CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.3.8.2.Tạo plasmid tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào E.coli:
Plasmid pET 43.1.a có kích thước 7275bp bao gồm trình tự sao chép ori, gene kháng ampicillin, trình tự promoterT7 lac, gene lacIq, vùng MCS, được cung cấp từ công ty Novagene. Hệ thống pET là hệ thống tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp rất mạnh trongE.coli.
Một trong những chủngE.coliđược ứng dụng rộng rãi cho mục tiêu biểu hiện các protein tái tổ hợp là E.coli BL21. Tất cả các chủng E.Coli BL21 đều không có protease được mã hoá bởi gene lon và thiếu protease màng ngoài được mã hoá bởi gene ompT. Vì vậy, protein tái tổ hợp sẽ tồn tại bền vững trong tế bàoBL21so với những chủng chủ khác có những proteae này.
E.coli BL21(DE3) là chủng chủ E.coli BL21 có chứa thể tiềm tan của thực khuẩn thể DE3 (một chuyển thể của thực khuẩn thể) mang đoạn DNA chứa gene
lacI, promoter lacUV5 và gene mã hoá T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase được đặt dưới sự kiểm soát phiên mã của promoter lacUV5. Đây là một promoter được cảm ứng bởi lactose hoặc thio--D-galactosidase (IPTG). Do vậy, khi bổ dung IPTG vào môi trường nuôi cấy, gene mã hoá cho T7 RNA polymerase sẽ được hoạt hoá, T7 RNA polymerase tạo thành xúc tác việc phiên mã gene mục tiêu trên vector biểu hiện.
Chủng chủE. coli BL21(DE3) được dùng để biểu hiện gene trong plasmid pET 43.1.a cũng được cung cấp bởi Novagene.
Cắt plasmid pET 43.1.a bằng enzyme cắt EcoRV. Thu nhận plasmid DNA qua gel agarose 0,8% và tinh chế. Đoạn DNA của genempithu nhận ở trên được nối vào pET 43.1.a tạo plasmid tái tổ hợp đặt tên pET43Ins. Điện biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bàoE. coli BL21(DE3).
Khi đoạn gene mã hoá cho MPI được chèn vào vùng MCS của vector pET 43.1.a thì sự biểu hiện cho gene mã hoá cho MPI chịu sự kiểm soát của T7 promoter. Promotor này sẽ hoạt động khi T7 RNA polymerase của tế bào chủ
E.coliBL21(DE3) bám vào. Trên các vector pET 43.1.a cũng chứa gene lacI
mã hoá cho một protein ức chế gắn vào vùng operatorlac trên promotor T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Protein MPI sẽ được biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.