2-29. Sự quay của F0 vă Gama đê đợc chứng minh.
F1 tạo ra năng lợng đợc chuyển văo sự chạy gốc His bâm chặt văo vật kính kính hiển vi (microscop slide) đợc bao bọc bởi Ni- complex. Biotin đợc liín kết đồng hóa trị văo tiểu đơn vị c của F0. Protein avidin liín kết với biotin rất chặt chẽ thì lại liín kết đồng hóa trị với một sợi actin dăi đê đợc đânh dấu bằng chất huỳnh quang. Biotin-avidin bđy giờ lại gắn văo sợi actin (actin filament) gắn văo tiểu đơn vị c. Khi ATP đợc cung cấp nh lă một cơ chất cho hoạt động của ATPase của F1, filament đợc đânh dấu huỳnh quang đợc trông thấy quay liín tục theo 1 hớng, chứng minh rằng hình trụ F0của tiểu đơn vị c quay.. Trong một thí nghiệm khâc, actin filament huỳnh quang đê đợc gắn trực tiếp văo tiểu đơn vị gama (trục), một loạt tiíu bản hiển vi huỳnh quang chỉ ra câc vị trí của actin filament với khoảng câch 133 ms. Có thể phỏng đoân trục vă hình trụ chuyển động nh một đơn vị.
Sự đo P/O2 thì phức tạp do yếu tố lă câc ty thể nguyín vẹn tiíu thụ ATP cho nhiều phản ứng xẩy ra trong ty thể vă tiíu thụ O2 những mục đích khâc so với sự phosphoryl oxy hóa. Hầu hết thí nghiệm thu đợc tỷ số P/O (ATP cho 1/2O2) giữa 2 vă 3 khi NADH lă chất cho điện tử vă 1-2 khi succinate lă chất cho điện tử.
Căn cứ văo sự thừa nhận rằng tỷ số P/O lă giâ trị nguyín, hầu hết câc thí nghiệm đê đồng ý P/O cần phải lă 3 cho NADH vă 2 cho succinate, qua nhiều
năm, số liệu năy đê xuất hiện trong câc công trình nghiín cứu vă sâch giâo khoa.
Với sự đem văo thuyết hóa thẩm về sự liín kết sự tổng hợp ATP với sự vận chuyển điện tử đê không có điều kiện giả định cho tỷ số P/O nguyín. Câc cđu hỏi thích đâng về stoichiometry trở thănh lă bao nhiíu proton đợc bơm ra phía ngoăi nhờ sự vận chuyển điện tử từ 1 NADH đến O2, vă bao nhiíu proton cần phải chảy hớng văo trong qua phức hợp F0F1 để điều khiển sự tổng hợp ATP? Sự đo dòng proton lă một kỷ thuật phức tạp, nhă nghiín cứu cần tính toân khả năng đệm của ty thể, sự thoât ra của proton qua măng trong, vă việc sử dụng gradient proton cho câc chức năng khâc so với tổng hợp ATP nh lă điều khiển sự vận chuyển cơ chất qua măng trong ty thể (mô tả sau). Giâ trị đợc nhất trí vế số proton đợc bơm qua măng cho một cặp điện tử lă 10 cho NADH vă 6 cho succinate. Giâ trị thực nghiệm đợc chấp nhận rộng rêi nhất về số proton đòi hỏi để vận chuyển để tổng hợp 1 ATP lă 4 trong số đó 1 đợc sử dụng để vận chuyển Pi, ATP, vă ADP qua măng ty thể (xem sau). Nếu 10 proton đợc bơm ra ngoăi cho một NADH, vă 4 cần phải chảy để tạo ra một ATP, tỷ số P/O lă 2,5 đối với NADH nh lă chất cho điện tử vă 1,5 (6/4) cho succinate. Chúng ta dùng giâ trị P/O lă 2,5 vă 1,5 qua tăi liệu năy, nhng giâ trị 3 vă 2 thì vẫn đợc sử dụng trong câc tăi liệu hóa sinh. Lời phân xĩt cuối cùng về tỷ lệ thức lợng có khả năng ch- a đợc viết ra cho đến khi chúng ta biết chi tiết đầy đủ về cơ chế phản ứng F0F1.
