CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT PROTEIN Y SINH HỌC
3.3.7.2.Sự biểu hiện của gene được tạo dòng:
Muốn gene tạo dòng có biểu hiện tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã, gọi là vector biểu hiện.
Mục đích của việc tạo dòng các gene của động vật có vú, nhất là của người, là tạo ra sản phẩm giống như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện các gene sinh vật nhân chuẩnEukaryotaetrong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải tìm các yếu tố cho gene biểu hiện tối đa như:
Số lượng hợp lý các bản sao của vector plasmid đối với một tế bào. Chọn promoter mạnh để phiên mã tốt.
Có trình tự tạo điểm bám vào ribosome và DNA phụ cho dịch mã tốt. Chọn lựa các codon tốt cho dịch mã trong gene được tạo dòng.
DNA tái tổ hợp có sự ổn định lâu dài.
Tránh sự thuỷ giải protein do các enzyme của tế bào.
3.3.8. Ví dụ:
Năm 1982, insulin người sản xuất từ phương pháp tái tổ hợp đã được thương mại hóa bởi tập đoàn Eli Lilly. Phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng hai hệ thống biểu hiện Escherichia coli, tinh sạch rồi trộn hai chuỗi với nhau in vitro tạo cầu nối disulfide nhờ các dẫn xuất của S-sulfonate để hình thành insulin có hoạt tính. Ưu điểm của phương pháp này là không phải sử dụng các enzyme đắt tiền để loại bỏ đoạn peptide C nhưng nhược điểm là hiệu suất thấp, độ chính xác của quá trình tạo cấu nối S-S không cao, còn lẫn dạng insulin gấp cuộn không chính xác, gây đáp ứng miễn dịch đặc biệt nghiêm trọng cho bệnh nhân khi sử dụng. Do đó, Eli Lilly phát triển một phương pháp khác cải tiến hơn, biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện hai chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfide in vitro, sau đó phân cắt đoạn peptide C khỏi hai đoạn A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin.
Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, biểu hiện mini-proinsulin bao gồm chuỗi A và chuỗi B nối với nhau bằng 2 amino acid, được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lí mini-proinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfide được hình thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết mini-proinsulin, mini-proinsulin này được chiết tách và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy.
Hiện tại, người ta vẫn tiếp tục phát triển những phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp. Công ty Hoechst đã đưa ra một phương pháp sản xuất insulin bao gồm:
biểu hiện một dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu hiện preproinsulin trong
E.coli; tạo cầu nối disulfide in vitro; sau đó xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc clostripain/carboxypeptidase; cuối cùng tạo ra insulin.
Gần đây, công ty Bio-Technology Geneeral đã đưa ra một phương pháp mới. Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bào E.coli. Bằng cách này, hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả của quá trình hình thành các cầu nối được cao hơn. Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase. Bằng những cách tương tự như thế, người ta đã đưa ra ngày càng nhiều các phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp và cải tiến nhiều hơn để nâng cao hiệu quả của quá trình biểu hiện protein, hình thành cầu nối disulfide, chuyển proinsulin thành insulin [20].
Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển một hệ thống biểu hiện và một phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao, hiệu quả sản xuất phải ngang bằng hay vượt trội so với những hệ thống sản xuất insulin trước đây. Các nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu ra môi trường tối ưu cho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm ra hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất cao, sản lượng cao.
Sau đây xin giới thiệu phương pháp nuôi cấy Escherichia coli để tổng hợp mini-proinsulin (MPI) bằng hệ thống lên men tự động [14,15,16].
Mini-proinsulin (MPI) có cấu trúc tương tự với proinsulin, chỉ khác là thay thế đoạn peptide C tự nhiên của proinsulin gồm 31 amino acid bằng một đoạn peptide ngắn hơn (9 amino acid), giúp dễ dàng cho việc tinh chế và gia tăng hiệu quả gấp cuộn dẫn đến tăng hiệu suất hình thành insulin có hoạt tính hơn mô hình proinsulin.
Đoạn peptide C trong MPI là một trình tự 9 amino acid bao gồm Arg-Arg, một trình tự mini: Tyr-Pro-Gly-Asp-Val và Lys-Arg. Trong đó trình tự mini sẽ tạo nên cấu trúc -turn nằm giữa 2 vị trí amino acid Arg-Arg và Lys-Arg, được nhận diện và phân cắt bởi trypsin cùng carboxypeptidase. Cấu trúc -turn sẽ “gấp đôi” cấu trúc MPI giúp cho hai chuỗi A và B được tiếp xúc với nhau tốt hơn nên việc hình thành các cầu nối disulfide cũng sẽ chính xác hơn.