CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.3.2.Vector chuyển gene:
Vector chuyển gene là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gene cần chuyển. Các vector chuyển gene phải thoả mãn yêu cầu tối thiểu:
Có các trình tự khởi sự sao chép (ori) để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập. Có các trình tự nhận biết (palindrome), nơi mà các restriction endonuclease
nhận biết để cắt hở làm chỗ ráp đoạn gene lạ vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm xuất phát sao chép để tránh bị cắt nhầm.
Các trình tự điều hoà (promoter) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gene lạ.
Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp ở dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
Có các gene đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc các gene lạ gắn vào.
Ngoài ra chúng còn phải có những đặc tính bổ sung khác để cho việc tạo dòng dễ thực hiện:
Chứa các gene làm vô hiệu hoá đoạn DNA không mong muốn bị gắn vào. Có nhiều bản sao để tách được ra khỏi tế bào với số lượng lớn và đảm bảo sự
khuếch đại của gene gắn vào.
Có các trình tự nucleotide cần thiết cho sự biểu hiện của gene như promoter, trình tự gắn với ribosome để dịch mã (ribosome binding site).
Giá trị của các vector chuyển gene ở chỗ nó được cấu tạo như thế nào để thuận tiện cho mục đích sử dụng. Không có vector toàn năng cho chuyển gene mà cần có sự lựa chọn tùy đối tượng, tùy kích thước đoạn gene được tạo dòng. Chúng được cấu tạo với nhiều tính chất chuyên biệt để mang được các trình tự nucleotide như mong muốn.
3.3.2.1. Plasmid:
Ở các sinh vật Prokaryotae, các vector thường sử dụng là các vector của vi khuẩn và bacteriophage. Đây là vector chuyển gene đầu tiên được sử dụng, có thể chứa đoạn DNA lạ có chiều dài khoảng 3-10 kb. Chúng được cải biến để ngày càng thuận tiện hơn cho kĩ thuật tái tổ hợp DNA.
Thế hệ đầu tiên là các plasmid tự nhiên hầu như không còn sử dụng nữa. Thế hệ thứ hai là các plasmid được cấu tạo phức tạp hơn, được sử dụng rộng rãi nhất là pBR322, bắt nguồn từ một plasmid nhỏ ColE1. Nó được cấu tạo từ nhiều đoạn của các plasmid khác nhau để vừa có được các gene kháng thuốc vừa có các điểm nhận biết đặc hiệu cho các enzyme restriction endonuclease như EcoRI, HindIII, BamHI... Plasmid này có khả năng sao chép độc lập với tế bào E.colivà tồn tại với số lượng trung bình 20-30 bản sao cho mỗi tế bào. Trong những điều kiện nuôi cấy nhất định có thể khuếch đại có chọn lọc làm tăng số plasmid đến hơn 1000 bản sao cho một tế bào.
Thế hệ thứ ba là các plasmid đa năng và chuyên dụng (polycloning plasmid). Để tiện cho việc sử dụng nhiều loại restriction endonulease khác nhau, cả chục trình tự nhận biết của chúng được xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinkers. Một số plasmid thông dụng thuộc loại này như họ pUC, họ Gemini.
3.3.2.2. Phage:
Các phage, virus của vi khuẩn cũng được dùng làm vector chuyển gene vì nhiều phage có khả năng tải nạp mang gene từ tế bào cho sang tế bào nhận. Vector phageđược sử dụng rộng rãi để lập ngân hàng gene vì nó mang được đoạn gene lớn hơn plasmid (15-23 kb), dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích. Ưu điểm nổi bật của các phage là chúng có hệ thống tự động xâm nhập và sinh sản trong tế bào vi khuẩn với hiệu quả cao hơn nhiều so với việc đưa plasmid vào tế bào bằng cách biến nạp. Tuy nhiên thao tác ban đầu phức tạp hơn.