Để thực hiện bất cứ quá trình tách thu nhận chế phẩm nào thì việc nghiên cứu việc tinh sạch ở mức độ phân tích luôn là bước đầu tiên, nó dùng để tối ưu hóa quá trình tách thu nhận chế phẩm.
Dù protein được tạo bằng phương pháp nào thì nó cũng có lẫn tạp chất. Muốn sản phẩm có hàm lượng protein cao, ta phải trải qua quá trình tinh sạch.
Ta có thể chia làm 2 mức độ tinh sạch:
Mức độ phân tích (analytical level): dùng để phân tích định tính, định lượng các cấu tử trong mẫu.
Mức độ tách chế phẩm (preparative level): dùng để tách, làm sạch và thu nhận các cấu tử.
Hầu hết việc tinh sạch protein hay peptide liên quan tới rất nhiều giai đoạn. Đầu tiên, thông thường người ta sẽ tách chọn lọc bằng phương pháp kết tủa, siêu lọc, sắc ký hoặc trích ly pha rắn để có được một hỗn hợp (giàu protein mong muốn hơn ban đầu). Hỗn hợp này sau đó sẽ tiếp tục được tinh sạch ở mức độ cao hơn (thường sử dụng phương pháp RP-HPLC) để có được protein mong muốn.
4.1. XỬ LÝ SƠ BỘ ĐỂ LÀM TĂNG NỒNG ĐỘ PROTEIN MONG MUỐN:
Từ hỗn hợp protein ban đầu không thể tách lấy ngay một protein cụ thể nào đó mà cần phải qua vài bước xử lý ban đầu để làm tăng dần nồng độ protein mong muốn, hay làm giảm lượng tạp chất.
Kết tủa: việc kết tủa các peptide lớn và protein được thực hiện với dung môi hữu cơ (methanol, ethanol hay acetone) hoặc acid (trichloroacetic acid), hoặc muối nồng độ cao (ví dụ ammonium sulphate, muối này có thể kết tủa được nhiều protein mà không là ảnh hưởng đến hoạt tính của chúng), hoặc bởi điều chỉnh pH đến điểm đẳng điện. Phương pháp này đơn giản và hiệu quả, tuy nhiên nó sẽ gặp nhiều khó khăn đối với những peptide khó kết tủa (những peptide nhỏ từ pentapeptide trở xuống)
Phương pháp siêu lọc: dùng những màng lọc có lỗ lọc rất nhỏ, có thể dùng làm tăng nồng độ dung dịch peptide và protein, khó có khả năng tách 1 peptide hay 1 protein cụ thể nào đó.
Phương pháp sắc ký bản mỏng (Thin-Layer Chromatography): là kỹ thuật tách peptide đơn giản nhất, nó thường được nối tiếp bằng phương pháp điện di.
Trong trường hợp có nhiều tạp chất trong hỗn hợp thì nó cần phải được xử lý thêm.
Sắc ký trao đổi ion (Ion-Exchange Chromatography: IEC): thường dùng để tinh sạch protein. Có thể coi đây là 1 dạng đặc biệt của sắc ký hấp phụ mà trong đó các cấu tử mẫu mang điện có khả năng tương tác tĩnh điện 1 cách thuận nghịch với pha tĩnh là các hạt nhựa mang điện trái dấu, còn pha động là các dung dịch điện ly. Lực liên kết phụ thuộc vào bán kính ion và mật độ ion của pha tĩnh (số điện tích trên 1 đơn vị thể tích phân tử). Phương pháp này có tiềm năng trong việc ứng dụng ở quy mô lớn.
Trong trường hợp muốn cóù dung dịch của protein nội bào thì trước tiên tế bào phải được phá vỡ để làm thoát dịch bên trong. Những phần không tan, bao gồm cả membrane, có thể được loại bỏ bằng quá trình ly tâm hoặc bằng các phương pháp khác. Protein hòa tan có thể được tách ra và tinh sạch từ dung dịch thô này. Quá trình giải lấy những protein liên kết với membrane đôi khi có thể thực hiện bằng các chất tẩy rửa.
4.2. TINH SẠCH PROTEIN:
Sau khi xử lý sơ bộ, hỗn hợp ban đầu sẽ được xử lý thêm để có được protein mong muốn. Một số phương pháp thường sử dụng:
Sắc ký lỏng cao áp pha đảo (Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatography: RP-HPLC): là phương pháp thông dụng nhất để tách và tinh sạch protein, thuộc loại sắc ký cột có pha động là chất lỏng. Hiệu quả phân tích cao của HPLC đạt được là do vật liệu nhồi cột có kích thước hạt rất bé (5-10 m) và độ đồng nhất cao làm tăng đáng kể số đĩa lý thuyết. Việc sử dụng bơm cao áp duy trì áp suất cao ở đầu cột nhằm điều chỉnh và ổn định vận tốc dòng, tăng tốc quá trình phân tích. RP-HPLC dùng pha tĩnh kém phân cực hơn pha động. Khi đó các dung môi sử dụng là dung môi phân cực, thường ít độc hại hơn, rẻ hơn và không gây ô nhiễm môi trường.
Sắc ký lỏng cao áp pha thuận (Normal-Phase HPLC):tương tự trên, nhưng pha tĩnh phân cực hơn pha động. Thường dùng để tách các protein ưa nước.
Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography: AC): phương pháp này dựa trên khả năng giữ protein bằng những chất nền không hòa tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.
Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE): hiện nay được sử dụng rộng rãi để tách protein.
