CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.3.8.3. Nuôi cấy E.coli biểu hiện MPI bằng hệ thống lên men tự động:
Hệ thống lên men tự động BioTron – LiFlusGX 05-08GX-05 là một loại bioreactor được ứng dụng để nuôi cấy nhiều loại tế bào khác nhau như: tế bào vi sinh vật, tế bào thực vật và tế bào động vật.
Hệ thống này có thể thực hiện các kiểu nuôi cấy như: nuôi cấy mẻ (batch culture), nuôi cấy liên tục (continuous culture) và nuôi cấy fed-batch dưới sự điều khiển của hệ vi xử lý, có thể kiểm soát và điều chỉnh các giá trị nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan… trong quá trình nuôi cấy.
Hình 3.12.Các bộ phận chính của hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX 05-08GX-08
Sơ lược một quy trình lên men mini-proinsulin trong môi trường lỏng hiếu khí- có khuấy trộn, có kiểm soát bao gồm các bước sau:
Chuẩn bị giống, môi trường và thiết bị lên men. Lên men.
Ly tâm thu dịch nuôi cấy.
Tinh sạch mini-proinsulin bằng điện di mao quản.
3.3.8.3.1. Chuẩn bị giống:
Giữ giống:
Đây là bước quan trọng trong hoạt động vận hành một hệ thống lên men. Giữ giống phải bảo đảm một số yêu cầu sau như: duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài (không xảy ra hiện tượng thoái hóa, không làm giảm khả năng tăng trưởng và năng lực sản xuất của giống) và không bị tạp nhiễm.
Cấy chuyền:
Bước này nhằm hoạt hóa giống sau thời gian cất giữ ở nhiệt độ thấp, trước khi đưa vào các bước nhân giống. Cấy chuyền thường được thực hiện trên môi trường thạch nghiêng, ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi sinh vật phát triển thành một lớp trên mặt thạch. Môi trường nuôi cấy trong giai đoạn này phải
bảo đảm các yếu dinh dưỡng cần thiết, điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ pH, độ thoáng khí phải đạt giá trị tối ưu cho chủng.
Nhân giống:
Mục đích của nhân giống là tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui trình sản xuất. Quá trình nhân giống thường dừng lại ở giai đoạn cuối của log phase, khi đó hoạt tính của giống là mạnh nhất. Quá trình nhân giống thường chia thành hai giai đoạn:
Nhân giống cấp 1:
Thường là thông qua hoạt động nuôi cấy lắc trong bình tam giác. Nhân giống cấp 1 với mục đích là tăng sinh khối và đánh giá chủng trước khi đưa vào thực tế sản xuất.
Nhân giống cấp 2:
Thực hiện trong nồi cấy mầm với thể tích bằng khoảng 1020% thể tích nồi lên men chính. Giai đoạn này cung cấp đầy đủ các điều kiện tối ưu nhất (thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuối cấy, pH, nhiệt độ, …) để tăng trưởng đạt µmax.
3.3.8.3.2. Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men
Thiết kế môi trường nuôi cấy:
Tùy theo chủng vi sinh vật và phương pháp lên men mà chọn môi trường nuôi cấy thích hợp. Viêc thiết kế thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật phải đảm bảo đủ lượng để phục vụ cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp năng lượng cho việc duy trì tế bào và sự sinh tổng hợp. Căn cứ vào thành phần và hàm lượng các chất trong tế bào mà thiết kế đủ thành phần và lượng cần thiết nhằm thu nhận được sinh khối theo yêu cầu và đảm bảo sản xuất.
Thành phần môi trường dùng nuôi cấy E.coli để sản xuất MPI theo kiểu lên men fed-batch: 1,5g (NH4)2SO4, 211g cao nấm men, 5g MgSO4.7H2O và 274g glucose.
Thanh trùng môi trường và thiết bị:
Mục đích của thanh trùng môi trường và thiết bị lên men là loại bỏ các yếu tố gây tạp nhiễm sinh học (như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, phage).
3.3.8.3.3. Lên men
Trong quá trình tiến hành nuôi cấyE.coliđể sản xuất MPI tái tổ hợp chúng ta cần kiểm soát chặt chẽ các thông số sau:
Kiểm soát tốc độ nạp liệu trong quá trình lên men:
Quá trình lên men sản xuất MPI tái tổ hợp được tiến hành theo kiểu lên men fed-batch do vậy kiểm soát tốc độ nạp liệu trong quá trình lên men là một trong
những vấn đề quan trọng. Tốc độ nạp liệu cần được kiểm soát sao cho hàm lượng dinh dưỡng của các chất trong môi trường lên men không quá thừa hoặc quá thiếu, đặc biệt là các cơ chất giới hạn và phải luôn bảo đảm một số yếu tố căn bản sau:
Chỉ nạp theo yêu cầu sử dụng của chủng, không nạp quá dẫn đến việc thiếu oxy cung cấp.