4.7Lực vận động proton sinh ra năng lợng cho vận chuyển tích cực.
Mặc dù vai trò đầu tiín của gradient proton trong ty thể lă cung cấp năng lợng cho tổng hợp ATP, lực vận động proton cũng điều khiển một văi quâ trình vận chuyển cơ bản đối với phosphoryl oxy hóa. Măng trong ty thể nói chung không thấm với câc phần tử tích điện, nhng có 2 hệ thống vận chuyển đặc biệt vận chuyển ADP trong matrix vă ATP ra ngoăi băo tơng.(H.2-30)
Adenine nucleotide translocalase, một protein qua măng trong ty thể, liín kết vơi ADP3- trong khoảng giữa măng trong ty thể (intermembrane space) vă vận chuyển nó văo matrix trao đổi với một phđn tử ATP4- đê đợc kích thích vận chuyển ra phía ngoăi. Vì rằng antiporter năy chuyển 4 điện tích đm ra ngoăi cho mỗi 3 điện tích đm đợc chuyển văo matrix, hoạt tính của nó thì đợc giúp đỡ thím nhờ gradient điện hóa qua măng, chúng lăm cho matrix mang điện tích đm. Lực vận chuyển proton điều khiển sự trao đổi ATP-ADP. Adenine nucleotide translocalase bị ức chế đặc hiệu bởi atractyloside, một glycoside độc đợc tạo thănh bởi câc loăi Thistle. Nếu sự vận chuyển của ADP thănh ATP ngoăi ty thể bị ức chế, ATP băo tơng không thể đợc tâi sinh từ ADP, điều đó giải thích tính độc của astractyloside.
H.2-30. Adenine nucleotide vă phosphate translocase. Hệ thống vận chuyển của măng trong ty thể mang ADP vă Pi văo matrix vă tổng hợp mới ATP trong băo tơng. Adenine nucleotide translocase lă một antiporter; câc protein giống nhau vận chuyển ADP văo trong matrix vă ATP ra ngoăi. Hiệu quả của sự chuyển chỗ ATP4-vă ADP3-lă hệ thống lă dòng câc điện tích đm, nó đợc kích thích bởi sự chính lệch điện tích qua măng trong (phía ngoăi dơng). ở pH 7, Pcos mặt nh la HPO42- vă H2PO4-; Phosphate translocalase thì đặc hiệu cho H2PO4-. Không có dòng điện tích trong khi symport của H2PO4- vă H+, nhng nồng độ proton tơng đối thấp trong ty thể kích thích sự vận động văo trong của H+. Nh thế lực vận động proton có nhiệm vụ cả cung cấp năng lợng cho tổng hợp ATP vă cho sự vận chuyển cơ chất (ADP vă Pi) cho việc sản xuất ATP ngoăi matrix ty thể. Cả 3 hệ thống vận chuyển có thể tâch ra nh một phức hợp bâm măng đơn(ATP synthasome).
Hệ thống vận chuyển thứ 2 cơ sở cho sự phosphoryl oxi hóa lă phosphate translocalase, chúng kích thích symport của một H3PO4- vă một H+ đi văo matrix. Quâ trình vận chuyển năy thì đợc xúc tiến nhờ bởi gradient proton qua măng (H.2-30). Ghi nhận rằng quâ trình đòi hỏi sự vđn động của 1 proton từ P side đến N side của măng trong ty thể, tiíu thụ một ít năng lợng của sự vận chuyển điện tử. Phức hợp ATP synthase vă cả 2 translocase, ATP synthasome, có thể đợc tâch khỏi ty thể nhờ phâ vở nhẹ nhăng bằng detergent, cho rằng câc chức năng của ba protein năy thì có liín quan chặt chẽ.