Tổng hợp gene mpi mã hoá cho MPI biểu hiện trong E.coli bằng phương pháp PCR:

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC

3.3.8.1.Tổng hợp gene mpi mã hoá cho MPI biểu hiện trong E.coli bằng phương pháp PCR:

Thông thường các gene của tế bàoEukaryote biểu hiện kém hiệu quả trong các hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn (Prokaryote). Một nguyên nhân gây ra sự biểu hiện kém này là do các codon trên bộ gene của tế bào Eukaryote không được “ưa thích” ở tế bào vi khuẩn. Do đó người ta thiết kế một gene tổng hợp được dùng để biểu hiện protein của Eukaryote có mang các codon được “ưa thích” ở Prokaryote. Điều này được thực hiện nhanh chóng bằng phương pháp PCR hai bước (two-step PCR). Trong phương pháp này, cần biết trước trình tự gene cần tổng hợp, tổng hợp các cặp mồi có trình tự tương ứng với gene cần tổng hợp và có khả năng bắt cặp với nhau trong khoảng 10-20 nucleotide (ở đây mồi cũng đồng thời là mạch khuôn cho sự khuếch đại). Hai phản ứng PCR được thực hiện liên tiếp, phản ứng thứ nhất tạo ra DNA bản mẫu đúng với gene cần tổng hợp mà sau đó được khuếch đại trong phản ứng thứ hai.

Trong trường hợp genempi, dựa vào trình tự gene insulin người được công bố trên ngân hàng gene (GeneBank NM_000207), bộ mã củaE. coli, các nhà khoa học đã thiết kế hai cặp mồi Ins1F/Ins2R và Ins3F/Ins4R. Phản ứng PCR thứ nhất được thực hiện riêng rẽ cho từng cặp mồi. Sản phẩm thu nhận của mỗi phản ứng được trộn chung với nhau theo tỉ lệ 1:1 để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR kế tiếp với cặp mồi Ins1F/Ins4R. Sản phẩm thu được của lần PCR thứ hai chính là genempi.

Hình 3.11.Sơ đồ minh họa việc tổng hợp gene mpi bằng phương pháp PCR hai bước Chú thích: 1 – Mồi Ins1F; 2 – Mồi Ins2R; 3 – Mồi Ins3F; 4 – Mồi Ins4R

 Phản ứng PCR1: dNTP (2mM mỗi loại) 10L  Đệm PCR (10X) 10L

 Mồi Ins1F/ Ins3F (100 pmol) 1L  Mồi Ins2R/ Ins4R (100 pmol) 1L  PfuDNA polymerase 2,5U

 Nước cất đủ 100L

Sản phẩm PCR thu được tương ứng với mỗi cặp mồi được đặt tên là SP12, SP34, được tinh chế qua cột GFX và được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR2.

 Phản ứng PCR2: dNTP (2mM mỗi loại) 10L  Đệm PCR (10X) 10L

 SP12 (100ng/L) 1L  SP34 (100ng/L) 1L  Mồi Ins1F (10 pmol) 2L  Mồi Ins4R (10 pmol) 2L  PfuDNA polymerase 2,5U  Nước cất đủ 100L

Sản phẩm thu được từ PCR2 chính là genempi, được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% và tinh chế giữ lại cho mục đích tạo dòng.