Xét về mặt lý thuyết, tất cả các phương pháp điện di (CE, ITP- Isotachophoresis: điện di đẳng tốc, IEF-Isoelectric Focusing: điện di đẳng điện), đều có thể được tiến hành với cột mao quản, trên cùng 1 loại thiết bị điện di. Hiện nay phương pháp điện di mao quản được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis- CZE). Khi áp đặt điện áp, hai hoạt động điện động sẽ xảy ra dưới tác động của điện trường, đó là sự điện di và sự điện thẩm (Electroosmotic Flow-EOF: sự di chuyển của 1 lớp chất lỏng có điện tích dưới tác dụng của điện trường).
Chịu tác động đồng thời của quá trình điện di và điện thẩm, các phần tử trong mẫu mang điện tích dương, điện tích âm hoặc trung hòa về điện sẽ di chuyển về phía catode với vận tốc khác nhau. Các phần tử mang điện tích dương sẽ đến catode nhanh nhất, hay nói cách khác, peak của các cation trên điện di đồ sẽ xuất hiện trước EOF. Các anion có linh độ điện di nhỏ hơn EOF sẽ ra sau EOF và các anion có linh độ điện di lớn hơn EOF sẽ không phát hiện được vì di chuyển về phía anode. Các phần tử trung hòa về điện sẽ đi cùng với EOF và xuất hiện trên điện di đồ ở cùng vị trí của EOF.
Lượng mẫu được sử dụng khi tách thường rất nhỏ (dưới 20nL), do đó sẽ rất khó khăn nếu muốn phát hiện những thành phần có tỉ lệ nhỏ trong 1 hỗn hợp phức tạp, chính vì vậy, trước khi phân tích ta cần phải làm giàu thành phần cần phân tích trong mẫu (bằng các phương pháp xử lý sơ bộ ở phần 4.1).
Sắc ký rây phân tử (Size-Exclusion Chromatography: SEC): là phương pháp tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của các chất. Việc tách một protein cụ thể không thể thực hiện bằng phương pháp này, nó chỉ cho ta một nhóm các protein có kích thước phân tử gần nhau.
Người ta cho dung dịch phân tích đi qua các vật liệu có khả năng tạo thành bộ khung gel hoặc các rây phân tử. Pha tĩnh trong sắc ký gel là dung môi ở trong các lỗ của gel, còn pha động cũng chính là dung môi chạy qua. Nói cách khác, pha tĩnh và pha động trong sắc ký gel được cấu tạo từ 1 chất hay từ 1 hỗn hợp các chất.
Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ gel không hấp phụ lên gel mà chỉ khuếch tán vào các khe hở giữa các hạt rắn xốp, còn các phân tử có kích thước bé hơn có thể đi xuyên vào các lỗ của gel vào sâu bên trong. Khi pha động đi ngang qua, các phân tử sẽ được rửa giải ra khỏi gel theo thứ tự khác nhau. Các phân tử có kích thước lớn hơn lỗ gel sẽ theo pha động đi ra đầu tiên, các phân tử có kích thước
bé nhất sẽ đi ra sau cùng. Đối với các phân tử có cấu trúc không gian gần giống nhau, thứ tự rửa giải sẽ giảm theo chiều giảm trọng lượng phân tử.
4.3. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TINH SẠCH:
Sau khi tinh sạch thì cần phải kiểm chứng về mức độ đồng nhất (homogeneity) và những tính chất về cấu trúc (structural characterization) để có được sản phẩm theo yêu cầu. Có nhiều phương pháp phân tích được sử dụng.
Hình 4.1. Mối liên hệ giữa các phương pháp phân tích
Hình trên cho ta thấy mối liên hệ giữa các phương pháp phân tích. Các phương pháp phân tích amino acid (amino acid analysis) thích hợp để phân tích cấu trúc hóa trị của phân tử; trong khi đó phương pháp phân tích thứ tự (sequence analysis) cho phép đánh giá cả mức độ đồng nhất lẫn cấu trúc phân tử. Phương pháp khối phổ (mass spectrometry) cũng là một phương pháp quan trọng để phân tích protein. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân(nuclear magnetic resonance- NMR) là một trong những phương pháp chính để phân tích cấu trúc của protein trong dung dịch. Phương pháp quang phổ tử ngoại (ultraviolet spectroscopy) thường dùng để phân tích amino acid có chứa vòng thơm, đồng thời cũng là công cụ để đánh giá, kiểm soát việc tinh sạch protein. Tuy nhiên những thông tin về các liên kết hóa trị của protein thì vẫn còn nhiều hạn chế.
Kết quả đánh giá định lượng quá trình tinh sạch protein được gọi là “hoạt tính”. Thuật ngữ này thường được sử dụng cho enzyme. Sự phân tích enzyme dựa trên những phản ứng xúc tác đặc hiệu của enzyme, trong khi đó, protein thì dựa trên những tính chất vật lý của nó, ví dụ dựa trên cộng tố có khả năng sinh màu cao (highly chromogenic cofactor) ta có thể biết được thông qua phương pháp quang phổ. Hoạt tính riêng là thước đo cho mức độ tinh sạch, nó được định nghĩa là tỉ số giữa lượng protein thể hiện hoạt tính trong dung dịch so với tổng số protein trong dung dịch. Hoạt tính riêng gia tăng trong quá trình tinh sạch do ta đã loại bỏ những
protein khác không có hoạt tính này. Một protein hoàn toàn tinh sạch nếu nó thể hiện hoạt tính riêng của protein ấy cao nhất.
CHƯƠNG 5 : XỬ LÝ VÀ TỒN TRỮPROTEIN Y SINH HỌC