Không nạp thiếu làm hạn chế tốc độ tăng trưởng và tốc độ sản xuất của chủng.
Kiểm soát tăng trưởng tế bào:
Là hoạt động nhằm hạn chế sự tăng trưởng của chủng trong những giai đoạn cần thiết của quá trình. Trong thực tế, người ta thường sử dụng các phương pháp theo dõi tăng trưởng như đếm tế bào, phân tích trọng lượng tế bào khô (DCW) hay thông qua máy đo quang phổ (OD). Độ hấp thu của ánh sáng ở bước sóng 600nm (OD600) phản ánh mật độ tế bào vi khuẩn E.coli trong dịch lên men. Nếu mật độ tế bào vi khuẩnE.coli cao thì OD600 cao. Do đó có thể đo OD600để xác định mật độ tế bàoE.coli.
Kiểm soát tăng trưởng tế bào bằng cách: bổ sung các chất ức chế tăng trưởng (Tween 40, 60, penicilin), thay đổi yếu tố sinh lý (nhiệt độ), hạn chế hàm lượng cơ chất giới hạn.
Kiểm soát pH:
Vi sinh vật nói chung vàE.colinói riêng rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Khi tế bào sinh trưởng, những sản phẩm trao đổi chất được phóng thích vào môi trường, trong đó có những chất làm thay đổi pH của môi trường nuôi cấy. Do đó, pH của môi trường nuôi cấy phải được đo và điều chỉnh bằng cách thêm acid hoặc base để duy trì pH thích hợp nhằm bảo đảm pH sinh lý của tế bào trong quá trình phát triển và sinh tổng hợp các chất. Đối với lên men sản xuất protein tái tổ hợp sử dụng E.coli làm tế bào chủ, cần phải kiểm soát pH từ 7,0 0,2 và nồng độ acid acetic không được lớn hơn 0,9gL-1 . Tác nhân dùng để chỉnh pH là acid (H2SO4, HCl, …) hoặc base (NaOH, KOH, NH3, urea, …). Trong qui trình lên men MPI bằng hệ thống lên men tự động BioTron – LiFlusGX 05-08GX-05 thì giá trị pH được kiểm soát tự động. Hệ thống này bao gồm:
Điện cực đo pH (electrode) gắn trực tiếp vào bồn lên men trong quá trình nuôi cấy.
Hệ thống điều khiển (controller): cho phép cài đặt giá trị pH cần kiểm soát, hiển thị giá trị pH hiện tại ở trong bồn lên men, so sánh sự chênh lệch này và đưa tín hiệu điều khiển để mở hay đóng van nạp tác nhân (H+, OH-) hiệu chỉnh pH vào.
Van tự động (control valve): cho phép nạp hay ngắt tác nhân chỉnh pH vào bồn lên men.
Kiểm soát nhiệt độ:
Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật và hình thành sản phẩm.E.colicó nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở 37oC. Trong nuôi cấy cần đảm bảo nhiệt độ tối ưu của chủng, tuy nhiên trong từng giai đoạn, nhiệt độ có thể thay đổi trong giới hạn cho phép.
Trong thực tế, người ta thường dùng nước lạnh (5-27oC) để giải nhiệt. Thiết bị trao đổi nhiệt có thể là dạng ống đặt trong nồi lên men.
Kiểm soát hàm lượng oxy hoà tan trong môi trường lên men:
E.colilà vi khuẩn hiếu khí tùy tiện nhưng trong nuôi cấy E.coli để sản xuất MPI tái tổ hợp thì cần cung cấp oxy trong cả quá trình. Hàm lượng oxy cần được duy trì lớn hơn 30% không khí bão hoà. Oxy được cung cấp bằng cách khuấy trộn.
3.3.8.3.4. Ly tâm thu dịch nuôi cấy
Dịch sau nuôi cấy, tiến hành đem li tâm thu sinh khối, bỏ dịch nổi. Sinh khối sau li tâm được tinh sạch, thu mini-proinsulin bằng phương pháp điện di mao quản.